Questa procedura fornisce un accesso ottico ripetuto all'ippocampo dorsale dei topi vivi per studiare i meccanismi di formazione e richiamo della memoria mentre svolgono compiti di apprendimento. Questa tecnica consente l'uso della microscopia leggera per studiare l'ippocampo dorsale dei topi vivi a livello di micrometro risoluzione spaziale longitudinalmente per diverse settimane. La perdita di memoria è un segno distintivo generale di alcune malattie cerebrali come il morbo di Alzheimer.
Comprendere il meccanismo di formazione e richiamo della memoria potrebbe in ultima analisi aiutare i pazienti affetti da queste malattie. Questo metodo potrebbe essere applicato ad altri sistemi animali con un cranio come piccoli mammiferi. Monitorare i segni vitali durante un intervento chirurgico di sopravvivenza può essere sia distraente che stressante.
Potrebbe essere utile eseguire prima la procedura su un animale morto per concentrarsi sugli aspetti più cruciali della procedura. Per preparare la cannula di imaging, tagliare prima un tubo di acciaio inossidabile di tre millimetri di diametro in un anello metallico lungo 1,6 millimetri. Se i bordi dell'anello non sono smussati dopo il taglio, presentare le irregolarità.
Successivamente, utilizzare un paio di forcep per immergere un lato dell'anello metallico in un adesivo ottico di polimerizzazione UV. Quindi posizionare l'anello metallico al centro di una coverlip di vetro con il lato dell'anello coperto da adesivo che tocca il copripavimento. Accendere l'unità driver LED polimerizzazione UV e far brillare la luce della lunghezza d'onda di 365 nanometri sull'adesivo per un minuto per curare l'adesivo.
Assicurarsi che tutti i lati dell'anello siano ugualmente illuminati cambiando la direzione della sorgente luminosa. Dopo che l'adesivo si è indurito per almeno due ore, tenere saldamente la cannula dall'estremità aperta dell'anello metallico per mezzo di un emostato. Utilizzando un trapano dentale dotato di un file rotante, filettare il coperchio in eccesso del vetro fino a quando non viene lavato con i lati dell'anello.
Preparare gli strumenti richiesti e anestetizzare il mouse come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi rimuovere i capelli e disinfettare la pelle sopra la testa del mouse. Successivamente, utilizzare forbici e forcep per fare un piccolo taglio nel cuoio capelluto nella posizione vicino a lambda.
Muoversi lateralmente nella direzione delle orecchie quindi rostralmente nella direzione delle orbite oculari per formare un triangolo sull'asse sagittale di circa quattro millimetri rostrale a bregma. Applicare una singola goccia di lidocaina sul cranio. Dopo due minuti, sgombrato il periostio e asciugare il cranio usando un batuffolo di cotone.
Quindi posizionare le barre dell'orecchio per fissare la testa del mouse. Utilizzando un micro trapano con una bava di 0,5 millimetri, fare un piccolo foro nell'osso frontale di fronte all'ippocampo immaginato a circa 1,5 millimetri dalla sutura sagittale e due millimetri distale dalla sutura coronale. Quindi avvitare una vite ossea in acciaio inossidabile di 0,86 millimetri nel foro del cranio.
Fissarlo in posizione utilizzando cemento adesivo. Lasciare asciugare il cemento per 30 secondi a un minuto. Successivamente, utilizzare un trapano a tre endorfine di tre millimetri di diametro per fare un piccolo foro nell'osso parietale.
Posizionare il foro a circa 1,5 millimetri distale dalla sutura sagittale e due millimetri distale dalla sutura lambdoide. Rimuovere con cura il lembo osseo. Quindi rimuovere le meningi usando le forcep Dumont.
Ablate la materia corticale per raggiungere la capsula esterna. Utilizzare un ago smussato calibro 19 collegato a una pompa per vuoto e irrigare con soluzione salina per evitare la disidratazione del tessuto esposto e lavare via il sangue residuo dopo che il sanguinamento è stato risolto. Succhiare lentamente il tessuto corticale da 50 a 100 micron alla volta fino a quando la corteccia si stacca dalla capsula esponendo le fibre del cingulum o del corpo calloso.
Quindi sbucciare con cura le fibre dorsali fino a quando le fibre più profonde, l'alveo dell'ippocampo sono esposti. Al termine, sciacquare il tessuto con soluzione salina. Quindi, utilizzare forcep sottili per immergere la cannula inferiore in soluzione salina e posizionarla sopra il foro del cranio.
