This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

Calibrazione 1 Sistema <ol><li> Point Spread Function (PSF) calibrazione <ol><li> Diluire 10 ml di soluzione di 30 nm perline fluorescenti (circa 5 mM) in 90 ml di acqua distillata e poi sonicare la soluzione per 20 min. Tagliare un quadrato (1 cm x 1 cm) pezzo di gel di agarosio (3%) e deposito 10 microlitri della soluzione sulla superficie del gel. Capovolgere il pezzo di gel sul vetro fondo di un piatto 2 centimetri Petri e spremere la goccia sul vetro. </li><li> Accendere il setup di acquisizione, mettere il campione nel supporto, impostare l&#39;esposizione della fotocamera e EMgain (100 msec e 1.000 sono buoni parametri ma ottimizzano secondo il sistema) e attendere che la fotocamera si raffreddi. </li><li> Impostare esposizione della fotocamera a 100 msec, fotocamera EMgain a 1.000, modalità di acquisizione al fotogramma Transfer, 100 ripetizione automatica e impostazione di risparmio. </li><li> Usando l&#39;oculare e la messa a fuoco luce trasmessa al confine del gel e quindi spostare l&#39;obiettivo verso il centro del gel, regolare la messa a fuoco e start la procedura di allineamento laser (in LAS AF, selezionare &#39;installazione TIRF&#39; e seguire la procedura di allineamento automatico). </li><li> Trovare un campo di vista con isolati singoli punti, esattamente concentrarsi sul punto più luminoso (che di solito rappresenta perline aggregato) come riferimento, acquisire 100 fotogrammi e ripetere l&#39;operazione 5-6 volte al fine di acquisire diversi punti singoli. </li><li> Importare la serie acquisita ad un programma di elaborazione dei dati e la media dello stack nel tempo (Figura 1A) e selezionare una singola goccia isolato. Fare attenzione a selezionare i più piccoli per evitare di aggregati di particelle. </li><li> Montare la distribuzione selezionata intensità (un esempio di singolo profilo perline è presentato in Figura 1B) con una funzione gaussiana con il comando &quot;gaussfit&quot; (negli strumenti ICS-Matlab nei Materiali in Matlab). Verificare la bontà del fit ispezionando i residui ottenuti (un esempio di profilo gaussiano attrezzata con i residui corrispondenti viene presentato in Figura 1B). </li></ol></li><li> Calibrazione della fotocamera <ol><li> Accendere la fotocamera e attendere che la fotocamera si raffreddi. Impostare l&#39;impostazione di acquisizione della fotocamera, (vale a dire, per la fotocamera utilizzata impostiamo l&#39;esposizione a 0.5 msec, fotocamera EMgain a 1.000, modalità di acquisizione alla modalità ritagliata, la dimensione del ROI di 32 x 128, 10.000 ripetizioni) e iniziare l&#39;acquisizione del fondo telecamera segnale. </li><li> Import acquisito serie telaio di un programma di elaborazione dei dati. Calcolare e controllare l&#39;intensità media in ogni pixel per verificare che lo sfondo fotocamera circa piatto nella regione selezionata del chip. In modalità crea, rimuovere la prima e le ultime linee orizzontali (da 3 a 10 a seconda delle dimensioni della ROI) per ogni frame perché lo sfondo fotocamera è solitamente polarizzato nelle linee di confine. </li><li> Creare un istogramma dei valori (definito anche livello digitale, DL) nelle immagini acquisite pila (usando il comando &#39;cron&#39; in Matlab) e tracciare il logaritmodi conseguente frequenza (utilizzando il comando semilogy in Matlab). Un esempio di distribuzione DL per telecamera sfondo è presentata nella Figura 2. NOTA: Se la fotocamera funziona bene, la trama mostra un picco di circa gaussiano (a profilo parabolico in log-scala) che rappresenta la distribuzione dei valori associati al fotone zero seguito da un decadimento esponenziale (una retta con pendenza negativa in log-scala ) che rappresenta la distribuzione dei valori associati a 1 fotone (Figura 2). In particolare, il centro e la varianza della funzione gaussiana rappresentano la telecamera di offset e l&#39;errore, rispettivamente, mentre la costante di decadimento esponenziale della parte rappresenta una stima della DL assegnato dalla fotocamera per ogni singolo fotone. In Matlab utilizzare la sezione &quot;CalibrateCamera&quot; dello Script in materiali di supporto. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per tutti la telecamera selezionata EMGain e Gain. </li></ol></li></ol> 2 etichettatiPreparazione delle cellule <ol><li> Per preparare i liposomi richiesti per incorporazione di lipidi 36, sciogliere separatamente 1 mg di DOPE (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina), 1 mg di DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano), e 1 mg di PPE-ATTO488 in 1 ml di cloroformio. Mescolare 0,5 ml di soluzione DOPE, 0,5 ml di soluzione di DOTAP, e 25 ml di soluzione di PPE-ATTO488 e secco sotto vuoto per 24 ore. Aggiungere 0,5 ml di tampone di HEPES 20 mM, vortex per 15 minuti e ultrasuoni per 15 min a 40 ° C. </li><li> Per preparare la cella, lavare 3 volte con PBS un piatto p100 di confluenti CHO-K1 (ovaio di criceto cinese), aggiungere 1 ml di tripsina e conservare in incubatrice per 5 min. Sospendere le cellule staccate aggiungendo 9 ml di terreno DMEM / F12 supplementato con 10% di FBS e sementi 150 ml di soluzione di cellule in una capsula di Petri contenente 800 ml dello stesso terreno. </li><li> Conservare in incubatore per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Per incorporazione di lipidi, sostituire medio cella con 500microlitri di terreno privo di siero; dopo 30 min, aggiungere 2 ml di soluzione di liposomi; dopo 15 minuti di lavaggio con PSB e aggiungere nuovo medium DMEM / F12 per l&#39;imaging. </li><li> Per la trasfezione, le cellule trasfezione secondo il protocollo Lipofectamine (istruzioni del produttore) utilizzando TFR-GFP plasmide e conservare 24 ore in incubatrice prima di imaging. </li></ol> 3 Acquisizione Dati <ol><li> Preparazione di installazione <ol><li> Al fine di termostato al microscopio, 24 ore prima dell&#39;esperimento accendere l&#39;incubatore. </li><li> Al fine di applicare il tempo di acquisizione più veloce realizzabile, opera in modalità ritagliata sensore (vedi introduzione) e utilizzare una prima telecamera per l&#39;imaging (fotocamera 1) e seconda fotocamera per selezionare la cella (2 macchina fotografica). Uno schema di configurazione di setup è presentato in Figura supplementare S1. Poi, per allineare le due telecamere Accendere il microscopio e attendere che le telecamere si raffreddino. </li><li> Situato su entrambe le fotocamere, i parametri per l&#39;imaging luce trasmessa (cioè </em&gt;, 20 msec di tempo di esposizione, 1 per EM Gain) e mettere il microscopio in modalità Luminoso campo. </li><li> Mettere i campioni nel supporto e mettere a fuoco utilizzando oculare, inviare la luce alla telecamera 1 e spingere delicatamente le fessure che consentono la luce solo sul ROI utilizzato per l&#39;imaging cellulare (qui un ROI di 32 x 32 pixel). </li><li> Spostare una cella nella regione selezionata e trasmettere la luce alla telecamera 2, quindi disegnare una ROI nel software che controlla la telecamera 2 per avere un riferimento. </li></ol></li><li> Imaging (Figura 3A) <ol><li> Prima di tutto, allineare il laser TIRF secondo la procedura di configurazione. Nel nostro setup, selezionare il &#39;impostazione TIRF&#39; e avviare la procedura di allineamento automatico. Quando il laser è allineato set 70 nm di profondità di penetrazione (circa 70 °). </li><li> Impostare il tempo di esposizione di 70 msec e EMGain a 100 su entrambi videocamera 1 e la videocamera 2; quindi, selezionare una cella utilizzando la fotocamera 1, quindi inviare la luce fotocamera da 2 e mettere a fuoco con precisione la membrana cellulare. Impostare l&#39;esposizione minima camera 2, 1000 EMGain, modalità corta del sensore, 10 5 ripetizioni e salvataggio automatico impostato come file FITS (Flexible Image Transport System, un formato che può essere facilmente gestito). </li><li> Avviare l&#39;acquisizione di registrare la serie di immagini. Rilasciare il guadagno e la modalità ritagliata per consentire la stabilizzazione della temperatura prima di acquisire una nuova cella, quindi ripetere gli ultimi due passaggi al fine di acquisire 8-10 cellule. </li></ol></li></ol> 