D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

Nota: Tappe 1 e 2 avvengono prima del giorno delle immagini; garantire tutti i media e gli integratori da utilizzare prima o il giorno delle immagini sono equilibrate. Equilibration è ottenuta attraverso il riscaldamento dei media e integratori a 37 ° C in un incubatore impostato a 5% di CO 2. Tutte le fasi di placcatura lavoro coltura cellulare e coprioggetto avvengono in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare. Trasfezione 1. cella <ol><li> Trasfezione le cellule T per essere ripreso 24 ore prima che l&#39;esperimento con un plasmide codificante una fusione fluorescente costrutto per l&#39;etichettatura GFP-F actina e di imaging. Nota: Le cellule devono essere suddivisi 24 ore prima della trasfezione (48 ore prima di imaging) per assicurare cellule sono in salute ottimale e nella loro fase di crescita logaritmica. <ol><li> Mettere 5 ml di RPMI supplemento (RPMI 1640 più il 10% FBS e 1% Pen-Strep (opzionale)) in un unico pozzo di un 6-pozzetti nell&#39;incubatore per equilibrare. </li><li> Pellet 2 x 10 7 cellule T cultorato a 37 ° C + 5% di CO 2 in RPMI integratore utilizzando un tubo centrifugare a 327 xg per 5 minuti e lavare in un volume uguale di supporti elettroporazione pre-riscaldato. Nota: elettroporazione media è un mezzo di siero ridotto contenente tamponi e supplementi (vedi materiali di consumo). </li><li> Dopo ri-pellet a 327 xg per 5 minuti, risospendere le cellule in 500 ml di mezzi di elettroporazione e lentamente aggiungere ad una cuvetta, aggiungere 5 mg di plasmide in grado PCR dH 2 O per l&#39;etichettatura di F-actina. </li><li> Battere delicatamente la cuvetta sull&#39;area di lavoro cofano per garantire la rimozione di eventuali bolle d&#39;aria nei media, che possono causare la formazione di archi di energia elettrica e per distribuire le cellule in modo uniforme nei media. </li><li> Accendere l&#39;apparecchio elettroporazione e la tensione impostata a 300 V e la capacità a 290 Ω. Campione elettroporazione utilizzando un decadimento esponenziale per 20 msec. Nota: L&#39;ottimizzazione può essere richiesto per le cellule diverse e diversi costrutti plasmide. </li><li> Una volta che il protocollo è transfezionecompleti, celle negozio in ghiaccio per 1 min prima di continuare. </li><li> Trasferire accuratamente le cellule dalla provetta al 6 pozzetti contenenti 5 ml di equilibrata supplemento RPMI dal punto 1.1.1. </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C + 5% di CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Coprioggetto Coat e Supplemento Imaging pre-caldo <ol><li> Coprioggetto Coat con anticorpi per indurre stimolazione delle cellule T. <ol><li> Cappotto ciascuna camera di un vetrino da 8 pozzetti con 1 mg / ml αCD3 e αCD28 in 200 l di PBS. </li><li> Conservare a 4 ° CO / N. In alternativa, coprioggetto cappotto 2 ore prima di imaging e mantenere in un incubatore a 37 ° C per ridurre la dispersione durante il processo di imaging riducendo al minimo le variazioni di temperatura al vetrino. </li></ol></li><li> Creare un campione di prova vetrino con microsfere fluorescenti 0,1 micron sub-diffrazione. <ol><li> Soluzione madre vortice di perline per evitare grumi. </li><li> In una nuova, coprioggetto pulito di the stesso tipo di quelli utilizzati in fase 2.1.1, pipetta 5 ml soluzione madre microsfere fluorescenti sulla superficie (come da istruzioni del produttore). </li><li> Distribuire soluzione microsfere sopra il vetrino con la punta della pipetta. </li><li> Lasciare asciugare, quindi applicare 200 ul medio di montaggio come PBS. Nota: il mezzo di montaggio deve corrispondere a quello utilizzato per i campioni di cellule di imaging. </li></ol></li><li> Equilibrare HBSS (+ HEPES 20 mM, di seguito denominato &#39;HBSS integratore&#39;) in una provetta da centrifuga mettendo in un incubatore a caldo pre-O / N a 37 ° C + 5% CO 2. Nota: l&#39;aggiunta di HEPES è di buffer di CO 2, se si utilizza una