This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla struttura alloggiativa animale Valladolid University in accordo con la Convenzione europea 123 / Consiglio d&#39;Europa e la direttiva 86/609 / CEE. 1. Breve e Lungo Periodo Cultura di ratto neuroni dell&#39;ippocampo <ol><li> Preparazione di poli-D-lisina rivestito, 12 coprioggetto mm vetro. <ol><li> Sterilizzare 12 mm di diametro vetrini in etanolo per almeno 24 ore. Lasciarli asciugare in condizioni sterili. </li><li> Distribuire i coprioggetti su una striscia di parafilm in una capsula di Petri. Coprire la superficie di ogni coprioggetto con 200 ml di 1 mg / ml di poli-D-lisina. Consenti il ​​trattamento O / N. </li><li> Il giorno dopo, lavare i coprioggetti con doppio acqua sterile distillata ogni 15 minuti per 90 minuti in condizioni di sterilità. </li><li> Riempire un piatto a quattro ben multidish con 500 ml di Neurobasal cultura medio per pozzetto. Neurobasal cultura medio dovrebbe essere integrata conSiero fetale bovino 10%, 2% B27, 1 mg / ml di gentamicina e 2 mM L-glutammina. </li><li> Mettere i coprioggetti nella piastra multidish. Mantenerli in un umidificata 37 ° C e 5% di CO 2 incubatore fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Isolamento di neuroni dell&#39;ippocampo di ratti neonati. <ol><li> Preparare 1,8 ml di soluzione di papaina (direttamente acquistato) in un flaconcino (20 ml / ml) in condizioni sterili: Per ottenere una concentrazione finale di 20 ml / ml aggiungere circa 40 microlitri papaina in 1,8 ml di Hank di più il 0,6% di BSA (ml devono essere calcolate a seconda delle condizioni del fornitore). Hank 0,6% BSA viene preparato miscelando 85 ml di HBSS media con 15 ml di albumina sierica bovina 4% (BSA, preparata risolvendo 4 g di BSA in 100 ml HBSS). Preparare in una cappa sterile. </li><li> Incubare la papaina in Hank più 0,6% BSA per 30 min a 37 ° C prima dell&#39;uso. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare F-12 di media di Ham con l&#39;aggiunta di DulbeccoModificato Media polvere dell&#39;Aquila (13,5 g per l) in 900 ml di acqua distillata sterile doppio. Quindi aggiungere 6 g HEPES e 336 mg NaHCO3 e regolare il pH a 7,42 con NaOH 4 N. Aggiungere acqua sterile per ottenere una soluzione 1 L e filtrata utilizzando un polietersulfone 0.20 micron (PES) bottiglia filtro superiore. Portare questo processo in una cappa sterile. Infine saturare la soluzione con CO 2 in condizioni sterili prima dell&#39;uso. Soluzioni Conservare a 4 ° C e usarli refrigerata. </li><li> Eutanasia neonato (P0) cuccioli di ratto per decapitazione e lavare la testa in sterili medio HBS. Aprire il cranio con l&#39;aiuto di forbici sterili. Estrarre il cervello con una spatola e lavare rapidamente in F-12 di media di Ham. </li><li> Effettuare un taglio diagonale con l&#39;aiuto di un bisturi in ciascun emisfero (Figura 1B), e portarlo ad una piastra di Petri contenente F-12 di Ham medie. </li><li> Meningi Scartare con attenzione con l&#39;aiuto di pinze dissezione e sotto una lente di ingrandimento. </li> &lt;li&gt; Identificare l&#39;ippocampo in un luogo caratteristico concava sulla corteccia con lente di ingrandimento. Poi, separare l&#39;ippocampo dalla corteccia tirando con attenzione di una frontiera e la rimozione dalla sua posizione con le forbici occhi. </li><li> Trasferire il tessuto dell&#39;ippocampo ad una piastra di 4 ben riempita con mezzo sterile di Hank priva di Ca 2+ e Mg 2+ più dello 0,6% di BSA e lavare il tessuto dell&#39;ippocampo. Senza rimuovere i mezzi di taglio del tessuto in piccoli pezzi (circa 2 x 2 mm) utilizzando le stesse forbici occhio. </li><li> Trasferimento pezzi di ippocampo di un flaconcino contenente 1,8 ml di soluzione di papaina pre-filtrata. Poi li incubare a 37 ° C, con occasionale, agitando delicatamente. 15 minuti più tardi, aggiungere 90 ml di soluzione di DNasi I (50 mg / ml finale) e incubare per 15 minuti supplementari. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga da 10 ml e lavare i frammenti con fresco Neurobasal Cultura Media. Ottenere sospensione cellulare passando frammenti di tessuto attraverso una plastica pip 5 mlette. </li><li> Sospensione cellulare a 160 xg Centrifugare per 5 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica sterile e sospendere accuratamente pellet con 1 ml automatizzati pipetta in 1 ml di terreno di coltura Neurobasal. </li><li> Misurare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio Neubauer. Mettere il vetrino di vetro sopra la camera di Neubauer. Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare. Assicurarsi che la sospensione cellulare entra in modo uniforme e senza fare bolle camera. Contare il numero di cellule al microscopio ed eseguire calcoli corrispondenti per ottenere una goccia adatto di 40-80 ml ​​contenente 30 x 10 3 cellule. Il numero totale di cellule dipenderà dal numero di animali utilizzati. </li></ol></li><li> A breve termine e la cultura a lungo termine dei neuroni dell&#39;ippocampo di ratto. <ol><li> Sul piatto quattro ben multidish contenente 500 ml di Neurobasal cultura medio preparato prima e conservati in incubatrice, piastra di circa 30 x 10 3 cellule in una goccia di circa 50 microlitri per ognipozzetto della piastra multidish contenente un poli-D-lisina rivestite, 12 mm coprioggetto di vetro di diametro. </li><li> Mantenere cellule dell&#39;ippocampo primarie in un umidificata 37 ° C e 5% di CO 2 incubatore per 2-5 giorni in vitro (DIV, a breve termine, i giovani culture) o&gt; 15 DIV (a lungo termine, di età compresa tra culture) prima di esperimenti senza cambiare la cultura media. </li></ol></li></ol> 2. imaging di fluorescenza della Ca citosolico 2 + Concentrazione <ol><li> Preparazione delle soluzioni di prova per l&#39;imaging di fluorescenza. <ol><li> Preparare una soluzione esterna salina HEPES-buffered (HBS) contenente, in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, il glucosio 10, sodio-HEPES 10 (pH 7.42). </li><li> Preparare una soluzione esterna, Mg 2 + -free, salino HEPES-buffered (HBS) contenente, in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, il glucosio 10 e HEPES 10 (pH 7.42). </li><li> Risolvere salina NMDA in Mg 2 + -free, HEPES-buffered (HBS) ad una finaconcentrazione l di 100 micron e integrare con 10 mM glicina. </li><li> Preparare una soluzione contenente KCl HBS invece di NaCl risolvendo (in mM): 145 KCl, MgCl 2 1, CaCl 2 1, glucosio 10 e 10 HEPES (pH 7.42). </li></ol></li><li> Caricamento di cellule dell&#39;ippocampo con sonda fluorescente calcio fura2 / AM. <ol><li> Prendere la coltura cellulare contenente lamelle via l&#39;incubatore e lavarli con HBS media a temperatura ambiente per il conferimento ad una nuova piastra multidish quattro pozzetti contenenti 500 ml di HBS per pozzetto. </li><li> Incubare le cellule con fura2 / AM 4 micron (preparati nello stesso mezzo HBS) per 60 minuti a temperatura ambiente (25 ° C) in un luogo buio. </li><li> Dopo 60 minuti, lavare coprioggetto con fresco medio HBS. </li></ol></li><li> Registrazione di immagini di fluorescenza di citosolico [Ca 2+] in cellule in coltura. <ol><li> Accendere la lampada, microscopio, sistema di perfusione, fotocamera fluorescenza e computer. </li><li> Mettere i coprioggetti in una piattaforma per termostatatoaperto 12 coprioggetto mm di vetro sul palco del microscopio invertito e selezionare un campo microscopico utilizzando un obiettivo 40X (olio, NA: 1.3). Profumato cellule continuamente con pre-riscaldato (37 ° C) HBS medie assenza o presenza di sostanze di prova. Mantenere il flusso ad una velocità di circa 5-10 ml / min. Nota: sistema di perfusione delle cellule per cellule viventi è montato in una piattaforma per termostatato aperta 12 coprioggetto mm vetro. 8 linee di sistema perfusione gravità-driven dotati di posizionatore viene utilizzato per perfusione soluzioni. Pompa da vuoto è responsabile per la rimozione di ogni eccesso. Le soluzioni vengono riscaldati mediante un sistema di riscaldamento a tubo. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di sfondo con l&#39;otturatore chiuso ad entrambe le lunghezze d&#39;onda di eccitazione. </li><li> Epi-illuminare le cellule alternativamente a 340 e 380 nm. Luce Record emessa a 520 nm ogni 5-10 sec con una telecamera a fluorescenza, che viene filtrato da un specchio dicroico fura-2. </li><li> Quando il periodo di registrazione è terminata, memorizzare la sequenza completa oimmagini f emessi a 520 nm nel computer per ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Analisi di immagini fluorescenti registrate. <ol><li> Aprire il file esperimento. Utilizzando il software aquacosmos, clicca su &#39;Rapporto&#39; e selezionare l&#39;intervallo rapporto desiderato. Calcolare il rapporto di pixel per pixel nelle immagini risultanti per ottenere una sequenza di immagini di rapporto. </li><li> Sottrarre sfondo regolando l&#39;&#39;eliminazione sfondo&#39;. Premere &#39;calcolo start&#39;. </li><li> Premere &#39;ogni momento sequenza&#39; pulsante e cancellare le antiche regioni di interesse (ROI). Per l&#39;analisi quantitativa delle singole cellule, stabilire nuove regioni di interesse o ROI corrispondenti ai singoli neuroni. Media tutti i valori del rapporto di ciascun pixel corrispondenti a ciascun ROI e ogni immagine per ottenere una registrazione di valori di fluorescenza di rapporto per i singoli ROI (celle). </li><li> Per rappresentare graficamente le singole registrazioni esportare i valori di rapporto di fluorescenza corrispondenti ad ogni ROI un progr graficaam. </li><li> Effettuare i calcoli corrispondenti per stimare la dimensione degli aumenti in rapporto fluorescenze in risposta a ciascuna stimolazione utilizzando un&#39;analisi dei dati adatto e grafici software. </li></ol></li></ol> 3. bioluminescenza Imaging di mitocondriale Ca 2+ Concentrazione <ol><li> La trasfezione di neuroni dell&#39;ippocampo in coltura con il plasmide mitGAmut. NOTA: Le cellule vengono prima trasfettate con il plasmide mitGAmut contenente una sequenza mitocondri mirati e un aequorina mutata priva di un sito di legame di Ca 2+ fusa alla proteina verde fluorescente (GFP). Questa costruzione rileva grandi aumenti in mitocondriale Ca 2+ assorbimento e permette l&#39;identificazione di cellule trasfettate da fluorescenza GFP. Il plasmide è stato sviluppato e gentilmente fornito da P. Brulet e collaboratori 18 (CNRS, Parigi). <ol><li> Preparare Neurobasal TF, contenente Neurobasal Cultura Media, privo siero fetale bovino, B27, gentamice 2 mM L-glutammina. </li><li> Preparare 50 ml di Neurobasal TF oltre 2,5 ml di reagente di trasfezione in un flaconcino (soluzione A). Preparare 50 ml di Neurobasal TF più 4 mg mitGAmut plasmide in un flaconcino (soluzione B). Aggiungere delicatamente soluzione B sopra soluzione A. Consentire miscelazione durante 20 minuti, senza agitare. </li><li> Trasferire i coprioggetti contenenti neuroni dell&#39;ippocampo a nuove piastre multidish contenenti 200 ml di Neurobasal fresco TF. </li><li> Aggiungere goccia a goccia 100 ml di soluzione A + B su ogni vetrino. Incubare per 30 min. Rimuovere il supporto. Lavare una volta cellule con Neurobasal fresco TF. Ritorna i coprioggetti all&#39;originale Neurobasal Cultura Media. </li><li> Neuroni di coltura per altre 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 dopo la trasfezione per consentire l&#39;espressione efficace e la destinazione della sonda. </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni di prova per l&#39;imaging bioluminescenza. <ol><li> Preparare le soluzioni HBS contenenti NMDA 100 micron o 145 mM KCl comesopra (punto 2.1). Preparare la soluzione HBS contenente 10 mM Ca 2+ più digitonina 100 micron. </li></ol></li><li> Ricostituzione di equorina mitocondri mirati con coelenterazine n. <ol><li> Coprioggetto trasferimento contenenti neuroni dell&#39;ippocampo transfettate ad una piastra di quattro pozzetti contenenti 200 ml di HBS. </li><li> Aggiungere 4 ml di coelenterazine n (200 micron) per 200 ml di HBS per una concentrazione finale di 4 micron e mescolare delicatamente. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (25 ° C) e al buio. </li></ol></li><li> Registrazione di immagini bioluminescenza di mitocondriale [Ca 2+]. <ol><li> Accendere il microscopio, la lampada, il sistema di perfusione, fotocamera bioluminescenza e il computer. </li><li> Trasferimento coprioggetti ricostituiti per un termostatato (37 ° C) camera di perfusione e profumato continuamente con soluzione pre-riscaldato HBS ad una velocità di 5-10 ml / min. </li><li> Utilizzando un obiettivo 40X (olio, NA: 1.3), selezionare un campo microscopico che contiene le cellule che esprimono l&#39;unapoaequorins come dimostrano emissione di fluorescenza associata con l&#39;espressione di proteine ​​verde fluorescente (GFP) usando i filtri FITC. Un tipico campo può contenere 1-2 cellule transfettate. Acquisire l&#39;immagine fluorescenza GFP, utilizzando una camera CCD. </li><li> Spegnere la luce microscopio. Rimuovere la scatola-dicroico contenente situato nella via luce. Spegnere la luce di eccitazione e chiudere al buio-box per la completa oscurità. </li><li> Profumato cellule a 5-10 ml / min con HBS medie, con o senza soluzioni di test pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Cattura immagini emissioni fotoniche ogni 10 sec con una macchina fotografica conteggio di fotoni maneggiato con un processore di immagine. </li><li> Al termine di ogni esperimento, permeabilize cellule con 0,1 mM digitonina in 10 mM CaCl 2 in HBS per liberare tutti i rimanenti emissioni fotonici. Nota: Queste emissioni fotoniche devono essere sommati al fine di stimare le emissioni totali fotonici, un valore richiesto per la calibrazione di Ca 2+ concentrazioni &lt;./ li&gt; <li> Conservare immagini bioluminescenza nel computer l&#39;immagine di fluorescenza GFP associata con catturati prima di imaging conteggio dei fotoni. </li></ol></li><li> Analisi di immagini bioluminescenza riflettono mitocondriale [Ca 2+]. <ol><li> Quantificare le emissioni fotoniche utilizzo di software specifici. Emissioni fotonici possono essere convertiti mitocondriale Ca 2+ libera concentrazione ([Ca 2+] mit) utilizzando l&#39;algoritmo descritto da Brini et al. 15. </li><li> Aprire l&#39;immagine fluorescenza GFP esperimento e. Seleziona regioni di interesse (ROI) con l&#39;ausilio di software specifici disegnando la forma delle cellule trasfettate secondo le immagini di fluorescenza catturate all&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Incollare le stesse ROI su ogni immagine. Totale emissioni fotoniche in ogni ROI sono calcolate con un software specifico per ottenere il valore di emissione di luminescenza (L) per ogni cella in ciascun punto nel tempo. </li><li> Sommate tutte le emiss fotonicaioni nelle immagini bioluminescenza, compresi quelli ottenuti dopo digitonina permeabilizzazione, utilizzando il software specifico, per ottenere un&#39;immagine bioluminescenza contenente tutte le emissioni fotonici. </li><li> Valore delle esportazioni di emissioni fotonici per ogni regione di interesse per un software specifico per i calcoli. Per fare questo, fare clic su &#39;grafico&#39;, al fine di calcolare i valori bioluminescenza per ogni ROI in ogni momento. Seleziona &#39;valore totale&#39; e &#39;usare il ROI corrente a tutte le immagini. Premere &#39;Calcola&#39;. Salvare il &#39;txt.file&#39; ed esportare i dati di un foglio di lavoro. Per ogni ROI, [Ca 2+] mit è calcolato utilizzando il seguente algoritmo: [Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; dove, R = [L / (totale λ L)] 1 / n L è la luminescenza emessa al momento della misurazione in ciascuna regione di interesse. L totale èla luminescenza totale rimanente dopo l&#39;aggiunta dei conteggi presenti nel tessuto in quel momento al momento della misurazione per ciascuna regione di interesse. λ, K TR, K e R n sono costanti i cui valori dipendono combinazione di equorina (wild type o mutato) e coelenterazin utilizzato (wild type o tipo n) e la temperatura 16 registrazione. Per la combinazione qui utilizzato (mutato AEQ e coelenterzine n), a 37 ° C, abbiamo utilizzato i seguenti valori: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165.6 x 10 3, n = 1.204 e λ = 0,138. </li></ol></li><li> Effettuare i calcoli corrispondenti per stimare la dimensione degli aumenti di bioluminescenza in risposta ad ogni stimolo utilizzando un&#39;analisi dei dati adatto e grafici software. </li></ol>

