We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Misurazione buffering Potenza in un extracellulare strumento Flux: due varianti NOTA: i calcoli ed i metodi qui descritti sono stati sviluppati utilizzando un extracellulare Flux Analyzer. Per gli altri strumenti, il volume di misura deve essere scalato in modo appropriato. <ol><li> Preparare 0,1 M di serie HCl in acqua utilizzando HCl concentrato (vedi Materiali e attrezzature), secondo le istruzioni del produttore. Nota: Un esempio di calcolo per la preparazione di iniezioni HCl per l&#39;uso in tutte le quattro porte di iniezione è mostrato in Tabella 1: </li></ol><img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tabella 1. consecutive iniezioni HCl in un saggio del flusso extracellulare così. <ol start="2"><li> Preparare diluizioni dello standard HCl nel mezzo da dosare come in tabella 1 per il numero di repliche tecniche che sono carrIED in un piatto, più uno per permettere di errore pipettamento, ad esempio, per quattro repliche tecniche della porta A iniezione, preparare uno stock di (1,1 ml x 5) 0,1 M HCl a (48,9 ml x 5) terreno di coltura. </li><li> Distribuire 50 ml in ciascuna Port A della cartuccia sonda di misura. Ripetere questa procedura per i porti rimanenti B, C e D. </li><li> Eseguire un test flusso extracellulare 10 con un ciclo di calibrazione standard, seguita da due cicli di [2 min mix, 1 min aspettare, e 5 min misura] per ciascuno dei quattro aggiunte di porta (vedere Figura 2). <ol><li> Programmare all&#39;esperimento precedente nel software dello strumento secondo le istruzioni del software. Caricare la cartuccia disposta nella macchina ed eseguire la calibrazione secondo le istruzioni del software. </li><li> Quando viene richiesto dal programma, rimuovere la piastra-calibrante contenente e inserire la piastra contenente terreno di coltura in ciascun pozzetto nello strumento; proseguire il programma. </li></ol></li><li> U<html> cantare la media di 8-10 punti di dati ottenuti allo stato stazionario (tipicamente gli ultimi 8-10 punti) prima e dopo ogni aggiunta porto, calcolare il (cumulativo) differenza di pH (ΔpH) causate da ogni iniezione di acido standard. </li><li> Tracciare ΔpH contro nmol H + contenuta nel volume 7 microlitri intrappolato dalla sonda di misura. La pendenza lineare è il potere di buffering (BP) in mph / pmol H +. </li><li> In alternativa ai punti 1,2-1,3, effettuare le misurazioni ΔpH seguenti un test in cui le porte A, B, e C sono utilizzati per lo svolgimento di un esperimento, seguita da una iniezione di HCl a Port D. Come nella tabella 2, quattro repliche tecniche sono usato per generare ogni punto di una curva standard a 5 punti in 20 pozzi sperimentali (esclusi i pozzi quattro sfondo di correzione della temperatura) della piastra test del flusso extracellulare. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Tabella 2. Single HCl iniezione in un test di flusso extracellulare bene. 2. Misura buffer di alimentazione Uso un misuratore pH esterno NOTA: Per misurare il potere tampone di un supporto tramite una sonda pH esterna, calibrare la sonda a 37 ° C e mantenere questa temperatura per tutti i reagenti durante l&#39;esperimento. <ol><li> Preparare 0,1 M di serie HCl in acqua utilizzando HCl concentrato in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Sonda Warm pH, pH standard, il terreno di coltura il cui potere tampone deve essere misurata, e 0,1 M HCl a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Calibrare sonda pH a 37 ° C in base alle istruzioni del produttore. Mantenere tutti i reagenti a 37 ° C durante tutta la seduta utilizzando una lastrina di calore o bagnomaria. </li><li> Aliquotare 10 ml di terreno di coltura in un piccolo beaker o tubo conico. Monitorare continuamente pH utilizzando una sonda pH immerso. </li><li> Aggiungere 0,1 M HCl al comedice di medie 10-20 aliquote microlitri. <ol><li> Garantire la miscelazione utilizzando un ancoretta o agitando manualmente il contenitore dopo ogni aggiunta di acido. </li><li> Attendere alcuni secondi per la misurazione del pH si stabilizzi, quindi registrare il pH dopo ogni aggiunta. </li><li> Come dimostrato nella tabella 3, fare un numero sufficiente di aggiunte per assicurare calcolo della pendenza preciso e per coprire il ventaglio di pH previsto durante l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol><img alt="Tabella 