camera di incubazione con CO 2 ingressi saltare questa integrazione. </li></ol> 3. Microscopio Set-up <ol><li> Accendere incubatore fase-top del microscopio e posto acqua distillata sufficiente TIRF-SIM nel serbatoio del microscopio a coprire completamente la base dell&#39;elemento riscaldante. Permettere all&#39;acqua di all&#39;equilibrate a 37 ° C. Aggiungere il collare di riscaldamento per la lente dell&#39;obiettivo, anche impostato a 37 ° C. Nota: A causa della sensibilità del set-up, questi passaggi sono fatto la notte prima quindi i componenti ottici sono ad una temperatura stabile prima di imaging. </li><li> Posizionare il TIRF 488 blocco reticolo compatibile nel percorso della luce del microscopio e fissarlo in posizione. <ol><li> Cambiare la modalità di canale e il cavo in fibra nella posizione &#39;Single&#39; sul palco base del laser e microscopio, rispettivamente, di coinvolgere il percorso ottico corretto per la modalità TIRF-SIM. Nota: Saltare questo passaggio porterà ad un errore (Figura 1A) all&#39;interno della finestra del software. </li></ol></li><li> Accendere tutti i componenti del microscopio e computer e aprire il software di controllo di acquisizione. <ol><li> Aprire il pannello OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Acquisition finestre (Figura 1B). Nel &#39;Pannello OC&#39; selezionare l&#39;opzione &#39;TIRF 488&#39; (Figura 2B, freccia gialla). </li&gt; <li> Nella finestra N-SIM Pad, selezionare il &#39;TIRF-SIM&#39; e impostazioni &#39;Moving&#39; (Figura 2C, frecce gialle). Selezionare il pulsante Impostazioni (Figura 1C, scatola gialla) e selezionare &#39;TIRF 488 (per 100x TIRF 488 nm)&#39; dal menu a discesa, ha colpito &#39;Apply&#39; e &#39;OK&#39;. </li><li> Impostare le impostazioni della fotocamera in &#39;Impostazioni DU897&#39; a: Frame Rate 50 msec, modalità di lettura, EM guadagno 3 MHz a 14 bit, e EM guadagno moltiplicatore 300 con un guadagno di conversione di 1 (figura 1C, scatola verde). Nota: vedi Rappresentante dei risultati in base a considerazioni di frame rate. </li><li> Calibrare illuminazione del microscopio per TIRF-SIM selezionando l&#39;obiettivo 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sulla &#39;N-SIM Pad&#39; accendere la potenza del laser 488 nm a 10%. Nota: le dimensioni dei pixel delle immagini prime è di 60 nm, con un campo di 512 x 512 pixel di vista. </li><li> Pulire la lente dell&#39;obiettivo con panno per lenti per rimuovere la polvere e l&#39;olio. </li></ol></li&gt; <li> Trovare il piano focale TIRF-SIM. <ol><li> Iniziare con l&#39;obiettivo nell&#39;eventuale piano z più basso. Mettere una goccia di olio lente sull&#39;obiettivo e aggiungere il campione microsfere fluorescenti dal punto 2.2 al palco microscopio. </li><li> Selezionare la funzione perfetta Focus System (PFS) situata sul corpo del microscopio. </li><li> Spostare lentamente l&#39;obiettivo attraverso il piano z finché il pulsante PFS smette di lampeggiare per confermare il piano focale è stato raggiunto. </li><li> Passare alla visualizzazione &#39;Live&#39; sul software di controllo e l&#39;immagine le microsfere di regolazioni finali effettuate utilizzando la rotella micromanipolatore PFS. </li></ol></li><li> Osservare l&#39;illuminazione uniforme senza emissione out-of-focus fluorescenza sopra l&#39;onda evanescente 75 nm. Nota: Conferma illuminazione strutturato si realizza osservando un pattern di illuminazione fluttuante dal campione microsfere fluorescenti. </li><li> Misurare campione microsfere fluorescenti e quantificare il miglioramento resolut immaginiion osservando la larghezza a metà massimo (FWHM) del profilo di intensità. <ol><li> Aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare &quot;Applicazioni&quot; -&gt; &#39;Mostra finestra N-SIM&#39;. </li><li> Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (Figura 2), ricostruire l&#39;immagine del campione microsfere di generare una immagine ricostruita di 1.024 x 1.024 pixel con una