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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

La ristrutturazione di Ca 2+ intracellulare omeostasi nel cervello che invecchia è stata collegata alla perdita cognitiva, aumentata suscettibilità alle ischemico danni, eccitotossicità e neurodegenerazione. Per studiare questa ipotesi in vitro, le procedure di imaging Ca 2+ sono disponibili. Purtroppo, colture vitali di vecchi neuroni dell&#39;ippocampo non sono affidabili. Recentemente, è stato osservato che le culture a lungo termine di ratto hippocampal neuroni presenti molte delle...

Eccitotossicità è uno dei meccanismi più importanti che contribuiscono a danno neuronale e la morte cellulare in insulti neurologici quali ischemia, e in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 1. Questo tipo di neurotossicità è mediato principalmente da glutammato agisce su Ca 2+ -permeable, recettori ionotropici NMDA (NMDAR) 2. L&#39;esposizione di neuroni in coltura per il glutammato può portare a eccitotossicità 3, che provoca l&#39;apoptosi neuronale 4. Noi e altri abbiamo già riferito che la vulnerabilità neuronale all&#39;apoptosi NMDA indotta può cambiare con lo sviluppo in vitro e l&#39;invecchiamento 5-8. È ampiamente accettato che un aumento del libero citosolico Ca 2+ concentrazione ([Ca 2+] cyt) porta all&#39;attivazione cellule. Tuttavia, se questo aumento è troppo alta e / o di sostegno sufficientemente, può innescare la morte cellulare 9. Inoltre, è stato propostoeccitotossicità che richiede Ca 2+ mitocondriale assorbimento 10, poiché il trattamento con neuroni neuroni protette contro disaccoppiatore mitocondriale indotta da glutammato morte cellulare 11. Se mitocondri occupano troppo Ca 2+, l&#39;apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale può verificarsi, che porta al rilascio del citocromo c ed altri fattori pro-apoptotica, e inducendo apoptosi. Abbiamo recentemente dimostrato che questo mitocondriale Ca 2+ assorbimento è direttamente correlata alla suscettibilità età-dipendente per eccitotossicità, misurando direttamente NMDA indotta mitocondriale Ca 2+ uptake in singoli neuroni ippocampali 5, un metodo che viene riportato in questo articolo. L&#39;ippocampo, coinvolto in processi fisiologici, come l&#39;apprendimento, la memoria e altri processi cognitivi 12, è altamente vulnerabile a invecchiamento e malattie neurodegenerative 13. E &#39;stato proposto che, dopo diverse settimane in vitro, coltaneuroni ippocampali mostrano una serie di caratteristiche tipiche di neuroni dai 14. Di conseguenza, colture di neuroni dell&#39;ippocampo a lungo termine possono fornire un modello globale per indagare Ca 2+ meccanismi mediata di una maggiore eccitotossicità nell&#39;invecchiamento. L&#39;obiettivo generale del metodo presentato è, quindi, di indagare i cambiamenti sostanziali nel intracellulare di Ca 2+ omeostasi o Ca 2+ rimodellamento nel cervello di invecchiamento tra cui il differenziale Ca 2+ risposte indotte da agonisti del recettore NMDA in una prospettiva a lungo termine colture di neuroni dell&#39;ippocampo . Il metodo comprende una descrizione dettagliata della cultura di neuroni ippocampali di ratto e il monitoraggio di citosolici e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni da fluorescenza e l&#39;imaging bioluminescenza in singoli neuroni rispettivamente. Imaging di fluorescenza di citosoliche Ca 2+ in neuroni in coltura è una procedura standard. Tuttavia, questo metodo è meno affidabile per subcellulare Ca 2+ misure tra cui mitocondriale