I mitocondri forniscono energia cellulare attraverso la fosforilazione ossidativa contribuendo a quasi tutti i processi all'interno della cellula. Di conseguenza, le disfunzioni mitocondriali sono associate a un ampio spettro di malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è la misurazione in tempo reale della bioenergetica mitocondriale mediante il consumo di ossigeno e, quindi, una valutazione accurata del metabolismo energetico cellulare totale.
La respirometria ad alta risoluzione consente una valutazione diretta di ciò che nel sistema di fosforilazione ossidativa sta fallendo, fornendo potenzialmente indizi diagnostici nelle malattie mitocondriali primarie e nelle disfunzioni mitocondriali secondarie associate a molti disturbi. A dimostrare la procedura sarà Ryan Awadhpersad, dottorando nel mio laboratorio. Per iniziare, eseguire la calibrazione dell'ossigeno eseguendo i respirometri in 2,1 millilitri di mezzo respiratorio mitocondriale a 37 gradi Celsius per più di 45 minuti e procedere se la variazione basale è entro quattro picomoli al secondo.
Coltiva cellule HEK293 in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrate con FBS, GlutaMAX, aminoacidi non essenziali, piruvato di sodio e uridina al 10% attivati termicamente in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Il giorno dell'esperimento, raccogliere e contare le cellule e risospescere 2,5 milioni di cellule in 2,5 millilitri di mezzo respiratorio. Per valutare la respirazione di routine, aggiungere 2,3 millilitri di sospensione di cellule medie di respirazione calda alla camera.
Eseguire le camere a 37 gradi Celsius e una velocità di agitazione di 700 RPM. Attendere almeno tre minuti per consentire ai fluidi di degassare, quindi chiudere le camere ruotando il tappo con un movimento rotante. Quindi, aspirare il liquido in eccesso sulla parte superiore del tappo.
Dopo 10 minuti, ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile per registrare la respirazione di routine o di stato I. Per eseguire l'analisi OXPHOS in cellule intatte, aggiungere due microlitri di oligomicina 0,01 millimolare per una concentrazione finale di 10-nanomolari. Titolare FCCP da stock di due millimolari aggiungendo 0,6 microlitri a passi di 0,2 microlitri fino a quando non si osserva alcun aumento della respirazione e la respirazione è disaccoppiata al massimo.
Quindi, aggiungere un microlitro di rotenone monomillolare per una concentrazione finale di 0,5 micromolari. Quindi, aggiungere due microlitri di un milligrammo per millilitro di antimicina per una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Riossigenare la camera allo stesso livello di ossigeno, circa 150 micromolari, sollevando lo stantuffo.
Successivamente, aggiungere cinque microlitri di ascorbato 0,8-molare per una concentrazione finale di due millimolari. Quindi, aggiungere immediatamente cinque microlitri di TMPD 0,2 molare per una concentrazione finale di 0,5 millimolari e valutare l'attività IV complessa. Quando il picco del flusso di ossigeno viene raggiunto con TMPD, aggiungere cinque microlitri o azide quadrimolare per una concentrazione finale di 10 millimolari.
Quindi, continuare la corsa per almeno cinque minuti per analizzare l'auto-ossidazione di TMPD per il calcolo del livello di base IV complesso. Dopo la corsa, raccogliere un millilitro di sospensione del campione da ciascuna camera e centrifugare a 1.000 G per le cellule permeabilizzate o a 20.000 G per il lisato tissutale. Quindi, scartare il surnatante e congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi a valle.
In primo luogo, seminare le cellule in base ai tassi di crescita delle singole linee cellulari. Diluire oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina in tre microlitri di mezzo di saggio a una concentrazione finale di 1,5 micromolare, 1,125 micromolare e un micromolare, rispettivamente. Successivamente, riempili in porte separate.
Osservare le porte di iniezione per garantire un caricamento uniforme dei campioni. Accendere il sistema basato su micropiastra e il computer ed equilibrarli a 37 gradi Celsius per almeno tre ore. Il giorno del test basato su micropiastre, verificare la confluenza della piastra di coltura cellulare, la morfologia delle cellule e assicurarsi che i pozzetti di fondo siano vuoti.
Quindi, rimuovere tutto tranne 20 microlitri del terreno di coltura da ciascun pozzo. Quindi, lavare ogni pozzetto con 90 microlitri di mezzo di saggio e aggiungere 100 microlitri di mezzo di saggio per ottenere un volume finale fino a 120 microlitri. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'incubatrice senza anidride carbonica per 60 minuti.
Dopo aver recuperato la piastra dall'incubatrice, rimuovere il coperchio e posizionare la micropiastra nella fessura. Fare clic su Continua per avviare la corsa. Al termine della corsa, estrarre la piastra e rimuovere il mezzo di analisi rimanente senza disturbare le cellule.
Quindi, congelare l'intera piastra a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver eseguito gli esperimenti di permeabilizzazione e respirazione della digitonina, sono state registrate tracce di consumo di ossigeno grezzo di cellule HEK293 wild-type e cellule HEK293 con un knockout genico mediato da CRISPR con conseguente carenza multipla di OXPHOS. Sono state ottenute tracce di consumo di ossigeno normalizzate dall'input di cellule sovrapposte.
CRISPR knockout 1 mostra una respirazione compromessa e CRISPR knockout 2 non mostra respirazione rispetto al wild-type quando normalizzato al numero di cellule. Le quantità proteiche sono state quantificate e i valori respiratori sono stati normalizzati alla quantità proteica al fine di determinare i valori assoluti degli stati respiratori e i rispettivi rapporti di controllo del flusso. I tassi di acidificazione extracellulare sono stati trovati per aumentare per il deficit di OXPHOS in CRISPR knockout 2, suggerendo la compensazione del deficit di fosforilazione ossidativa mitocondriale nelle cellule HEK293 attraverso l'aumento della glicolisi.
Inoltre, i valori respiratori sono stati determinati in presenza di oligomicina, FCCP e rotenone e i valori ottenuti sono stati normalizzati alla quantità proteica. Sono state studiate tracce di consumo di ossigeno normalizzate da proteine di cellule HEK293 wild-type e cellule HEK293 con deficit di traduzione mitocondriale mediata da CRISPR che causano una carenza multipla di OXPHOS. Sono state ottenute tracce di consumo di ossigeno normalizzate dal tessuto umido del cervelletto di topo e del muscolo soleo del topo.
I muscoli del soleo mostrano una capacità di respirazione e OXPHOS tre volte superiore rispetto al cervelletto. Con la respirometria a camera, è importante lavorare velocemente, poiché la funzione mitocondriale diminuirà nel momento in cui raccogli i tuoi campioni e con la respirometria basata su piastra, è fondamentale acquisire una densità di semina ottimale per ridurre al minimo la variabilità. Per ulteriori analisi, è possibile quantificare le proteine o immuno-blotting.
Ciò potrebbe determinare se un'alterazione della funzione respiratoria mitocondriale fosse dovuta all'abbondanza di complessi OXPHOS o alla quantità mitocondriale. Già un secolo fa, le cellule tumorali sono state trovate per eseguire la glicolisi anaerobica oltre all'OXPHOS mitocondriale. Ciò sottolinea la necessità di analizzare la bioenergetica mitocondriale.
Qui abbiamo dimostrato due respirometri considerati il gold standard di oggi.
