Sebbene ci siano stati studi sulla perdita dell'udito indotta dal rumore, nessuno ha registrato il metodo in modo così dettagliato, rendendo questa una procedura importante. Questo metodo ha effettivamente causato la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e osserva i cambiamenti effettivi nella soglia uditiva da parte di ABR. Un modello animale di perdita dell'udito indotta dal rumore è utile per gli scienziati per comprendere a fondo il meccanismo della perdita dell'udito indotta dal rumore e successivamente ottimizzare le strategie di trattamento corrispondenti.
A dimostrare la procedura sarà Dian-Shiue Lee, uno studente di grande talento del mio laboratorio. Per preparare la gabbia per i topi sperimentali, utilizzare una gabbia trappola per topi e tagliare quattro pezzi di pannelli di plastica ondulata in dimensioni appropriate, facendoli entrare nella gabbia. Per evitare che i topi vengano tagliati con i piedi dalla griglia della rete, posizionare due dei pezzi rispettivamente sul lato inferiore e sul lato posteriore.
Posizionare gli altri due pezzi perpendicolarmente interconnessi tra loro, per dividere lo spazio all'interno della gabbia in quarti Aprire il software applicativo CLIO. Spostare il cursore sull'icona dell'altoparlante e fare clic su TwoSin. Immettere e modificare il valore di Frequenza da 1 a 1.000 hertz, Frequenza da 2 a 6.000 hertz, quindi fare clic su OK per avviare la riproduzione del suono.
Nella scheda Leq, modificare dBV in dBSPL. Dopo aver impostato l'ora sull'interfaccia del software, fare clic sul pulsante triangolo verde per riprodurre il suono. Posizionare un microfono davanti all'altoparlante a una distanza di 8,5 centimetri per calibrare il livello di rumore.
Regolare il livello di rumore a 125 decibel SPL-A e monitorare continuamente per almeno tre minuti per assicurarsi che il livello di rumore sia sufficientemente stabilizzato. Utilizzare un generatore, un analizzatore e un amplificatore per creare e controllare il rumore. Metti quattro topi maschi C57 neri 6J nella gabbia, uno per ogni trimestre, per l'esposizione al rumore.
Assegna in modo casuale i topi a ciascun trimestre durante l'esposizione al rumore. Posizionare un microfono sulla parte superiore della gabbia per monitorare il livello di rumore durante l'esposizione al rumore. Posiziona la gabbia davanti all'altoparlante all'interno di una scatola insonorizzata, assicurandoti che l'altoparlante sia posizionato a 8,5 centimetri di distanza dalla gabbia.
Esporre i topi al rumore a frequenze di un kilohertz e sei kilohertz continuamente per sei ore al giorno, per cinque giorni consecutivi. Misurare le soglie uditive dei topi al 6 ° e 13 ° giorno misurando l'ABR. Utilizzare un sistema di test ABR commerciale, specificamente progettato per piccoli animali per le misurazioni ABR, e mantenere l'animale in anestesia generale.
Posizionare elettrodi per ago subdermici da 12 millimetri sul vertice dietro il padiglione auricolare sinistro e indietro vicino alla coda, per misurare la soglia uditiva. Dopo aver posizionato l'altoparlante a un centimetro di distanza dall'orecchio sinistro dell'animale, presenta stimoli acustici utilizzando l'altoparlante. Scegli Onda sinusoidale per gli stimoli e 10 k per la scala della finestra.
Ruotare la manopola della frequenza per ottenere la frequenza desiderata degli stimoli acustici. Regolare l'intensità dello stimolo ruotando la manopola AMLP sul generatore di funzioni. Ottenere l'intensità dello stimolo desiderata ruotando la manopola AMLP su una tensione appropriata calcolata dalla calibrazione.
Raccogli le misurazioni ABR sotto una serie di intensità di stimolo da 10 a 100 decibel SPL, con una dimensione del passo di 10 decibel. Contrassegnare il livello minimo di intensità dello stimolo che potrebbe dare origine a un'onda V riconoscibile come soglia ABR. Sacrifica i topi dopo le misurazioni ABR e raccogli le coclee dai topi eutanasiati.
Subito dopo aver raccolto i tessuti, immergerli in formaldeide al 10% per la fissazione e lasciarli riposare per almeno otto ore a quattro gradi Celsius. Utilizzare EDTA per la decalcificazione, come descritto nel testo. Posizionare le coclee in una capsula di Petri piena di PBS.
Per la colorazione dei tessuti, tagliare l'organo a forma di spirale di Corti, o OC, in tre sezioni: la svolta basale, la svolta centrale e la svolta apicale. Sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento da 8x a 35x, rimuovere le strutture ossee che includono vestiboli di scala, timpani di scala e modiolo delle coclee decalcificate e ottenere i tessuti molli, incluso l'OC. Un aumento significativo della soglia uditiva è stato osservato a 12 kilohertz, 24 kilohertz e 32 kilohertz un giorno dopo l'esposizione al rumore. Il recupero parziale dell'udito si è verificato una settimana dopo l'esposizione al rumore, ma le soglie uditive erano ancora elevate di oltre 30 decibel a tutte le frequenze rispetto ai gruppi di controllo.
In questo studio, l'udito era più danneggiato alle alte frequenze. Una differenza significativa è stata osservata nella soglia uditiva tra il gruppo di controllo e il gruppo sperimentale sia al 6 ° che al 13 ° giorno, a 12 kilohertz e 32 kilohertz. Una perdita di cellule ciliate esterne è stata costantemente osservata nelle immagini microscopiche acquisite dai topi NIHL, rispetto a quelle dei topi di controllo.
Mentre le cellule ciliate interne sono rimaste intatte in tutte le immagini, le cellule ciliate esterne nei giri basali e medi dell'OC sono state gravemente danneggiate. Al contrario, le cellule ciliate esterne nella curva apicale erano quasi intatte. Il passo più importante in questo protocollo include l'esposizione al rumore, la misurazione ABI, la raccolta della coclea.
Questa procedura può essere applicata per studiare l'effetto dell'esposizione al rumore a diverse frequenze sulla perdita dell'udito utilizzando vari tipi di suono.