4 Calcolo del Mean Square Cilindrata da Imaging (i MSD) NOTA: Il seguente protocollo può essere applicato direttamente ai dati grezzi. Allo stesso tempo, l&#39;intero protocollo è valido per acquisizioni dati simulati sia in Matlab e in SimFCS. Il link per il tutorial corrispondenti si possono trovare nella sezione &#39;Materials&#39;. <ol><li> Calcolo con Matlab <ol><li> Importare la serie acquisita Matlab utilizzando ImportImageSeries copione. Calcolare l&#39;intensità media di ogni immagine nel tempo utilizzando il command dire sui primi 2 dimensioni e utilizzare complotto per vedere il vettore risultante. </li><li> Se più del 10% di fotoscolorimento è presente, scartare la serie o rimuovere la prima parte di essi. Se è inferiore, provare a correggere l&#39;effetto sulla funzione di correlazione sottraendo ad ogni immagine la sua intensità media, come mostrato prima 37. </li><li> Calcolare l&#39;intensità media di ciascun pixel mediante medio sulla terza dimensione e visualizzare l&#39;immagine risultante. NOTA: Particolare attenzione è richiesta al fine di evitare correlazioni artefatti. Infatti, come precedentemente indicato per tecniche simili 38, i bordi delle celle nonché su vescicole fuoco potrebbe introdurre una forte correlazione. Se l&#39;ispezione di immagine media rivela i bordi delle celle o di vescicole fuoco, cercare di escludere la regione coinvolta altrimenti scartare l&#39;acquisizione. Per correggere l&#39;effetto di queste strutture immobili sottrarre l&#39;intensità media temporale da ogni pixel 39. </li><li> Calcola tegli correlazione spazio-temporale (G (ξ, χ, τ)) utilizzando la funzione CalculateSTICScorrfunc. Rimuovere G (ξ, χ, 0) in quanto la correlazione a causa del rumore girato in regime di scarsa luminosità domina G (0,0,0); la correlazione dovuta al rivelatore domina la G (± 1,0,0), e il movimento delle particelle durante il tempo di esposizione potrebbe deformare G (ξ, χ, τ) per τ = 0, aumentando la vita misurata (questo effetto scompare per τ &gt; 0) 34. </li><li> Media G (ξ, χ, τ&gt; 0) con un tempo-bin logaritmico per ridurre il rumore utilizzando la funzione &quot;LogBinStack&quot; per il sostegno materiale e poi montare il G risultante (ξ, χ, τ) utilizzando la funzione &quot;gaussfit&quot; di gli strumenti di ICS-Matlab nei Materiali per recuperare l&#39;i ​​MSD (la seconda colonna della matrice risultante). </li><li> Tracciare la σ ottenuta vita (τ) 2 (i MSD) in funzione del tempo. Se i dati sono troppo rumorosi, cercare di aumentare il numero di acqucornici IRED, aumentano la potenza del laser, media più G (ξ, χ, τ) insieme. </li></ol></li><li> Calcolo da SimFCS <ol><li> Aprire i file acquisiti con ImageJ usando BIOFORMAT importatore plug-in e salvare serie acquisite Tiff sequenza. </li><li> Aprire strumento SimFCS e selezionare RICS e selezionare File&gt; Importa immagini multiple (complementare Figura S2). </li><li> Selezionare Fit, inserire i parametri di acquisizione corretti e chiudere la finestra di misura (complementare figura S3). </li><li> Selezionare Display&gt; Intensità Media&gt; CH1 e verificare la presenza di photobleaching (complementare figura S4). </li><li> Se più del 10% di fotoscolorimento è presente scarti serie o se è possibile caricare nuovamente la sequenza di immagini rimuovendo la prima parte della serie. </li><li> Se lo sbiancamento è inferiore del 10% selezionare Strumenti&gt; i MSD&gt; Impostazione dei parametri, controllare &#39;Usa media mobile&#39;, ambientato nel pannello ROI sulla sinistra unumero di telaio per il movimento attenzione media pagatore che il tempo corrispondente è superiore al tempo di diffusione caratteristica (per particella che si muove a 1 micron 2 sec -1 un tempo di 10 secondi è una buona media mobile) </li><li> Selezionare Strumenti&gt; IMSD&gt; Calcola i MSD (Figura complementare S5) e in forma ed esportare la i MSD dalla memo pad (figura complementare S6). </li></ol></li></ol> 5 Calcolo della Legge Diffusione del I MSD <ol><li> Montare i primi punti per estrapolare l&#39;intercetta (σ 0 2) (5 punti sono sufficienti di