Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave riguardanti la configurazione del percorso metabolico nelle cellule di leucemia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la misurazione del metabolismo delle cellule primarie della leucemia in tempo reale nelle cellule vive. Iniziare diluire un campione di midollo osseo ottenuto da un paziente con leucemia in PBS con un rapporto uno a uno.
Con attenzione, strato sei millilitri del campione diluito di midollo osseo oltre sei millilitri di mezzo gradiente di densità appena preparato in un tubo conico da 15 millilitri e separare le cellule per centrifugazione gradiente densità. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire con cura lo strato di interfaccia delle cellule mononucleari in un nuovo tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di PBS per un lavaggio centrifugato. Quindi, rimostrare il pellet di cellule mononucleari in due millilitri di PBS sterile per il conteggio.
Diluire le cellule a una concentrazione di tre volte 10 fino alle sette cellule per millilitro. E aggiungere un millilitro di cellule a ciascuno dei due contenitori T75 contenenti 20 millilitri di mezzo RPMI per un'incubazione da 16 a 24 ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Nel frattempo, per preparare le piastre per l'analisi del flusso extracellulare, aggiungere 12,5 microlitri di soluzione adesiva cellulare in ogni pozzo di due, otto piastre di analizzatore di flusso extracellulare.
Dopo 20 minuti, aspirare l'adesivo cellulare e lavare ogni bene due volte con 200 microlitri di acqua sterile per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, lasciare le piastre nel cappuccio fino a quando i pozzi sono asciutti. E posizionare la cartuccia del sensore capovolta sul banco del laboratorio.
Separare la piastra di utilità e la cartuccia del sensore dell'analizzatore di flusso. E riempire ogni pozzo della piastra di utilità con 200 microlitri di calibante e ogni fossato intorno all'esterno dei pozzi con 400 microlitri di calibante. Riportare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità che ora contiene il calibrant e posizionare l'assemblaggio della cartuccia in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius senza CO2 durante la notte.
Quindi accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e lasciarlo riscaldare a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, trasferire le cellule dal pallone a tubi conici da 50 millilitri per la centrifugazione. E rimospend i pellet in un millilitro del mezzo sperimentale appropriato per il conteggio.
Rimospendare le cellule a quattro volte 10 alle sei cellule in 400 microlitri di media concentrazione sperimentale. E aggiungere 50 microlitri di cellule nei pozzi da B a G della piastra dell'analizzatore di flusso. E 180 microlitri del mezzo sperimentale in pozzi A e H come pozzi di controllo dello sfondo.
Dopo la centrifugazione aggiungere lentamente e accuratamente 130 microlitri del mezzo sperimentale ai pozzi da B a G.E confermare visivamente l'aderenza stabile delle cellule al fondo di ogni pozzo al microscopio. Quindi riportare la piastra di analisi del flusso all'incubatore umidificato di 37 gradi Celsius senza CO2 per 30 minuti. 20 minuti prima della fine dell'incubazione, caricare i composti nelle apposito porte dell'iniettore della cartuccia secondo il protocollo sperimentale indicato nella tabella.
Quindi impostare l'appropriato programma di analisi del flusso extracellulare. Avviare il programma e sostituire la piastra di calibrant con la piastra di dosaggio quando richiesto. In una prova di stress da glicolisi, viene utilizzato solo mezzo basale in modo che le cellule siano private di sostanze nutritive.
Il primo parametro ottenuto è l'acidificazione basale che dovrebbe riflettere la quantità di glucosio immagazzinata nelle cellule. Dopo la prima iniezione, il tasso di acidificazione extracellulare aumenta man mano che le cellule utilizzano il glucosio e possono fermentare il glucosio in lattato. L'oligomicina A nella seconda iniezione inibisce l'ATP sintasi e quindi indirizza le cellule a produrre ATP principalmente per glicolisi causando un'ulteriore elevazione del tasso di acidificazione extracellulare.
Mentre l'iniezione di 2-Deossi-D-glucosio inibisce completamente la glicolisi e il tasso di acidificazione extracellulare diminuisce. Nella prova di stress mito cellulare, viene utilizzato un mezzo integrato con glutammina e glucosio in modo che le cellule non siano private di tutti i nutrienti. Il parametro di respirazione basale riflette il loro stato metabolico basale.
Dopo la prima iniezione con oligomicina A, le cellule inibiscono la respirazione mitocondriale e passano alla glicolisi che è rappresentata come una diminuzione del tasso di consumo di ossigeno. La seconda e la terza iniezione di FCCP, tuttavia, disaccoppiano la produzione di ATP dalla respirazione in modo che le cellule ora consumino ossigeno a un ritmo massimo. E il tasso di consumo di ossigeno sale al suo valore più alto.
L'ultima iniezione della miscela rotenone e antimicina A inibisce completamente la respirazione mitocondriale diminuendo il tasso di consumo di ossigeno quasi a zero. Durante il tentativo di questa procedura, è importante valutare la percentuale di esplosioni nel campione per garantire che vengano misurati solo i parametri metabolici dei leucemiablasti. Quando si implementa questo metodo, è necessario applicare un'attenta ottimizzazione alle condizioni di coltivazione e alla normalizzazione dei dati.