dimensione dei pixel di 30 nm. </li><li> Con lo strumento linea di profilo con una larghezza di 1 pixel (Figura 3A, scatola gialla), tracciare una linea attraverso il centro di un unico microsfere. </li><li> Selezionare il pulsante FWHM (figura 3B, scatola gialla) e fare clic in corrispondenza del massimo di intensità della distribuzione gaussiana, seguito dalla sua intensità minimi. </li><li> Conferma la FWHM della microsfera è nell&#39;intervallo di 100 nm (Figura 3C). Nota: la risoluzione achquando di imaging campioni biologici ieved variano a seconda del rapporto segnale-rumore di efficienza di etichettatura e fluorescenza di fondo. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione del campione per l&#39;imaging <ol><li> Preparazione Coverslip. <ol><li> Recupera coprioggetto αCD rivestite dal punto 2.1 da frigo o in un incubatore e rimuovere PBS contenente αCD3 e αCD28 da ogni pozzetto. </li><li> Aggiungere 200 ml di pre-riscaldato supplemento HBSS dal punto 2.3 a ciascun pozzetto del vetrino. Lavare e togliere per garantire il minimo αCD3 e αCD28 viene lasciato in soluzione. Aggiungere altri 200 ml di supplemento HBSS ai pozzetti coprioggetto. </li><li> Pulire la parte inferiore del vetrino con il tessuto dell&#39;obiettivo per rimuovere l&#39;olio e particolato. </li></ol></li><li> Posizione vetrino sul palco microscopio e trovare il piano focale TIRF del vetrino utilizzando il piano z PFS come si trova al punto 3.4. </li><li> Preparazione cellulare. <ol><li> Dispensare 200 microlitri della con supporticontenenti cellule trasfettate dal punto 1.1.8 in un tubo di micro-centrifuga. </li><li> Cellule pellet in un micro-centrifugare a 268 xg per 20 secondi e rimuovere i supporti cellulari. </li><li> Risospendere le cellule in 200 ml preriscaldata HBSS supplemento dal punto 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Le cellule Imaging <ol><li> Prendere cella contenente HBSS supplemento al microscopio e delicatamente pipetta 200 microlitri in uno dei pozzi. </li><li> Pur rimanendo nel piano focale TIRF al vetrino (in modalità PFS), utilizzare l&#39;oculare microscopio e illuminazione epifluorescenza per monitorare le cellule fluorescenti avvicina il vetrino. </li><li> Una volta che le cellule atterrano sul vetrino, passare alla modalità &#39;Live&#39; nel N-SIM Pad per portare l&#39;immagine sul monitor e controllare le celle sono a fuoco sullo schermo del computer. </li><li> Per registrare il tempo-corsi, aprire la finestra ND Acquisizione e selezionare la scheda &#39;Time&#39;, fare clic su &#39;Aggiungi&#39; e impostare &#39;Intervallo&#39; a Nessun ritardo, &#39;Durata&#39;a 10 minuti, &#39;Loop&#39; è impostato a 1. Nota: durata può essere cambiato a seconda del processo di interesse; il software STICS può estrarre risultati quantitativi, con pile di immagini di ≈10 fotogrammi quando catturato con &#39;Nessun ritardo&#39;. </li><li> Con le impostazioni di acquisizione identici al campione tallone, avviare la registrazione dati selezionando &#39;Esegui ora&#39; nella finestra di acquisizione ND. </li></ol> 6. Ricostruire SIM Immagini <ol><li> Dopo l&#39;imaging, aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare &quot;Applicazioni&quot; -&gt; &#39;Mostra finestra N-SIM&#39;. </li><li> Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (figura 2), ricostruire uno (o più utilizzando lo strumento di batch) File SIM prima per produrre una immagine ricostruita SIM. </li><li> Confermare il file ricostruita ha una dimensione dei pixel di 30 nm, indicato nellaimmagine barra di stato. Nota: Dimensione pixel non influisce analisi STICS ma dovrebbe essere almeno 2 più piccolo nella dimensione della risoluzione spaziale PSF per garantire la correlazione spaziale tra pixel. </li><li> Esportare i dati come file TIFF, pronti per l&#39;analisi STICS. </li></ol> 7. STICS Analisi <ol><li> Scaricare ed estrarre il STIC (C) S pacchetto Matlab software (Wiseman laboratorio, disponibili come informazioni supplementari). Il