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tabella 3. Misurazione potere tampone con un pH-metro. I dati rappresentano un tipico esperimento con sei aggiunte 20 microlitri di 0.1 M HCl. <ol start="6"><li> Plot ΔpH contro nmol H + aggiunto per 7 microlitri, dando una pendenza lineare che rappresenta il potere tampone (Figura 1). </li></ol> Figura 1. Determinare potere buffering. Curva standard HCl misurato come in Tabella 1, tabella 2 o (qui) come in tabella 3. La pendenza della curva di interpolazione lineare determina il potere tampone (pH / nmol H + in 7 ml). Ogni punto rappresenta media ± SEM di n = 9 replicati tecnici. <ol start="7"><li> Una volta che il potere di buffering è conosciuto attraverso il metodo 1 o 2 di cui sopra, convertire il segnale ECAR (mph / min) di PPR (pmol H + / min / proteine ​​mg) dividendo ECAR dal potere buffer (BP) (mph / pmol H +) e il ridimensionamento al contenuto proteico di ogni bene: PPR tot (pmol H + / min / mg di proteine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + in 7 ml) / proteine ​​per bene (mg) Equazione 6 </li><li> In alternativa, utilizzare gli stessi esperimenti nel metodos 1 o 2 per calcolare la (BC) valore buffering capacità utilizzata dal software strumento per calcolare automaticamente PPR durante la raccolta dei dati. NOTA: L&#39;utente strumento manuale 12 (pagina 107) fornisce informazioni dettagliate sul calcolo e l&#39;utilizzo della capacità di buffering, dove aC è descritto come BC (mol / L) = moli H + / (ΔpH Volume x tampone (L)) L&#39;equazione 7 NOTA: la capacità tampone come definito nell&#39;equazione 7 può essere calcolato in strumento o sonda pH esterno saggi sopra descritti. La conversione tra potenza buffering e capacità tampone è fatto facilmente (vedi foglio allegato): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + in 7 ml) / 7 ml) Equazione 8 NOTA: Se noto prima di eseguire il test, il potere tampone può essere inserito direttamente nel software dello strumento durante l&#39;installazione sperimentale. </li><li>Applicare questa procedura e calcoli utilizzati in precedenza per molti sistemi tampone convenzionali, come descritto nella precedente pubblicazione 6. NOTA: La tabella 4 elenca il potere e la capacità di buffering buffer di diversi media tradizionali. </li></ol><img alt="Tabella 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tabella 4. potere buffering e capacità tampone di supporto selezionato. 3. Esecuzione di un extracellulare Flux test utilizzando cellule dei mioblasti C2C12 NB Al punto 3.4.3, non sono state osservate differenze riguardo la CO 2 -derived produzione di acido dipende dalla presenza di anidrasi carbonica nella cultura C2C12, suggerendo che la sua presenza non è richiesta per la conversione completa di CO 2 di HCO 3 - + H +. Tuttavia, empiricamente prove in diversi sistemi sperimentali è consigliato prima omitting carbonica. <ol><li> Culture topo C2C12 mioblasti 13 a 37 ° C sotto 95% aria / 5% di CO 2 in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con glucosio 11,1 mM, glutammina 2 mM, 10% v / v di siero fetale bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. </li><li> 24 ore prima del saggio, cellule piastra / seme in 100 ml di terreno di coltura stessa a 20.000 cellule / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti test polistirene extracellulare flusso (vedi Materiali e Metodi) senza ulteriore rivestimento. </li><li> Diluire oligomicina, FCCP, e rotenone più myxothiazol, e HCl (opzionale) a 10 volte la concentrazione finale di Krebs Ringer fosfato HEPES (KRPH) a medio dosaggio (2 mM HEPES, 136 NaCl mm, 2 mm NaH 2 PO 4, 3.7 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 0.1% w / v sieroalbumina bovina grassi-acidi, pH 7,4 a 37 ° C). </li><li> Preparazione delle cellule <ol><li> 30 min prima del test, lavare cellule aderenti tre volte aspirando a gente rimuovere il supporto dal pozzo e poi, lentamente, aggiungendo 500 microlitri KRPH. </li><li> Incubare le cellule dopo il terzo fase di lavaggio a 37 ° C sotto aria (non sotto 5% di CO 2, che altererà il pH di questa coltura privo di bicarbonato). </li><li> All&#39;avvio del test, sostituire KRPH in pozzi con 500 ml KRPH fresco contenente 500 U / ml carbonica e sia il glucosio (10 mm) o unico mezzo, senza alcun supporto aggiuntivo. </li></ol></li><li> Caricamento della cartuccia sensore <ol><li> Dispensare 50 aliquote microlitri di ogni 10x composto preparato al