Questo nuovo metodo efficiente per isolare le sottopopolazioni di spermatociti e spermatidi da topi adulti può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base della meiosi e della spermatogenesi. Questo metodo utilizza un colorante legante del DNA a bassa citotossicità con un ampio spettro di eccitazione che può essere applicato alla maggior parte degli ordini FACS attualmente utilizzati. Questo metodo è molto semplice.
L'aspetto più impegnativo è la crescita citometrica del flusso, ma la strategia di gating dettagliata dovrebbe aiutare ad adattare il protocollo ad altri smistatori di celle. A dimostrare la procedura sarà Yu-Han Yeh, un assistente di ricerca del laboratorio di Satoshi Namekawa. Dopo aver raccolto entrambi i tester da un topo maschio di otto settimane, posizionare i tessuti in una piastra di Petri di 60 millimetri contenente due millilitri di PBS ghiacciato e rimuovere la tunica albuginea.
Separare delicatamente i teste con le forcep per disperdere leggermente i tubuli seminiferi. E trasferire i tubuli in una goccia di PBS fresco ghiacciato in una piastra di Petri da 100 millimetri. Utilizzare le forcep per districare delicatamente i tubuli e lavare i tubuli in tre goccioline aggiuntive di PBS come appena dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare i tubuli seminiferi non angolati in un tubo da 15 millilitri, contenente due millilitri di tampone di dissociazione per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, utilizzare una pipetta da 1000 microliter per pipettare delicatamente i tubuli 20 volte, prima di restituire il tubo all'incubatore per altri sei minuti. Alla fine dell'incubazione, pipettare i tessuti altre 20 volte, prima di restituire il tubo all'incubatrice.
Dopo tre minuti, pipettare delicatamente i tubuli 10 volte o fino a quando non rimangono pezzi di tessuto visibili, prima di interrompere la dissociazione con 10 millilitri di tampone FACS. Quindi, centrifugare la sospensione del tessuto due volte utilizzando altri 10 millilitri per il tampone FACS fresco per il secondo lavaggio per rimuovere gli spermatozoi e il maggior numero possibile di detriti. Per macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso, sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di tampone FACS.
E filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micron, in un tubo da 50 millilitri. Dopo il conteggio, trasferire il 10% delle cellule in un nuovo tubo sul ghiaccio come controllo negativo non macchiato. E mescolare accuratamente sei microlitri di macchia DCV nella sospensione cellulare rimanente.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio con tremori delicati ogni 10 minuti, aggiungere cinque microlitri di DNasi I alle cellule. E filtrare le cellule attraverso un colino in rete di nylon da 35 micron in un tubo FACS da cinque millilitri su ghiaccio. Per l'analisi citometrica del flusso delle celle, create un nuovo esperimento nel software di analisi del flusso e nel menu degli strumenti del foglio di lavoro fate clic su nuova densità per creare un'area di dispersione in avanti rispetto al plottaggio della densità dell'area backscatter su scala lineare.
Fate clic su un nuovo istogramma per creare un plot istogramma blu DCV su scala logaritmica. Quindi fare clic su Avvia e registra per iniziare l'elaborazione dell'esempio non macchiato. Durante l'esecuzione del campione, fare clic sulle impostazioni del rilevatore e della soglia per regolare le tensioni PMT di dispersione avanti e laterale per posizionare le celle non macchiate sulla scala del grafico a dispersione avanti e indietro.
Regolare la tensione PMT per il canale jappy per localizzare la posizione della popolazione negativa DCV nel primo decennio del grafico logaritmico dell'istogramma blu DCV. Quindi, fare clic su Interrompi per scaricare l'esempio non macchiato. Dopo aver brevemente vortice e caricato l'esempio colorato, fare clic sul tubo successivo per creare un nuovo foglio di lavoro per l'esempio.
Impostare il citometro in modo che acquisisca almeno una volta 10 sui sei eventi e fare clic su Avvia e registra. Quindi, fare clic su nuova densità per creare altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti. E i grafici a densità rossa DCV blu contro DCV su scala lineare.
Nel grafico della densità dell'area di dispersione in avanti rispetto al tracciato di densità dell'area del backscatter, usate lo strumento poligono per disegnare un cancello chiamato celle per includere la maggior parte delle cellule ed escludere piccoli detriti. Applicare questo gate al tracciato dell'altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti e utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare il gate di una singola cella per escludere le celle non singole. Applicate il gate della singola cella al plottaggio di densità rossa DCV blu contro DCV e regolate la scala per catturare un profilo esteso.
Utilizzate lo strumento poligono per disegnare un gate DCV per escludere le celle non macchiate e la popolazione laterale e applicate il gate a un plot istogramma blu DCV su scala lineare. I tre picchi principali si riferiscono ai diversi contenuti di DNA 1C, 2C e 4C. Create un secondo plottaggio di densità rossa DCV e blu DCV su scala lineare.
E dietro cancello il cancello DCV sulla trama per localizzare le popolazioni 1C e 4C. Create un altro plottaggio di densità rossa DCV e blu DCV su scala lineare. E usa lo strumento ellisse per disegnare un cancello sulla popolazione 1C.
Utilizzare lo strumento poligono per gateare la popolazione 4C con una curva continua. E creare un altro grafico di densità rossa DCV blu contro DCV su scala lineare. Utilizzate lo strumento poligono per creare un cancello 4C.
In un nuovo grafico a dispersione avanti per lato, utilizzare lo strumento ellisse per creare pachytene, diplotene e leptotene, porte spermatociti di zigotene. Una volta disegnati tutti i cancelli, create un nuovo grafico a punti di colore rosso DCV e DCV su scala lineare per applicare il gate for 4C per garantire che le tre popolazioni siano in ordine continuo all'interno del gate. Successivamente, create una nuova area di dispersione in avanti rispetto al plot di densità dell'area backscatter su scala lineare e selezionate la dimensione unificata delle cellule come una popolazione spermatida rotonda pura.
Dopo lo smistamento, le purità rappresentative delle frazioni separate di leptotene, zigotene, pachytene e diplotene spermatociti sono tipicamente tra l'80% e il 90%, come confermato dall'immunostaining SYCP3 e Gamma H2AX. La purezza della fazione spermatida rotonda può essere confermata dalla colorazione del nucleo con DCV in combinazione con la colorazione Sp56 e H1t, ed è anche tipicamente intorno al 90%La vitalità delle popolazioni cellulari isolate è di solito superiore al 95%E le rese totali medie di ogni frazione da un singolo topo adulto sono tipicamente sufficienti per varie analisi a valle. Le cellule ordinate possono essere utilizzate per varie analisi di sequenziamento di nuova generazione per esplorare meglio l'espressione genica e la regolazione durante la spermatogenesi.