solito, ma più punti possono essere montati se essi mostrano un comportamento lineare) e confrontare questo valore con il PSF precedentemente misurato 2. Se sono comparabili, sono state seguite le dinamiche di fluorofori isolate. Per contro, se σ 0 2 &gt;&gt; FPF 2 tentativo di acquisire velocemente per garantire chedinamiche non nascosti sono presenti 34. </li><li> Calcolare la diffusività apparente (D app) e lo spostamento medio (R) utilizzando le equazioni 3 e 4 (vedi Introduzione). </li><li> Terreno D app come funzione di R per ottenere una legge di diffusione paragonabile a quello che viene misurata con variazione posto a base FCS 12 (Figura 3D). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Tracciamento singola particella (SPT) rappresenta una delle strategie più comuni per lo studio della dinamica molecolare e ha il grande vantaggio di misurare traiettorie delle particelle. Questo a sua volta permette di sondare il comportamento anche di poche particelle etichettati in un sistema complesso. Tuttavia, per raggiungere questo vantaggio SPT bisogno tipicamente una bassa densità della sonda ed etichette molto luminosi. In particolare, per ottenere l&#39;alta risoluzione temporale (intervallo msec) sonda inor...

Partendo dal modello originale &quot;mosaico fluido&quot; di Singer e Nicolson, l&#39;immagine di membrana plasmatica cellulare è stato costantemente aggiornato nel corso degli ultimi decenni, al fine di comprendere il ruolo emergente del citoscheletro e lipidi domini 1,2. Le prime osservazioni sono state ottenute da recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) svelamento che una frazione significativa di proteine ​​di membrana è immobile 3-5. Questi studi pionieristici, anche se molto informativo, sofferto dalla relativamente scarsa risoluzione spaziale (micron) e di tempo (secondi) di configurazioni FRAP. Inoltre, essendo una misura media insieme, FRAP manca di dare informazioni sul comportamento singola molecola. In questo contesto, la possibilità di etichettare specificamente una singola molecola di etichetta molto luminosi (permettono lo studio del processo di diffusione una molecola alla volta) ha avuto molto successo. In particolare, spingendo l&#39;risoluzione temporale dell&#39;approccio singola particella di monitoraggio (SPT) per i tempi microsecondi, Kusumi, et al. accesso maturata alle funzioni sconosciute della dinamica dei lipidi e delle proteine ​​che grandemente contribuito al riconoscimento del ruolo di base di actina-membrana scheletro in membrana fisiologia 6 , 7. Questi risultati hanno generato il così chiamato il &#39;picchetto recinto e&#39; il modello, in cui lipidi e proteine ​​diffusione è regolata da scheletro a base actina-. Tuttavia, al fine di avere accesso alla enorme quantità di informazioni fornite da SPT molte questioni sperimentali devono essere affrontate. In particolare, la procedura di etichettatura è tipicamente composta da molte fasi come la produzione, la purificazione e l&#39;introduzione di specie marcate nel sistema. Inoltre, le grandi etichette, come punti quantici o nanoparticelle metalliche, sono spesso necessari per raggiungere la scala cronologica inferiore al millisecondo e la reticolazione delle molecole bersaglio per l&#39;etichetta non poteva essere evitato in molti casi. Infine, molte traiettoriedevono essere registrati per adattarsi criteri statistici e contemporaneamente è richiesta una bassa densità dell&#39;etichetta per consentire il monitoraggio. Rispetto a SPT, spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS), superando molti di questi inconvenienti, rappresenta un approccio molto promettente per studiare la dinamica molecolare. In realtà, FCS funziona bene anche con le etichette dim e densi, consentendo di studiare la dinamica di molecole proteiche-tag fluorescenti nelle cellule trasfettate. Inoltre, permette di raggiungere elevate statistiche in un periodo di tempo limitato. Infine, nonostante la densità &quot;alta&quot; delle etichette FCS fornisce informazioni di singole molecole. Grazie a tutte queste proprietà, FCS rappresenta un