punto 3.3 nei porti della cartuccia di una cartuccia extracellulare flusso sensore come segue (concentrazioni finali di test ben fornite): Porta A: 2 mg / ml oligomicina, Porta B: 0,5 micron FCCP, Port C : 1 mM rotenone, 1 mM myxothiazol, Port D: HCl (se eseguire una calibrazione acido-dosaggio come sopra descritto ed in Tabella 2). NOTA: ai fini della completa inibizione catena respiratoria descritto qui, 1 micron mieixothiazol può essere usato in modo intercambiabile con 1 micron antimicina A. </li></ol></li><li> Extracellulare test di flusso: <ol><li> Eseguire un test di flusso extracellulare standard per determinare il controllo delle vie respiratorie, come descritto nel 10. </li></ol></li></ol> NOTA: Per ogni segmento dell&#39;esperimento, determinare il mix, attendere e tempi di misurazione desiderata, così come il numero di cicli per ogni segmento. NOTA: I dati nella Tabella 5 sono stati raccolti in due cicli di dosaggio di 2 min mix, 1 min aspettare, e 5 min misura per ogni segmento, con tre cicli di dosaggio che si verificano dopo l&#39;aggiunta Port D di diverse quantità di HCl (per la calibrazione del buffer potere come in Tabella 2). <img alt="Tabella 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tabella 5. extracellulare configurazione test di flusso. 4. Gamma di misurazioneng End-point concentrazione di lattato NOTA: Per convalidare il saggio indiretto qui descritto in un sistema diverso, punto di concentrazione di lattato fine alla fine di un esperimento flusso extracellulare può essere determinato direttamente in una piastra a 96 pozzetti convenzionale misurando la velocità iniziale (oltre 2 min) di riduzione NAD + → NADH catalizzata da lattato deidrogenasi, descritta in dettaglio nel nostro precedente pubblicazione 6. Per i dati presentati in Rappresentante dei risultati, il punto finale concentrazione di lattato in pozzetti contenenti glucosio era ~ 40 micron. <ol><li> Preparare medio idrazina 2x: 1 M Tris, 20 mM EDTA, idrazina 400 mM, pH 9,8 a 22 ° C). Immediatamente prima dell&#39;inizio del test, aggiungere NAD + a 4 mM e lattato deidrogenasi (LDH) a 40 U / ml. Tessitura media dosaggio finale (1x): Tris 500 mM, EDTA 10 mM, idrazina 200 mM, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. </li><li> Immediatamente dopo il dosaggio flusso extracellulare, rimuovere il 100ml di terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra di dosaggio flusso extracellulare e trasferimento in un pozzetto di una opaca (nero) piastra a 96 pozzetti. </li><li> Per ogni campione bene, aggiungere 100 microlitri 2x medio idrazina. </li><li> Caricare immediatamente il piatto in un lettore di micropiastre e iniziare a monitorare NADH fluorescenza a 340 nm di eccitazione / 460 nm di emissione. </li><li> Registrare la velocità iniziale per circa 2 minuti. </li><li> Eseguire un esperimento simile a costruire una curva standard tracciando velocità iniziale contro la concentrazione di lattato per le concentrazioni di lattato aggiunto 0-50 micron. </li><li> Calcolare la concentrazione di lattato in ogni sperimentale pozzetto utilizzando la curva standard. </li></ol> 5. Misurare contenuto proteico <ol><li> Rimuovere restante terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra di dosaggio. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con 250 microlitri KRPH senza BSA, facendo attenzione a ridurre al minimo il sloggiare delle cellule dalla superficie ben inferiore. </li><li> Aggiungere 25 microlitri RIPA lisimedio (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v sodio desossicolato, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 a 22 ° C) a ciascun pozzetto della piastra dosaggio. </li><li> Incubare la piastra in ghiaccio per 30 min. </li><li> Agitare piastra su un agitatore a 1200 rpm per 5 min. </li><li> Misurare concentrazione proteica con metodi standard, ad esempio, mediante test BCA, assicurandosi che la composizione del tampone di lisi è compatibile con il metodo di misurazione. Il contenuto proteico nell&#39;esperimento di figura 2 era ~ 4 mg / pozzetto. </li></ol>

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Dr. Shona Mookerjee dichiara che lei non ha interessi finanziari in competizione. Dr. Martin Marca ha consultato per Seahorse Biosciences, che produce strumenti e reagenti utilizzati in questo articolo. Spese di Open Access per questo articolo sono stati pagati dalla Seahorse Biosciences.

