Questo lavoro è stato supportato da borse di ricerca (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) della National Research Foundation (NRF) della Corea e del Fondo di ricerca universitaria Hallym.

Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgono topi ICR sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Yonsei University presso il Wonju College of Medicine. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico della World Medical Association. In questo protocollo, i topi ICR in gravidanza sono stati tenuti in un ciclo chiaro / scuro di 12/12 h con libero accesso a cibo e acqua.
1. Dissezione delle cocche
<ol><li>Sterilizzare la cappa di coltura del tessuto di flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per ~ 30 minuti e spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo prima dell'uso. Lasciare asciugare le superfici.</li>
	<li>Posizionare gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per 10 minuti e asciugare prima dell'uso.</li>
	<li>Utilizzare una lama operativa per decapitare topi postnatali di 3-4 giorni (Figura 2A).</li>
	<li>Posizionare il cranio sotto uno stereomicroscopio nella cappa di flusso laminare e immergere il tessuto in etanolo al 70%.</li>
	<li>Immergere rapidamente il tessuto nella soluzione di dissezione tissutale (1x soluzione di sale bilanciato di Hank, 1 mM HEPES) per rimuovere l'etanolo.</li>
	<li>Tagliare l'altura del cranio con una lama chirurgica(Figura 2B,C).</li>
	<li>Esporre il cranio tirando la pelle anteriormente e tagliando il canale uditivo esterno dell'orecchio (Figura 2D).</li>
	<li>Tagliare dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio attraverso la linea degli occhi (Figura 2E).</li>
	<li>Aprire il cranio e rimuovere ilencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico con forcep smussate (Figura 2F,G).</li>
	<li>Utilizzando micro forcep, separare i coclea dall'osso temporale (Figura 2H).</li>
	<li>Trasferire le cocche in una piastra di Petri contenente soluzione di dissezione tissutale.</li>
	<li>Sezionare con cura tutta la capsula otica cocleare, lasciando solo il tessuto molle cocleare interno(Figura 2I,J).</li>
	<li>Tenere il modiolo delle coclee con le flessori e il condotto cocleare con un'altra coppia di forcelle e separare lentamente i due tessuti (Figura 2K).</li>
	<li>Rimuovere la vascolarizzazione della striata e la membrana tectoriale staccandole delicatamente(Figura 2L,M).</li>
	<li>Posizionare un coverslip di plastica sterilizzato in una nuova soluzione di dissezione tissutale, quindi posizionare l'organo di Corti su un coverslip di 9 mm di diametro, assicurandosi che la membrana basilare sia rivolta verso il basso(Figura 2N-P).</li>
	<li>Immobilizzare il tessuto premendo la membrana del Reissner e il tessuto di modiolo rimanente sul copriletto con pinze(Figura 2N-P).</li>
	<li>Trasferire il copriletto con il tessuto incorporato al centro di un piatto confocale di 35 mm di diametro.</li>
	<li>Posizionare il cilindro di clonazione del vetro sul piatto, con l'espianto cocleare posizionato al centro del piatto, e aggiungere 100 μL di mezzo di coltura di espianto (DMEM/F12, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di integratore N2, ampicillina (10 μg/mL))10 all'interno del cilindro(Figura 2Q).</li>
	<li>Piastra 5 × 103 cellule di MSC con proteina fluorescente verde derivata dal midollo osseo del topo (GFP) in 2 mL di mezzo di coltura (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% supplemento N2, 10 μg/mL di ampicillina) al di fuori del cilindro divetro (Figura 2R).<ol>