Quindi spingere la cannula nel cranio fino a quando il coverslip di vetro è a contatto con le fibre. Asciugare il cranio e applicare un rapido cemento adesivo sul cranio per tenere la cannula in posizione. Assicurati di applicare anche l'adesivo sul bordo della cannula, ma fai attenzione a non lasciare che l'adesivo si imbatta nella cannula.
Una volta asciutto, utilizzare un braccio stereotassico per posizionare una piastra portacapo sopra la cannula a contatto con il cranio. Preparare una miscela di acrilico dentale e quindi applicarla su tutto il cranio. Coprire l'intero cranio esposto, la vite e la pelle aperta con acrilico dentale per stabilizzare la preparazione.
Dopo 15 minuti, applicare una pellicola adesiva rimovibile sulla piastra portacapo per evitare che i detriti entrino nella cannula. Quando sei pronto per l'immagine del cervello, segui di nuovo nel protocollo di testo di accompagnamento per i dettagli sull'anestesia. Una volta sedati a sufficienza, utilizzare le forcep per rimuovere con cura la pellicola adesiva dalla piastra portacapo.
Rimuovere delicatamente il film per evitare di danneggiare la preparazione. Quindi, posizionare il mouse al microscopio sul tappeto riscaldante e fissare la piastra della testa al supporto. Applicare unguento per gli occhi sugli occhi dell'animale.
Quindi pulire la cannula di imaging usando una siringa e un ago sottile per far cadere acqua deionizzata nella cannula seguita dalla rimozione con una pompa per vuoto. Utilizzare obiettivi a lunga distanza di lavoro a basso ingrandimento per controllare visivamente la cannula per l'acqua residua, lo sporco, l'integrità e la presenza di fluorescenza. Quindi allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci del supporto della testa.
Passa a un obiettivo 25X con un'apertura numerica di 1,0 e una distanza di lavoro di quattro millimetri. Quindi aggiungere abbastanza acqua deionizzata alla cannula per riempirla e mantenere l'acqua in eccesso sopra la cannula. Infine, utilizzare due eccitazioni fotone e immagini i segnali di fluorescenza.
Mostrato qui è una pila di immagini 2P da un cervello transgenico di topo thy1-GFP. I topi Thy1-GFP esprimono GFP potenziato citoplasmatico sotto il controllo del promotore Thy1 in una scarsa popolazione casuale di neuroni piramidali. Generalmente, l'asse principale dei neuroni piramidali nell'ippocampale dorsale CA1 è approssimativamente perpendicolare al piano di imaging XY.
Queste regioni vengono mappate manualmente a una pila tridimensionale a basso ingrandimento che mostra il modello di espressione GFP nel volume sotto la cannula di imaging. Per il tracciamento longitudinale, vengono definite diverse regioni cerebrali all'interno del campo visivo della cannula. Ogni regione corrisponde ad un'area di circa 240 per 240 micrometri e contiene da uno a sette segmenti dendritici.
La serie di immagini qui mostra un micrometro z-step stack di neuroni piramidali CA1 e dendriti basali acquisiti a diversi intervalli di tempo per 14 giorni. Tuttavia, sono possibili durate e intervalli di imaging più lunghi. Sebbene la maggior parte delle immagini siano di spine dendritiche nello strato oriens, è anche possibile immagine delle spine dendritiche nei dendriti obliqui dello strato radiatum.
Un'altra estensione di questa tecnica è l'immagine della plasticità evocata dall'attività nei neuroni piramidali CA1 iniettando l'area ippocampale dorsale CA1 con un vettore virale. Ciò consente di misurare la plasticità di centinaia di neuroni piramidali CA1 in ogni animale come pila di immagini 2P. È fondamentale prevenire danni all'ippocampo quando si rimuove il tessuto sovrascrivimento.
Inoltre, si dovrebbe posizionare correttamente la cannula per garantire una preparazione stabile. La preparazione descritta consente l'uso di diversi tipi di imaging ottico come microscopi miniaturici che possono essere impiantati sulla testa dell'animale. Ciò consente al ricercatore di seguire l'attività neuronale negli animali che si muovono liberamente.
Originariamente, la tecnica è stata utilizzata per studiare la plasticità strutturale nei neuroni ippocampali. Oggi, è implementato nello studio dell'attività neuronale anche in altre aree cerebrali.