Acidificazione extracellulare è un&#39;indicazione facilmente misurabile di cellulari tasso metabolico. Per determinare correttamente il tasso di glicolisi cellulare (come definito dalla produzione di lattato) è fondamentale conoscere la potenza tampone del terreno di coltura, e per convertire le misure di flusso extracellulari di consumo di ossigeno e acidificazione protone tassi di produzione. Eseguendo questo calcolo, l&#39;acidificazione derivante da CO 2 rilasciato nel ciclo dell&#39;acido citrico può essere sottratto, lasciando l&#39;acidificazione che risulta dalla produzione di lattato. Le molteplici modi qui riportati per misurare la potenza buffer per la correzione portano diversi vantaggi e svantaggi. Misura esterna utilizzando una sonda pH è estremamente preciso e riproducibile, ma non può riflettere piccole differenze di rilevamento pH introdotto dai fluorofori contenuti nella piastra di dosaggio, l&#39;aggiunta di composti durante il dosaggio, o la presenza di tegli cellule stesse. L&#39;in-piatto misure di pH affrontare questi problemi, ma anche introdurre i vari livelli di rumore sperimentale. La correzione CO 2 per ECAR consente per la prima volta il calcolo univoca e quantitativa della glicolisi, e rivela variazione contributo respiratoria e glicolitico a ECAR totale durante il corso di un esperimento. Utilizzando Equazione 5 e le misure di OCR, ECAR, e il potere il buffering, glicolisi può essere calcolata utilizzando la semplice foglio di calcolo previsto (Tabella 6). Questo tasso può essere verificato misurazione del lattato post-hoc, se desiderato 6. Nelle cellule dove la via dei pentoso fosfati è molto attivo, l&#39;uso di inibitori pathway come 6-aminonicotinamide può essere utile per isolare glicolisi. Calcolo dei contributi sia di CO 2 - e lattato di derivazione H + dal totale misurato extracellulare acidificazione Rate e ossigeno assorbita bobinaion Tasso è uno strumento prezioso per l&#39;utilizzo dei dati di flusso extracellulari di rendere potenti e quantitativi dichiarazioni circa l&#39;attività metabolica. Utilizzando le procedure qui descritte, incluse varie modifiche per misurare il potere tampone, e ottimizzando l&#39;esperimento flusso extracellulare per le cellule in esame e dati desiderati, il tasso di glicolisi in cellule intatte può essere quantificato in un&#39;ampia gamma di condizioni sperimentali. Questo metodo è limitato alle cellule che possono crescere in coltura aderente sui (o cellule o organelli che possono essere rispettati) una superficie di polistirene. È più affidabile quando cellule coltivate sono omogenei e confluenti, se i dati utili possono essere ottenuti su una gamma di queste condizioni. I calcoli richiedono una certa conoscenza del metabolismo delle cellule, come max H + / O 2 varia da 0,65 a 1,0 per la completa ossidazione di substrati diversi e di più per ossidazione parziale 6, tuttavia, se le cellule sono known per ossidare il glucosio, un valore di 1,0 può essere assunto. Sebbene pertinenti a tutti caratterizzazione metabolica, questo metodo può essere particolarmente utile se utilizzato in sistemi in cui il passaggio tra il metabolismo respiratorio e glicolitico mantenere approvvigionamento ATP cellulare è un fenotipo critica, compresa la caratterizzazione di cellule staminali e cellule tumorali derivate da tumore. Informazioni alterazioni metaboliche controllo in questi ed altri contesti consentirà un maggior grado di sofisticazione e precisione nel disegno sperimentale e l&#39;analisi di questi tipi cellulari.