<li>Quando gli MBC sono confluenti all'80-90%, passare loro staccandoli con acido tetraacetico tripsideina-etilendiammina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire con cura il piatto confocale in un incubatore umidificato e incubare durante la notte a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.</li>
	<li>Aspirare tutto il mezzo all'interno e all'esterno del cilindro, quindi rimuovere il cilindro di vetro dal piatto confocale.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di mezzo di coltura fresco al piatto confocale e incubare il piatto di coltura tissutale in un incubatore umidificato fino a quando non è pronto per l'analisi.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> Figura 2. Dissezione di una coclea di topo e cocultura dell'organo di Corti e MSC. (A) Decapitazione del topo, (B) e (C) dissezione saligittale mediana della testa, (D) e(E) dissezione coronale del cervello, (F) e (G) rimozione del cervello e dell'osso temporale, (H) coclea, (I) rimozione della parete cocleare ossea, (J) isolamento della coclea, (K) separazione del condotto cocleare dal modiolo, (L) separazione della vascolarizzazione della striata (SV) e legamento a spirale (SL) dall'organo di Corti, (M) rimozione della membrana tectoriale, (N-P) fissazione della coccina su un foglietto di copertura di plastica, (Q) posizione di coverslip e cilindro di vetro nella piastra confocale,(R)inoculazione di MSC. Barra in scala bianca (A-E) = 1 cm; barra di scala arancione (F, G, P) e gialla (H,I) = 1 mm; barra in scala verde (J-O) = 0,5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">mm.</a>
2. Imaging time-lapse
<ol><li>Per gli esperimenti qui presentati, utilizzare un sistema di microscopia confocale con un sistema di incubazione superiore dello stadio.</li>
	<li>Accendere il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer.</li>
	<li>Impostare le condizioni dell'incubatore stage-top posto sul palco del microscopio confocale a 37 °C e al 5% di atmosfera di CO2.</li>
	<li>Posizionare il piatto campione sul recipiente di fissaggio del piatto, coprire con il coperchio di fissaggio del piatto e chiudere la camera con il coperchio del riscaldatore superiore.</li>
	<li>Regola lo zoom e lo stato attivo per localizzare l'organo di Corti e MSC nel campo visivo.</li>
	<li>Aprire il software di elaborazione delle immagini. Nell'opzione di individuazione selezionare un obiettivo Plan-Apochromat 20x (apertura numerica 0.8) e una superficie di ritaglio 0,5x.</li>
	<li>In Acquisizionefare clic su configurazione intelligente e selezionare EGFP.</li>
	<li>Aprire la linguetta del canale in Acquisizionee impostare la potenza laser su 0,2%, il foro stenopeica a 44 μm, il guadagno principale a 750 Ve il guadagno digitale su 1,0.</li>
	<li>Fare clic su ESID in fase di configurazione dell'imaging e impostare il guadagno ESID su 4 e il guadagno digitale su 7.5. </li>
	<li>Clicca su Tessere e palo per produrre 210 tessere.</li>
	<li>Aprire la strategia focus e selezionare la modalità messa a fuoco.</li>
	<li>In serie temporaliimpostare la durata su 24 h e l'intervallo su 10 min.</li>
	<li>In Acquisizioneimpostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel, la velocità di scansione su 8, la direzione in bidirezionale, la media su 4x e i bit per pixel su 16.</li>
	<li>Clicca sull'esperimento iniziale per iniziare l'esperimento.</li>
</ol>3. Modifica del file di immagine
<ol><li>In elaborazionefare clic su cucituree impostare la sovrapposizione minima sul 5% e il passaggio massimo al 10%.</li>
	<li>Fare clic sull'esportazionedei film , impostare uncompressoe impostare la velocità su 7.5.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Aspirare il mezzo con attenzione e lavare il campione due volte con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per 5 minuti.</li>