stics_vectormapping.m script è il cuore di una singola analisi STICS canale e le prime 30 righe di codice vengono utilizzati per definire i parametri di input, come definito nella sezione 2.1 del manuale. Aprire questo script e definire i parametri di input per TIRF-SIM analisi dei dati. Si suggerisce di aggiungere anche la cartella STIC (C) S con sottocartelle alla macchina percorso Matlab locale, come descritto nell&#39;appendice del manuale. <ol><li> Definire i parametri di input per l&#39;analisi dei dati modificando le linee corrispondenti del codice </li><li> Per eseguire analisi dei dati TIRF-SIM per generare 1 mappa vettoriale, impostare i parametri temporali per sottoregione temporale in linea 31 per il numero massimo di fotogrammi e lo spostamento temporale in linea 32 a 1. Per ottenere una serie temporale di mappe vettoriali variare questi parametri . </li><li> Per il filtro di rimozione Immobile, impostare il parametro &#39;filtraggio&#39; (linea 23) per &#39;Moving media&#39; e impostare il parametro &#39;MoveAverage&#39; (linea 24) a 21. Nota: Questa impostazione ha dimostrato di funzionare per movimento lento e grandi segnali di fluorescenza, in quanto si basa su sottraendo trame seriali dal telaio analizzato. </li><li> Modificare le linee 33-38 per impostare il nome del file di output e titoli delle mappe vettoriali in uscita, così come il percorso della directory di output e definire in quale formato devono essere salvate le immagini di mappe vettoriali. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Dimensione del pixel (micron) </td><td> 0.03 micron </td><td> Linea 19 </td></tr><tr><td> Frame rate (sec) </td><td> 1 secondo </td><td> Linea 20 </td></tr><tr><td> Tempo massimo di ritardo (frames) </td><td> 20 fotogrammi </td><td> Linea 21 </td></tr><tr><td> Dimensioni subregione (pixel) </td><td> 8 pixel </td><td> Linea 29 </td></tr><tr><td> Spaziatura subregione (pixel) </td><td> 1 pixel </td><td> Linea 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Aprire le run1ChannelSTICS di script nella finestra Matlab Editor. Caricare la serie di immagini eseguendo linee 1-23 di questo script. Nota: Questo script può essere utilizzato per caricare e pre-processo serie di immagini, tracciare le mappe vettoriali e istogrammi di velocità ed eseguire una elaborazione batch per molti file. Se necessario, ritagliare l&#39;immagine di una regione di interesse utilizzando la linea 24-26 di questo script. <ol><li> Linee Run 29-35 di run1ChannelSTICS per iniziare l&#39;analisi STICS. Quando richiesto, selezionare un poligono per indicare una specifica regione di interesse (ROI), se lo si desidera. Assicurarsi che il ROI non si sovrapponga con il bordo delle cellule, come si verificano artefatti contorno quando STICS analizza questi reregioni. </li><li> Linee Run 38-52 per visualizzare le mappe di vettore. Per tracciare l&#39;istogramma velocità di grandezza, le linee 53-72 eseguire. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+interaction+between+T+and+B+cells.">Antigen-specific interaction between T and B cells.</a> Nature. 314, 537-539 (1985).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+antigen+recognition+by+naive+CD4++T+cells:+compulsory+cytoskeletal+alterations+for+the+triggering+of+an+intracellular+calcium+response.">Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response.</a> European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Rust, M. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Questa tecnica permetterà ai ricercatori di immagine e quantificare precedentemente dettagli irrisolvibili in cellule che esprimono fluorescenza. Nei nostri risultati ci mostrano che F-actina scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro cella di cella nella cella di T IS. Questi risultati sono in linea con le precedenti risultati di linea 1D dati del profilo chimografo 13 ed estendere la capacità di analisi dei dati super-risoluzione 2D e. La tecnica presentata è u...