approccio molto semplice ed è stato ampiamente applicato a studiare la dinamica dei lipidi e proteine ​​sia in membrane modello e in vivo cellule 8-10. Molti approcci diversi sono stati proposti per aumentare la capacità di FCS per rivelare i dettagli di diffusione molecolare. Per esempio, è stato shproprio che eseguendo FCS sulle aree di osservazione di diverse dimensioni si può definire un &quot;diritto FCS diffusione&quot; caratteristiche illuminanti nascosti del moto molecolare 11,12. Oltre ad essere variato in termini di dimensioni, l&#39;area focale è stato ripetuto anche il 13, si trasferisce in uno spazio lungo le linee 14-20 o coniugati con telecamere veloci 21,22. L&#39;utilizzo di questi correlazione &#39;spazio-temporale&#39; approcci, parametri biologici rilevanti dei diversi componenti di membrana sono stati quantitativamente descritti su entrambe le membrane modello e quelle biologiche attuali, quindi visione cedimento in membrana organizzazione spaziale. Tuttavia, in tutti gli FRAP e applicazioni FCS descritto finora la dimensione della zona focale rappresenta un limite di risoluzione spaziale che non può essere superata. Diversi metodi di imaging super-risoluzione sono state recentemente sviluppate per aggirare questo limite. Alcuni sono basati sulla precisione di localizzazione, come ad esempio stocastico la microscopia ottica ricostruzione (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, la microscopia localizzazione fotoattivazione (PALM) 25, fluorescenza PALM (FPALM) 26, e single-particelle di tracking PALM (sptPALM) 27: relativamente grande quantità di fotoni necessari ad ogni snapshot, tuttavia, limita la risoluzione temporale di questi metodi per almeno diversi millisecondi, ostacolando così la loro applicabilità in vivo. Al contrario, una promettente alternativa per Super Resolution Imaging sono stati aperti dal spazialmente modulando l&#39;emissione di fluorescenza con i metodi di deplezione emissione stimolata (STED o reversibili saturabili transizioni ottiche di fluorescenza (RESOLFT)) 28,29. Questi approcci combinano la sagomatura del volume osservazione ben al di sotto del limite di diffrazione con la possibilità di utilizzare microscopi a scansione veloce e sistemi di rilevazione. In combinazione con l&#39;analisi di fluorescenza fluttuazione, microscopia STED permesso di sondare direttamente le dinamiche spazio-temporali nanoscala di lipidi e proteins in membrane cellulari dal vivo 30,31. Le stesse grandezze fisiche di microscopia basata STED possono essere ottenuti da un spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale modificato (STICS 32,33) metodo che è adatto per lo studio della dinamica delle proteine ​​fluorescenti-taggato membrana e / o lipidi in cellule vive e da un microscopio commerciale. Il protocollo sperimentale qui presentata è composta da pochi passi. Il primo richiede l&#39;imaging veloce della regione di interesse sulla membrana. Poi, la pila risultante di immagini viene utilizzato per calcolare le funzioni di correlazione medi spazio-temporali. Con il montaggio della serie di funzioni di correlazione, la &#39;legge di diffusione&#39; molecolare può essere ottenuto direttamente dalle immagini sotto forma di una diffusività apparente (D app) - vs medi di equipaggio grafico di spostamento. Questa trama dipende in modo critico l&#39;ambiente esplorato dalle molecole e permette di riconoscere direttamente le modalità di diffusione attualidel lipide / proteina di interesse. In più particolari, come precedentemente indicato 34, la funzione di autocorrelazione spazio-temporale della serie dell&#39;immagine acquisita dipende in modo critico dalla dinamica delle molecole si muovono nella serie di immagini raccolte (si ricorda che lo stesso ragionamento può essere applicato in una linea di acquisizione dove solo una dimensione nello spazio è considerato). In particolare, si definisce la funzione di correlazione come: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) dove <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> rappresenta l&#39;intensità di fluorescenza