Ca 2+. Le ragioni di questa includono la mancanza di una corretta mirati sonde sintetiche e affinità inadeguato per Ca 2 + concentrazioni che possono cambiare nei mitocondri dal livello di micron basso anche per il livello di mm. L&#39;utilizzo di Ca 2+ sonde a base di proteine ​​come ad esempio equorina, ha permesso di organelli subcellulari di targeting e l&#39;utilizzo di derivati ​​diversi Ca 2+ affinità utilizzando diversi coelenterazines o sonde mutanti privi specifico Ca 2+ siti di legame 15. In questo modo, bioluminescenza di cellule che esprimono equorina mitocondri mirati può consentire il monitoraggio dei mitocondriali di Ca 2+ concentrazioni in singoli neuroni. Tuttavia, questa procedura può richiedere l&#39;uso di macchine fotografiche di conteggio di fotoni o telecamere CCD ultrasensibili per bioluminescenza 16-18. Questo metodo può produrre nuovi risultati che dovrebbero essere confermata in più establmodelli mentata invecchiamento del cervello come, ad esempio, fette di cervello da vecchi animali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Suscettibilità alla morte cellulare dei neuroni associati alla neurodegenerazione e ischemia sono estremamente aumentata nel cervello invecchiato ma meccanismi responsabili sono mal noti. Eccitotossicità, un processo che si ritiene di contribuire al danno dei neuroni indotta da entrambe le ingiurie, è mediata da attivazione dei recettori del glutammato che promuove Ca 2+ afflusso e mitocondriale sovraccarico di Ca 2+. Un cambiamento sostanziale intracellulare di Ca 2+ omeostasi o ristrutturazione di Ca2 + intracellulare omeostasi può favorire danno neuroni in vecchi neuroni. Per indagare Ca 2+ rimodellamento nell&#39;invecchiamento abbiamo usato l&#39;imaging cellulare dal vivo in colture a lungo termine di neuroni di ratto dell&#39;ippocampo che assomigliano per alcuni aspetti neuroni in vivo di età. Per questo fine, cellule dell&#39;ippocampo sono, in primo luogo, al momento disperso dalle nuove ippocampi di ratto nato e placcato su vetrini rivestiti, vetro poli-D-lisina. Poi culture sono tenuti in media controllati per diversi giorni o più weeks per indagare giovani e vecchi neuroni, rispettivamente. In secondo luogo, neuroni in coltura sono caricati con fura2 e sottoposti a misure di concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ utilizzando digitale rapporto imaging di fluorescenza. In terzo luogo, neuroni in coltura sono trasfettate con plasmidi che esprimono un tandem di bassa affinità equorina e GFP mirata ai mitocondri. Dopo 24 ore, equorina all&#39;interno delle cellule viene ricostituito con coelenterazine e neuroni sono sottoposti ad immagini bioluminescenza per il monitoraggio della concentrazione di Ca2 + mitocondriale. Questa procedura in tre fasi permette di monitorare citosolica e mitocondriale Ca 2+ risposte agli stimoli rilevanti come ad esempio l&#39;agonista del recettore del glutammato NMDA e confronta se queste ed altre risposte sono influenzati da invecchiamento. Questa procedura può produrre nuove intuizioni su come l&#39;invecchiamento influenza citosolica e mitocondriale risposte Ca 2+ agli stimoli selezionati, nonché la sperimentazione di farmaci selezionati volti a prevenire cella neuronemorte in malattie legate all&#39;età.

Qui si descrive un metodo semplice per valutare Ca 2+ rimodellamento e gli effetti di NMDA sulla citosolica e mitocondriale [Ca 2+] nei neuroni età. La figura 1 mostra lo schema del procedimento per l&#39;isolamento e la coltura neuroni ippocampali di ratti neonati. Prima di iniziare, abbiamo bisogno di preparare sterili, rivestiti, vetrini poli-D-lisina e localizzarli in un piatto 4-bene. Poi, ratti neonati vengono uccisi e il cervello rimossi. Dopo aver isolato l&#39;ippocampo, ...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K Views.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

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Neuroscienze

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.