L&#39;obiettivo di questo esperimento è all&#39;immagine e caratterizzare il flusso molecolare di filamentous- (F-) actina in cellule viventi T, oltre il limite di diffrazione per stabilire la direzione del flusso e della portata durante sinapsi immunologica (IS) formazione. Questa tecnica sarà effettuata utilizzando un microscopio illuminazione strutturata (SIM) in modalità riflessione totale fluorescenza interna (TIRF), l&#39;imaging Jurkat cellule T costituiscono sinapsi artificiale sull&#39;attivazione vetrini rivestiti di anti-CD3- ed anticorpi anti-CD28. Le forme si trova tra una cellula T e il suo obiettivo; una cellula che presenta l&#39;antigene (APC) sul recettore delle cellule T (TCR) di attivazione 1,2. Poiché questo è il primo passo per determinare se il sistema immunitario adattativo genera una risposta immunitaria ad una infezione, le conseguenze di risposta agli stimoli non corretto può causare una serie di malattie. L&#39;importanza dell&#39;interazione cellule T-APC è ben documentata, tuttavia, il ruolo (s) del maturo è dopo TCR si inizialeinternalizzazione de segnal devono ancora essere pienamente compreso. Poiché il citoscheletro è pensato per aiutare due processi legati all&#39;attivazione TCR (il movimento delle molecole sulla membrana plasmatica ed il controllo di molecole di segnalazione dipendenti dal citoscheletro actina 3,4), comprendere come il citoscheletro riorganizza spazialmente e temporalmente delucideranno gradini di riorganizzazione molecolare durante la formazione delle sinapsi. Il flusso retrogrado di F-actina è pensato per corral cluster TCR verso il centro della sinapsi immunologica, questa traslocazione si crede di essere di vitale importanza per la cessazione del segnale e il riciclaggio; favorendo il delicato equilibrio di attivazione delle cellule T 5. Mentre un microscopio a fluorescenza è uno strumento flessibile che continua a fornire indicazioni su molti eventi biologici comprese le interazioni cellula-cellula, è limitata dalla capacità del sistema di risolvere con precisione più fluorofori che risiedono vicino di quanto il diffrLimite di azione (≈200 nm) l&#39;uno dall&#39;altro. Come molti eventi molecolari all&#39;interno delle cellule coinvolgono popolazioni dense di molecole e mostrano riassetto dinamico sia in quiescenza o in seguito a stimolazione specifica, microscopia ottica convenzionale non fornisce il quadro completo. L&#39;uso di super risoluzione delle immagini ha permesso ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione usando una varietà di tecniche. Microscopia localizzazione molecola singola (SMLM) come Palm e STORM 6,7 ha la capacità di risolvere la posizione di molecole fino a una precisione di circa 20 nm, tuttavia, queste tecniche contare su lunghi tempi di acquisizione, costruire un&#39;immagine di numerose cornici . In genere questo richiede campioni da fisso o per le strutture di esporre scarsa mobilità in modo singole fluorofori non sono male interpretato come più punti. Mentre esaurimento emissione stimolata (STED) di imaging consente super-risoluzione attraverso molto selettivo confocale eccitazione 8, la scansione richiestaapproccio può essere lento su campi di cellule intere di vista. STED dimostra anche fototossicità significativo per risoluzioni più elevate a causa dell&#39;aumento della potenza del fascio esaurimento. Structured microscopia illuminazione (SIM 9) fornisce un&#39;alternativa a questi metodi, in grado di raddoppiare la risoluzione di un microscopio a fluorescenza standard ed è più compatibile con cellule vive rispetto alle tecniche attuali SMLM. Esso utilizza potenze laser inferiori, in un sistema a grande campo per i campi di cellule intere di vista; fornire una maggiore velocità di acquisizione, ed è compatibile con l&#39;etichettatura fluoroforo standard. La