misurata nella posizione x, y, al tempo t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> e <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> rappresenta la distanza in x eindicazioni y rispettivamente, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> rappresenta l&#39;intervallo di tempo, e <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> rappresenta la media. Questa funzione può essere espressa come: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) dove &#39;N&#39; rappresenta il numero medio di molecole nella zona di osservazione, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> rappresenta l&#39;operazione di convoluzione nello spazio, e <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> rappresenta l&#39;autocorrelazione della vita strumentale. Quest&#39;ultimo può essere interpretato come una misura di quanto i fotoni di un singolo emettitore sono sparsi nello spazio a causa della configurazione ottica / registrazione (la cosiddetta Point Spread Function, PSF, geneRALLY ben approssimata da una funzione gaussiana). Infine, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> rappresenta la probabilità di trovare una particella a distanza <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> e <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> dopo un ritardo <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . Se consideriamo una dinamica diffusiva, in cui le particelle si muovono in modo casuale in tutte le direzioni e flussi netti non sono presenti, questa funzione è anche ben approssimata da una funzione gaussiana dove la varianza può essere identificato come il Mean Square Displacement (MSD) della particella in movimento . Così, la vita della funzione di correlazione (indicato anche come <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ), Può essere definito come la somma dei DMS particelle e la vita strumentale e può essere misurata con una misura gaussianazione della funzione di correlazione per ogni ritardo. La misurato i MSD può essere usato per calcolare un diffusività apparente delle molecole in movimento <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> e uno spostamento medio <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> come: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) Poche considerazioni sul setup sperimentale utilizzato può guidare il lettore attraverso i seguenti sezioni. Al fine di eccitare selettivamente i fluorofori sulla membrana basale delle cellule useremo una riflessione interna (TIR) ​​illuminazione totale vivente, utilizzando una fluorescenza TIR commerciale (TIRF) microscopio (i dettagli si possono trovare nella sezione materiali). Inoltre, al fine di raccogliere the fluorescenza useremo un obiettivo ad alto ingrandimento (100X NA 1,47, alta apertura numerica è necessaria per l&#39;illuminazione TIRF) e una fotocamera EMCCD (dimensione fisica del pixel sul chip 16 micron). Per raggiungere una dimensione di pixel di 100 nm applichiamo una lente di ingrandimento supplementare di 1.6X. Come discusso in seguito, una risoluzione temporale inferiore a 1 msec sarebbe necessario per descrivere correttamente le dinamiche di lipidi di membrana veloci sotto i 100 nm. Per raggiungere questa risoluzione temporale dobbiamo selezionare una regione di interesse (ROI) più piccolo dell&#39;intero circuito integrato della fotocamera (512 x 512). In questo modo, la fotocamera leggerà un numero ridotto di linee aumentando la risoluzione temporale. Tuttavia, in questo regime lettura il lasso di tempo sarebbe limitata dal tempo necessario per spostare le cariche dalla esposizione al chip di lettura sulla fotocamera e di solito dell&#39;ordine di millisecondi per 512 x 512 pixel EMCCD. Per battere questo limite, una tecnologia emergente consente di spostare le ROI linee solo che invece di tutta la struttura, won una riduzione effettiva pratica della dimensione del chip esposto (chiamata modalità ritagliata sensore nel nostro EMCCD). Per questa configurazione sia efficace, il chip di fuori della ROI deve essere coperta da una coppia di feritoie montati