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di misurare con precisione il tasso di glicolisi delle cellule utilizzando l&#39;analisi del flusso extracellulare. Misurazione quantitativa della glicolisi con acidificazione extracellulare è il punto finale desiderato di molti esperimenti. Tuttavia, il tasso totale di acidificazione extracellulare è la somma di due componenti: acidificazione respiratoria, sotto forma di CO 2 (che idrata di H 2 CO 3 dissocia poi HCO 3 - + H +), e l&#39;acidificazione glicolitico, nella forma di lattato - + H +. I contributi di CO 2 a totale acidificazione extracellulare sono stati fino a poco tempo considerato trascurabile nella piattaforma di misurazione utilizzato qui, l&#39;analizzatore XF24 7. Tuttavia, è chiaro in più di altri sistemi che la CO2 può essere un fattore importante di acidificazione extracellulare 4-5. Molteplici documenti riconoscono questo concontributo, ma non tentare quantificazione diretta delle emissioni di CO 2 -derived 3,8,9 acido. Abbiamo recentemente dimostrato quantitativamente che il CO 2 produzione è una fonte significativa di acidificazione extracellulare in questo sistema 6. Inoltre, anche se ci sono più vie metaboliche che generano CO2 dal catabolismo del glucosio, quelli effettuati da deidrogenasi matrice nel ciclo dell&#39;acido citrico sono i contribuenti travolgente e tutte le altre fonti di generare quantità di CO 2 che si trovano entro l&#39;errore sperimentale 6. Senza correzione per CO 2 produzione, acidificazione extracellulare è quindi un indicatore ambigua di glicolisi e non può essere utilizzato quantitativamente. La nostra precedente pubblicazione evidenzia diversi casi in cui respiratorio CO 2 comprende la massa del segnale totale acidificazione, anche in cellule generalmente creduto per utilizzare principalmente glicolisi 6. Inoltre, larespiratorio CO 2 di acidificazione totale varia ampiamente nel corso di esperimenti comuni profili metabolici, dimostrando che corretto confronto della glicolisi durante le diverse parti di un esperimento richiede correzione per CO 2. Per misurare la glicolisi di celle utilizzando il tasso di acidificazione extracellulare, è necessario convertire variazioni di pH a variazioni totale H + generati, e sottrarre l&#39;acidificazione extracellulare causato da CO 2 rilasciata durante il funzionamento del ciclo dell&#39;acido citrico. Qui, descriviamo un metodo semplice per misurare extracellulare tasso di produzione di protoni (da cambiamenti extracellulari di pH e la forza calibrata tampone del terreno di coltura) e produzione di CO 2 (da cambiamenti extracellulari della concentrazione O 2), e dimostrare come calcolare glicolisi utilizzando queste misurazioni. Questa forza metodo<html> ens l&#39;utilità della misura acidificazione extracellulare utilizzando per calcolare correttamente glicolisi come definito dalla produzione di lattato. Senza correzione per CO respiratoria 2 (o misurazione diretta di lattato), è impossibile stabilire se e in che misura il tasso di acidificazione totale riflette glicolisi, confondendo l&#39;interpretazione degli esperimenti che utilizzano totale acidificazione extracellulare come una misura diretta di produzione di lattato. CALCOLI CO 2 e lattato sono, entro l&#39;errore sperimentale, le uniche due collaboratori di produzione di acido extracellulare, sulla base di esperimenti con le cellule mioblasti 6. Pertanto, il tasso di acidificazione totale extracellulare (PPR, velocità di produzione di protoni) può essere definito come: PPR tot = PPR rispettivamente + PPR GLYC Equazione 1 . _content &quot;&gt; dove tot = totale; resp = respiratorio; GLYC = glicolitico glicolitica PPR è quindi: PPR GLYC = PPR tot - PPR resp Equazione 2 Qui, PPR tot = ECAR tot / BP equazione 3 dove ECAR = tasso di acidificazione extracellulare (mph / min), e BP = potenza di buffering (mph / pmol H + in 7 ml), mentre PPR resp = (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myX) Equazione 4 dove K 1 = costante di equilibrio combinato di CO 2 l&#39;idratazione e la dissociazione di HCO 3 - + H +; max H + / O 2 = °e CO 2 acidificazione -derived per una particolare trasformazione metabolica come completa ossidazione del