	<li>Fissare il campione con formalina al 4% in PBS per 15 minuti e lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Permeabilizzare il campione nello 0,1% di Tritone X-100 in PBS per 10 minuti e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 250 μL di reagente phalloidin-iFluor 647 (diluizione 1:1000 in PBS) e incubare il campione per 1 h a temperatura ambiente sullo shaker.</li>
	<li>Lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Trasferire il coverslip sullo scivolo di vetro e aggiungere 2 gocce di soluzione di montaggio.</li>
	<li>Posizionare delicatamente una coverlip sullo scivolo.</li>
	<li>Sigillare il copripago con smalto chiaro e conservare a 4 °C al buio fino a quando non si osservano le cellule.</li>
	<li>Immagina la diapositiva usando un microscopio confocale con un filtro appropriato a eccitazione/emissione (Ex/Em)=650/665 nm per la filloidina e a Ex/Em=488/507 nm per EGFP.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hearing+loss+prevention.">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair.">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Uder, C., Br&#252;ckner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MSC+from+selected+species:+Features+and+applications.">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li><li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells:+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data.">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li><li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+homing:+Mechanisms+and+strategies+for+improvement.">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li><li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction:+a+systemic+review+with+meta-analysis.">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury.">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cochlea:+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation.">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li><li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes.">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li><li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients.">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li><li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tissue+regeneration:+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment.">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il trapianto di MBC in siti danneggiati per promuovere la rigenerazione delle cellule danneggiate è stato ampiamente studiato e l'effetto terapeutico è evidente. Il trapianto e la successiva differenziazione dei CSC sono stati segnalati per ripristinare l'udito nei ratti con perdita dell'udito indotta da acido 3-nitropropionico13. Sebbene Lee et al. Fino a poco tempo fa, quasi 12 esperimenti sono stati condotti per ripristinare l'udito nel modello di roditore mediante trapianto MSC. Sebbene il risultato non sia chiaro a causa dell'eterogeneità, vi è qualche indicazione che i CSC possano promuovere l'udito.
Vari fattori di crescita e chemiochine legati alla chemioa attrazione sono coinvolti nella migrazione delle cellule staminali trapiantate verso aree danneggiate, indipendentemente dall'eterogeneità o dall'omogeneità15. Le chemiochine sono regolatori chiave della migrazione cellulare per l'omeostasi tissutale, le risposte immunitarie e la guarigione delle ferite. La chemioa attrazione indotta dalla chemiochina in vivo potrebbe non funzionare allo stesso modo in vitro a causa delle differenze tra condizioni sperimentali in vivo e in vitro. Sebbene le condizioni sperimentali in vitro abbiano i loro limiti, è molto difficile condurre studi in vivo per promuovere una migrazione, un reclutamento e una rigenerazione efficienti dellecellule 16.