natura a grande campo di SIM permette anche l&#39;utilizzo di totale fluorescenza riflessione interna (TIRF) per l&#39;eccitazione altamente selettiva, con profondità di penetrazione nella dimensione assiale di &lt;100 nm. Spettroscopia di correlazione immagine (ICS) è un metodo di correlare fluttuazioni di intensità di fluorescenza. Un&#39;evoluzione di ICS; Im spazio-temporalespettroscopia di correlazione età (STIC 10) correla segnali fluorescenti intracellulari nel tempo e nello spazio. Correlando intensità dei pixel con pixel circostanti in cornici in ritardo di sviluppo tramite una funzione di correlazione, le informazioni si ottiene quanto concerne la velocità di flusso e direzionalità. Per assicurare oggetti statici non interferiscono con l&#39;analisi STICS, un filtro oggetto immobile viene implementato, che funziona sottraendo una media mobile delle intensità dei pixel. La tecnica qui presentata si crede di essere la prima dimostrazione della spettroscopia di correlazione immagine che viene applicata ai dati microscopia super-risoluzione per quantificare il flusso molecolare in cellule vive 11. Questo metodo migliora sull&#39;imaging diffrazione limitata di flusso F-actina tramite STICS analisi 12 e sarebbe adatto ricercatori che desiderano per determinare il flusso molecolare bidimensionale in cellule vive, dai dati acquisiti a risoluzioni spaziali oltre il limite di diffrazione della luce.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

Filamentosa-actina gioca un ruolo cruciale nella maggioranza dei processi cellulari tra cui motilità e, in cellule immunitarie, la formazione di una interazione cellula-cellula chiave noto come sinapsi immunologica. F-actina è anche ipotizzato a svolgere un ruolo nella regolazione distribuzioni molecolari alla membrana delle cellule tra cui dinamiche vescicole sub-membranoso e proteine ​​clustering. Mentre le tecniche microscopio ottico standard, consentono osservazioni generalizzate e diffrazione limitata da apportare, molti eventi cellulari e molecolari, tra cui il clustering e il flusso molecolare si verificano in popolazioni a lunghezza scale molto al di sotto del potere risolutivo di microscopia ottica standard. Combinando riflessione interna totale fluorescenza con la super Resolution Imaging metodo strutturato illuminazione microscopia, il flusso molecolare bidimensionale di F-actina alla sinapsi immune delle cellule T è stato registrato. Spettroscopia spazio-temporale dell&#39;immagine correlazione (STIC) è stato poi applicato, che genera Resul quantificabilits in forma di istogrammi di velocità e mappe vettoriali rappresentanti direzionalità del flusso e la grandezza. Questo protocollo descrive la combinazione di tecniche di imaging e racchette super-risoluzione per generare vettori di flusso a livello sub-diffrazione di dettaglio. Questa tecnica è stata utilizzata per confermare un flusso actina che è simmetricamente retrogrado e centripeta tutta la periferia delle cellule T sulla formazione di sinapsi.

Impostazioni del microscopio Dopo aver raggiunto con successo tutte le fasi del ricercatore avrà illuminazione strutturata compiuto (SIM) di imaging del flusso F-actina in una sinapsi delle cellule T (Video 1), e quantificato questo flusso molecolare mediante spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale (Figura 4 11). Prima di registrare immagini, garantire l&#39;illuminazione del campione ...

Watch this Scientific Journal Video about Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data at JoVE.com

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Views.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

Video: Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Preparazione di CD4<sup&gt; +</sup&gt; Le cellule T per l&#39;analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...