glucosio 6; OCR = tasso di ossigeno consumo (pmol O 2 / min), e OCR rot / myX = OCR non mitocondriale. Equazione 4 isolati OCR mitocondriale sottraendo qualsiasi OCR non mitocondriale (definito come OCR che è resistente alla respiratoria mitocondriale veleni rotenone e myxothiazol) e rappresenta la massima H + generato per O 2 consumata per ogni substrato (max H + / O 2 ) (vedi 6), nonché la concentrazione di CO 2 dando luogo a H + alla temperatura sperimentale e pH (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1). Per la piena ossidazione del glucosio, dell&#39;ossigeno mitocondriale Consumo Rate (OCR) è esattamente uguale alla velocità di produzione di CO 2. Nel volume confinato test di misurazione del flusso extracellulare, CO 2 prodottid dalla respirazione rimane intrappolata nel terreno di coltura. La maggior parte del intrappolato CO 2 è idratata a H 2 CO 3, che poi dissocia in HCO 3 - + H +. Una piccola frazione rimane disciolto ma non idratata, e un&#39;altra piccola frazione è idratata ma non dissociato, come dettato termodinamicamente dalla costante di equilibrio combinato di CO 2 idratazione e la dissociazione di HCO 3 - + H + a temperatura sperimentale (37 ° C) e pH (~ 7.4). Così, l&#39;equazione completa per il calcolo PPR g sottraendo PPR rispettivamente da PPR tot è: PPR GLYC = ECAR tot / BP - (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myX) Equazione 5 ion questo modo, i tassi di respirazione e glicolisi, così come i loro associati tassi di produzione di ATP, può essere determinata quantitativamente da misure dirette (consumo di ossigeno, acidificazione extracellulare, capacità tampone) e l&#39;importazione o il calcolo di altri valori richiesti (H + / O 2 , P / O, e l&#39;equilibrio costante K 1) 6. L&#39;esperimento descritto qui espande su tecniche standard per l&#39;utilizzo del extracellulare flusso Analyzer come Seahorse XF24 10,11; per altri formati di misura del flusso extracellulare (ad esempio, XF e 96, o XFP), tutti i volumi sottostanti devono essere scalati in modo appropriato. Il potere tampone del terreno di coltura può essere misurata con la costruzione di una curva standard direttamente nella piattaforma flusso extracellulare o separatamente utilizzando una sonda pH calibrata. Qui, tre opzioni per la misurazione buffer dal terreno di coltura di flusso extracellulare sono dati, compreso l&#39;uso di tutti i iniezsulle porte dell&#39;analizzatore flusso extracellulare con pozzetti dei campioni privi di cellule, o con solo l&#39;ultimo di iniezione nella cella contenente pozzetti (sezione 1) o utilizzando una misurazione del pH esterno (sezione 2). Vedere il foglio allegato per l&#39;intero calcolo dei dati di esempio. Per misurare la potenza buffer utilizzando la funzionalità di rilevamento-pH dello strumento di flusso extracellulare, è più sicuro utilizzare i pozzi privi di cellule per minimizzare variazione del segnale. Tuttavia, entro l&#39;errore, non esiste alcuna differenza statistica tra e cellule contenenti pozzetti durante l&#39;esecuzione di questa misura acellulare (dati non mostrati). NOTA: La variazione descritto al punto 1.7 porta il vantaggio di contabilità per eventuali modifiche al buffer conferiti da composti aggiunti o dalla presenza di cellule, con lo svantaggio di segnale rumoroso. Tuttavia, come detto sopra, non state riscontrate differenze significative nel potere tampone calcolata tra la struttura senza cella mostrata in Tabella 1 eil design post-esperimento in Tabella 2, nelle condizioni sperimentali descritte qui. Inoltre, su piccole serie ΔpH (&lt;0,4 unità; sperimentalmente meglio limitate a 0,2 unità), la pendenza lineare, ottenuto riportando Δ mph / pmol H + approssima adeguatamente il rapporto tra la logaritmica ΔpH e [H +]. La pendenza di questa curva standard rappresenta quindi la potenza tampone del terreno di coltura in prova pH / nmol H + in 7 ml, o mpH / pmol H + in 7 ml. Si consiglia di aumentare il potere di buffering media o diminuire la densità delle cellule per i campioni che superano una variazione unitaria di 0,2 pH durante il tempo di misura. Il tempo di misura può essere diminuita, ma ciò potrebbe ridurre il tasso di acidificazione stato stazionario