Sebbene il monitoraggio dei CSC trapiantati per il ripristino dell'udito sia importante nella ricerca sulla medicina rigenerativa, gli esperimenti in vivo, specialmente quelli che coinvolgono l'udito, sono ad alta intensità di lavoro nella maggior parte dei casi e sono quindi estremamente difficili da eseguire con campioni di grandi dimensioni. Quindi, l'omogeneità dei risultati è bassa e la distorsione è grave. Pertanto, sarebbe efficiente studiare prima tali eventi basati sulla migrazione in condizioni in vitro. La maggior parte degli studi in vitro sulla migrazione cellulare sono stati eseguiti utilizzando transwell o metodi di guarigione delle ferite.
È stato istituito un metodo di coincubazione per l'espianto delle cocleae con i CSC per tracciare le cellule staminali migratorie, che riconoscono i siti di lesione e si muovono verso di esse. La maggior parte degli studi ha utilizzato un metodo per attaccare un organo di Corti su coverlips di vetro rivestiti con β-mercaptoetanolo dopo l'espianto. Sebbene lo stesso metodo sia stato utilizzato qui, era difficile esaminare i tessuti perché spesso si staccavano o rotolavano dal copripazzo. Pertanto, è stato eseguito un nuovo studio per facilitare il monitoraggio del tessuto. In primo luogo, un organo di Corti è stato posto su un coverslip di plastica, e poi il tessuto è stato immobilizzato sul copripazzo premendo la parte rimanente della membrana del Reissner generata durante la dissezione usando le forcelle.
Ciò ha permesso l'attacco stabile dell'organo di Corti al coverslip in modo che un'immagine potesse essere acquisita con successo con microscopia confocale. Sebbene il metodo di coltura tissutale qui presentato sia un risparmio di tempo e poco costoso, lo sviluppo della competenza nella dissezione richiede del tempo. I metodi noti di coltura tissutale comprendono l'attacco del tessuto rivestendo la coverslip con poli-L-ornitina e laminina16; l'applicazione di inserti di coltura cellulare organotipici che non richiedono materiali adesivi o dirivestimento 17 eliminando così la necessità di sostanze adesive, il che riduce i danni all'espianto; e utilizzando un adesivo tissutale composto da proteine estratte dalle cozze marine10. Questo protocollo non richiede né materiali di rivestimento né membrane organotipiche né adesivi tissutali; è sufficiente un copripasto in plastica economico. Immagini migliori possono essere acquisite se viene considerata un'area di 8 mm x 8 mm insieme a una pila Z dello spessore del tessuto dell'organo di Corti. Considerando la grande quantità di dati da archiviare e il tempo appropriato per la perdita di tempo, sono state acquisite immagini di movimento cellulare intero, concentrandosi sugli MSC anziché sull'organo di Corti.
I risultati mostrati nella figura 4 sembrano suggerire che sia l'organo di Corti che gli MSC possono essere visualizzati come immagini video chiare quando le immagini scattate sono lunghe 2 mm e lo Z-stack è combinato con un time lapse. Qui, sebbene sia stato eseguito un esperimento di co-coltura con MSC e un espianto, questa impostazione potrebbe essere applicata a diversi tipi di cellule o condizioni per studi futuri. Ad esempio, aiuterà ad applicare questo protocollo per esaminare gli effetti di droghe o esosomi che proteggono i danni della coclea. Le cellule staminali embrionali (ESC) o le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) possono rigenerarsi funzionalmente e morfologicamente in cellule simili a cellule ciliate meccanosensibili18. Pertanto, questo protocollo può essere applicato per studiare la differenziazione di iPSC o ESC in cellule ciliate uditivi o cellule di supporto. Questo metodo ex vivo può aiutare nella medicina rigenerativa a ripristinare l'udito.