nel percorso ottico. Grazie a questa configurazione di risoluzione tempo fino a 10 -4 secondi può essere raggiunto. Si prega di notare, tuttavia, che questo approccio può essere accoppiato con molte diverse configurazioni sperimentali, come spiegato nella sezione &#39;discussione&#39;. Dimostrazione del metodo sarà fornito in cellule vive, utilizzando sia un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) e una variante di GFP-etichetta della transferrina recettore (GFP TFR). Nel caso di ATTO488-PPE questo approccio può recuperare correttamente un&#39;applicazione D pressoché costante in funzione di spostamento medio indica una diffusione prevalentemente libera, come precedentemente riportato 30,35. Al contrario, TFR-GFP mostra una diminuzione D <sub&gt; app in funzione della cilindrata media, suggerendo diffusione parzialmente confinata 6. Inoltre, in quest&#39;ultimo caso è possibile quantificare la costante diffusione locale e la superficie media di confinamento di numerose micron sul piano membrana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

È diventato sempre più evidente che la distribuzione spaziale e il moto dei componenti della membrana, come i lipidi e le proteine ​​sono fattori chiave nella regolazione di molte funzioni cellulari. Tuttavia, a causa della dinamica veloci e le minuscole strutture coinvolte, risoluzione spazio-temporale molto elevata è necessaria per catturare il reale comportamento delle molecole. Qui vi presentiamo il protocollo sperimentale per lo studio della dinamica delle proteine ​​e dei lipidi plasmatici-membrana fluorescenza marcata nelle cellule vive con alta risoluzione spazio-temporale. In particolare, questo approccio non ha bisogno di tenere traccia di ogni molecola, ma calcola comportamento popolazione utilizzando tutte le molecole in una regione della membrana. Il punto di partenza è una immagine veloce di una regione determinata sulla membrana. Successivamente, una completa funzione di autocorrelazione spazio-temporale è calcolato correlando immagini acquisite ad aumentare i ritardi, per esempio ogni 2, 3, n ripetizioni. E &#39;possibile dimostrare che la larghezzadel picco dei spaziali aumenti funzione di autocorrelazione al crescente temporizzazione in funzione del movimento delle particelle a causa della diffusione. Pertanto, il montaggio della serie di funzioni di autocorrelazione consente di estrarre la proteina effettiva media cilindrata piazza da immagini (IMSD), qui presentato in forma di apparente diffusività vs spostamento medio. Questo produce una visione quantitativa della dinamica medi delle singole molecole con precisione nanometrica. Utilizzando una variante GFP-tagged della transferrina recettore (TFR) e un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (PPE) è possibile osservare la regolazione spazio-temporale di proteine ​​e lipidi diffusione su micron-sized regioni membrana nell&#39;intervallo di tempo di micro-to-milli-secondi.

Per calibrare la vita strumentale, l&#39;immagine di una singola fluorescente nano-tallone può essere misura come descritto nel protocollo punto 1.1. Una tipica immagine fluorescente di queste perle è presentato in Figura 1. Il montaggio della distribuzione dell&#39;intensità da una funzione gaussiana 2D restituisce buoni residui e permette che misura la vita strumentale a 270 nm. Questo valore è in buon accordo con il limite di diffrazione atteso stimato con l&#39;equazione di Rayleigh. Questa tara...

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From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Views.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Video: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Ricerca

Bioingegneria

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recupero della fluorescenza dopo Fusione di una Droplet misurare la diffusione bidimensionale di un fosfolipide monostrato

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selective cellulare eliminazione dalla misto Cultura 3D utilizzando una tecnica Near Infrared Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.