e di introdurre errori nel calcolo del tasso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> La Figura 2 mostra i dati grezzi per un tipico esperimento. Gli ultimi 10 punti di misurazione della registrazione point-to-point di entrambi OCR e pH (ombreggiata barre verticali) sono stati utilizzati per i calcoli. Preoccupazioni iniziali che il valore medio (misura del punto centrale) di ciascun ciclo di test non fornirebbero una risoluzione sufficiente di tasso per un calcolo preciso, in particolare per quanto ci sembrava essere un leggero ritardo tra oltre porto e costante tasso di acidificazione di stato, non sono state confermate, ciò non appare contribuire significativamente all&#39;errore di calcolo (non mostrato). In alternativa, se viene immessa la capacità tampone corretto durante l&#39;installazione sperimentale, PPR può essere letta direttamente dalla lettura di raccolta dei dati dello strumento per la visualizzazione della potenza PPR nel software strumento o nel formato compatibile con PC disponibile come una delle impostazioni di output dei dati. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Rappresentante tracce flusso extracellulari di O 2 e H +. OCR e pH tracce per l&#39;esperimento di esempio nella tabella 5, contenente glucosio 10 mM all&#39;inizio del test. Port D ha avuto diverse concentrazioni di HCl per la calibrazione del potere buffer (non in queste tracce medi). I dati di pubblicazione precedente 6. Ogni punto rappresenta media ± SEM di n = 8 repliche biologiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;analisi dei dati dei risultati rappresentativi Utilizzando il foglio di calcolo indicato nella tabella 6 e ha fornito in allegato, i valori dei dati dei singoli pozzi possono essere inseriti nelle colonne indicate con le intestazioni di colore giallo. Tutte le sei colonne a<html> destra sono calcolati da queste voci. L&#39;esempio nella tabella 6 mostra i calcoli di PPR e PPR resp GLYC usando ECAR e dati OCR da pozzi individuali per le condizioni native, con o senza aggiunta di glucosio, prima di Porto Un&#39;aggiunta di oligomicina. Replicati tecnici su ogni preparato biologico sono normalmente una media di dare singoli valori delle uscite nelle ultime quattro colonne, quindi i dati provenienti da diversi preparati biologici sono mediati con un&#39;adeguata propagazione delle statistiche di errore in BP e di questi quattro valori. <img alt="Tabella 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tabella 6. Calcolo di respiratorie e acidificazione glicolitico. Colonne diretti in giallo indicano i valori da inserire dal calcolo (ad esempio, BP, max H + / O 2), o dalla raccolta dei dati (ad esempio, ECAR tot, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">Cliccate qui per scaricare la tabella come un foglio di calcolo di Excel .</a> Contributi della glicolisi e la respirazione a PPR dopo la correzione La figura 3 mostra l&#39;output grafico dei dati calcolati come nella Tabella 6 per i tassi nativi di acidificazione glicolisi e respiratoria, tassi seguenti oligomicina aggiunta (Porta A), e tassi seguenti FCCP aggiunta (Porta B). Questi dati dimostrano chiaramente come le proporzioni del cambiamento acidificazione respiratorie e glicolitico con la scelta di substrato (glucosio rispetto al controllo (CTL) con nessuno aggiunti) e con lo stato mitocondriale (funzione nativa vs funzione farmacologicamente alterata). &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Figura 3. Proton tasso di produzione (PPR) da fonti glicolitici e respiratorie. PPR da respirazione (porzioni aperti) e glicolisi (porzioni piene) delle cellule C2C12 calcolato con la formula 5 con glucosio aggiunto (tre barre a sinistra) o senza glucosio aggiunto (tre barre a destra). I dati provenienti da 6. Tutti i dati rappresentano media ± SEM di n = 8 repliche biologiche.

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Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.9K Views.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

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Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Ricerca

Biologia

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...