La perdita dell'udito può verificarsi congenitamente o può essere causata progressivamente da diversi fattori, tra cui invecchiamento, farmaci e rumore. La perdita dell'udito è spesso difficile da trattare perché è molto difficile ripristinare la funzione compromessa una volta che le cellule ciliate responsabili dell'udito sonodanneggiate 1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che 461 milioni di persone in tutto il mondo abbiano ipoacusia, che rappresenta il 6,1% della popolazione mondiale. Di coloro che hanno ipoacusia, il 93% sono adulti e il 7% sono bambini.
Sono stati tentati diversi approcci per trattare la perdita dell'udito; in particolare, un approccio di rigenerazione che utilizza i CTC è emerso come un trattamento promettente. Quando il tessuto è danneggiato, i CSC vengono naturalmente rilasciati nel sistema circolatorio e migrano verso il sito della lesione dove secernono varie molecole per formare un microambiente che promuove larigenerazione 2. Pertanto, è importante sviluppare un metodo per trattare i tessuti danneggiati attraverso la migrazione dei CBC impiantati esternamente agli organi bersaglio e la loro successiva secrezione di molecole che causano una potente regolazione immunitaria, angiogenesi e anti-apoptosi per migliorare il ripristino della funzionecellulare danneggiata 3,4,5.
Il processo di homing in cui i CSC migrano verso tessuti danneggiati può essere l'ostacolo più importante da superare. Gli MSC hanno un meccanismo sistemico di homing con passaggi sequenziali di tethering/rolling, attivazione, arresto, trasmigrazione/diapedesi e migrazione6,7,8. Attualmente sono in corso sforzi per individuare modi per migliorare questi passaggi. Varie strategie, tra cui la modificazione genetica, l'ingegneria delle superfici cellulari, l'adescamento in vitro e la guida magnetica,sono state testate 6,7. Inoltre, sono stati fatti diversi tentativi per promuovere la protezione e la rigenerazione delle cellule ciliate uditivi affinando i CTC nel sito della coclea danneggiata. Tuttavia, tenere traccia dei CSC in vivo richiede molto tempo e manodopera e richiede competenze altamente specializzate9.
Per risolvere questo problema, è stato messo a punto un metodo per osservare l'affinamento dei CFC nella coclizione attraverso la microscopia confocale time-lapse che fotografa la migrazione delle cellule per diverse ore (Figura 1). È stato sviluppato all'inizio del XX secoloed è recentemente diventato un potente strumento per studiare la migrazione di cellule specifiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 1: Astratto grafico. (A) Dopo che l'organo sezionato di Corti è stato aderito su un copripasta di plastica con forcep, il copripasta viene posizionato su un piatto microscopico confocale con fondo di vetro da 35 mm e (B) il cilindro di vetro è posizionato. (C) Dopo aver riempito l'interno del cilindro di vetro con CCC con etichetta GFP media,(D)con mezzo vengono aggiunti con attenzione all'esterno del cilindro. (E) Dopo l'incubazione durante la notte,(F)il cilindro di vetro viene rimosso e le immagini vengono scattate con un microscopio confocale. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC = cellule staminali mesenchimali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Buffer</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalin</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>confocal dish</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>coverslip</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsheild with DAPI</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 Reagent</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Stage Top Incubator</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP</td><td>cyagen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro time-lapse live-cell imaging to explore cell migration toward the organ of corti

Per studiare gli effetti delle cellule staminali mesenchimali (CSC) sulla rigenerazione e sul trattamento cellulare, questo metodo tiene traccia della migrazione MSC e dei cambiamenti morfologici dopo la co-coltura con epitelio cocleare. L'organo di Corti è stato immobilizzato su un coverslip di plastica premendo una porzione della membrana del Reissner generata durante la dissezione. I CSC confinati da un cilindro di vetro migrarono verso l'epitelio cocleare quando il cilindro fu rimosso. La loro localizzazione predominante è stata osservata nel modiolo dell'organo di Corti, allineato in una direzione simile a quella delle fibre nervose. Tuttavia, alcuni CSC erano localizzati nell'area limbus e mostravano una forma allungata orizzontalmente. Inoltre, la migrazione nell'area delle cellule cieche è stata aumentata e la morfologia dei CSC è cambiata in varie forme dopo il trattamento con kanamicina. In conclusione, i risultati di questo studio indicano che la cocultura dei CSC con epitelio cocleare sarà utile per lo sviluppo di terapie attraverso il trapianto cellulare e per studi di rigenerazione cellulare in grado di esaminare varie condizioni e fattori.

La migrazione in vitro dei CSC in modalità tridimensionale è stata valutata da un sistema Transwell o dal tradizionale metodo di guarigione delle ferite per osservare la migrazione in modalità bidimensionale (2D)11. L'organo di Corti è una struttura complessa composta da varie cellule come cellule boettcher, cellule claudio, cellule deiters, cellule di pilastro, cellule di Hensen, cellule ciliate esterne, cellule ciliate interne, fibre nervose, membrana basiolare e lamina reticolare12. Quando i CSC vengono trapiantati in tessuti composti da cellule così complesse, l'uso della tecnologia per accertare dove le cellule vengono reclutate e stabilizzate è fondamentale per comprendere il meccanismo della terapia cellulare e della rigenerazione utilizzando i CBC. Inoltre, per determinare come i CSC sono localizzati in presenza o assenza di danni, un metodo 2D come un metodo di guarigione delle ferite è più adatto di un sistema Transwell in cui le cellule si muovono casualmente verso il basso in una direzione.
In questo studio, il percorso bidimensionale dei CSC è stato tracciato in un metodo di guarigione delle ferite semplicemente usando un cilindro di vetro come barriera tra i CSC e l'organo di Corti e rimuovendo il cilindro dopo che i CSC sono stati attaccati. Quando l'organo di Corti è stato coltivato, i fibroblasti sono cresciuti molto rapidamente verso l'esterno dalle cellule ciliate esterne presenti nello strato più esterno (Figura 3, Video 1). Pertanto, la maggior parte dei CSC etichettati GFP sembrava essere spinta fuori dai fibroblasti in rapida crescita (Video 1). Tuttavia, alcuni MSC etichettati GFP penetrarono lo strato di fibroblasti e migrarono con successo all'organo di Corti (Figura 3, Video 1).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig03.jpg"> Figura 3. Immagine confocale dell'organo dei CBC con etichetta Corti e GFP. Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 4 ore di incubazione, sono state eseguite fissazioni e colorazioni. Barra di scala =100 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC: cellule staminali mesenchimali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Microscopia confocale time-lapse dell'organo dei CBC etichettati Corti e GFP. Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 4 ore di incubazione, sono state eseguite fissazioni e colorazioni. Barra di scala =100 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC: cellule staminali mesenchimali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/Video%20JoVE.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
I risultati di 72 ore di incubazione hanno mostrato che i CSC migravano all'organo di Corti ed erano principalmente localizzati nel modiolo e nell'area in cui venivano raccolte le fibre nervose cocleari separate dal modiolo; la morfologia dei CSC è stata alterata a una forma radiale simile a quella delle fibre nervose (Figura 4B). Curiosamente, le cellule sono state trasformate in una forma lineare lungo la linea limbus piuttosto che nell'area delle cellule ciliate(Figura 4E,vedi freccia). Sebbene le estremità apicali e basali dell'organo di Corti siano state combinate per impedire ai CSC di spostarsi sul lato mediale della membrana basiolare, i CSC sono stati in grado di migrare e crescere nell'area di raccolta delle fibre nervose penetrando nei vari strati cellulari e barriere fisiche(Figura 4E). Quando i danni alle cellule ciliate sono stati indotti dal trattamento con 1 mM di kanamicina per 16 ore e le cellule sono state coltivate per altre 72 ore dopo la rimozione della kanamicina, i CSC sono stati localizzati non solo nel modiolo, ma anche nelle cellule ciliate esterne(Figura 4C,D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig4v2.jpg"> Figura 4. Immagini confocali dell'organo dei CBC con etichetta Corti e GFP. (A) Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 16 ore di incubazione, è stata scattata un'immagine dopo la fissazione e la colorazione. La barra di scala =200 μm. (B) I CSC erano distribuiti prevalentemente nell'area del modiolo, barra di scala =20 μm. Dopo la rimozione del cilindro di vetro dal piatto, le cellule sono state ulteriormente incubate con kanamicina da 1,0 mM per 16 ore, coltivate con mezzo privo di kanamicina per 72 ore, e quindi fissate e macchiate. Immagini della regione esterna delle cellule cieche (C), barra di scala= 20 μm; (D) regione di modiolo, barra di scala= 50 μm; e (E) cochlea intera, barra di scala= 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questi risultati indicano che il sistema sperimentale dimostrato in questo studio sarebbe un utile strumento di prova per lo sviluppo di strategie terapeutiche cellulari utilizzando i CSC e può essere applicato specificamente allo studio della perdita dell'udito causata da vari fattori.

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In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

in-vitro-time-lapse-live-cell-imaging-to-explore-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K Views.  Yonsei University Wonju College of Medicine. In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Ricerca

Bioingegneria

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Neuroscienze

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biologia dello sviluppo

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

Riepilogo

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Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

analizzare

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

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Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando

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