Ringraziamo Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) per averci insegnato inizialmente la tecnica HGD e il dottor Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) per la sua continua guida in vari aspetti della tecnologia. Questo lavoro è stato finanziato da Hunter College, CUNY start up fondi e premio NSF Pane IOS-1249166. Ringraziamo il NYULMC Istopatologia Nucleo NYUCI Support Center Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 per l&#39;esame istologico sui fegati di topo.

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal Comitato di Hunter College Institutional Animal Care ed uso, City University of New York. 1. Preparazione privo di endotossine plasmide DNA <ol><li> Scegliere una singola colonia di batteri contenenti il ​​gene di interesse in un vettore di espressione di mammifero da una piastra selettiva appena striato. </li><li> Seguire le indicazioni fornite nel manuale di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio per la coltivazione e la raccolta dei batteri. </li><li> Purificare il privo di endotossine DNA plasmidico da cellule batteriche seguendo il protocollo di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio. </li><li> Utilizzare privo di endotossine plastico e maneggiare DNA con cura per assicurare che endotossine non è re-introdotto nel campione di DNA dopo la fase di rimozione. </li><li> Misurare la concentrazione di endotossina senza plasmide DNA determinando la sua assorbanza a 260 nm utilizzando un micrspettrofotometro o volumi UV come descritto di seguito o uno standard, spettrofotometro basato cuvetta. <ol><li> Pulire le superfici ottiche inferiori e superiori del sistema di ritenzione del campione spettrofotometro micro come segue. Dispensare 1 ml di acqua deionizzata pulita sul sistema ottico inferiore. Chiudere il braccio di leva e toccare un paio di volte a fare il bagno al sistema ottico superiore, quindi leva di apertura e pulire con un panno. </li><li> Aprire il software del micro spettrofotometro e selezionare il modulo acidi nucleici. </li><li> Mettere 1 ml di acqua pulita deionizzata sul sistema ottico inferiore, abbassare il braccio di leva e selezionare &quot;inizializzare&quot; dal programma software. Una volta che l&#39;inizializzazione è superfici completi, puliti sia ottici con un tessuto .. </li><li> Eseguire la misurazione in bianco caricando 1 ml di privo di endotossine tampone TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) e selezionando &quot;vuoto&quot; dal programma software. Una volta che la misurazione in bianco è fatto, superfici pulite sia ottiche contessuto. </li><li> Eseguire la misurazione del campione caricando 1 ml di privo di endotossine campione di DNA e selezionando &quot;misura&quot; dal programma software. Registrare la concentrazione di DNA. Valutare la purezza del DNA registrando il rapporto di assorbanza 260/280 nm che appare sullo schermo. Poiché l&#39;uso di DNA puro (260/280 rapporto di 1,8) per HGD è altamente auspicabile, evitare di utilizzare un campione di DNA con un rapporto 260/280 sotto 1.7. Una volta misurazione viene effettuata, pulire entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto. </li></ol></li></ol> 2. Pesatura dei topi <ol><li> Mark topi in modo appropriato per il ceppo. Nota: la marcatura della coda non è raccomandato per questa procedura. <ol><li> Specie di topo Mark che hanno pelliccia bianca (es. Swiss Webster) sulla schiena con un pennarello nero. Riapplicare marchi nel tempo necessario. </li><li> Mark specie di topo che hanno pelliccia nera (ad es C57BL / 6) a orecchio punzonatura diversi giorni di anticipo. </li></ol></li><li> Pesare topi individually mettendoli delicatamente in un piatto animale o secchio posto su una bilancia da laboratorio digitale. Registrare il peso di ciascun topo utilizzato nell&#39;esperimento, il giorno dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. Preparazione di siringhe <ol><li> Preparazione della miscela di iniezione <ol><li> Calcolare la quantità di DNA necessaria assumendo 5-50 ug privo di endotossine DNA plasmidico per l&#39;iniezione di ciascun topo. <ol><li> Determinare la quantità ottimale di DNA plasmidico sperimentalmente. </li><li> Nel determinare la quantità di DNA necessaria, assumere l&#39;iniezione di un mouse aggiuntivo per ogni gruppo, come il caricamento corretto delle siringhe richiederà un po &#39;di mix di iniezione supplementare. Per aiutare i calcoli, si consideri il seguente esempio: iniettare 4 topi sperimentali e 4 di controllo, ciascuno del peso di 25 g, con 50 microgrammi di plasmide DNA per mouse. Per determinare la quantità di DNA necessaria in questo caso, calcolare con 5 topi per gruppo: 5 x 50 mcg = 250 ug di DNA necessarie per ciascun gruppo. </li></ol></li><li> Determinare la quantità di soluzione fisiologica (0,9% cloruro di sodio) necessari assumendo il 10% del peso corporeo per l&#39;iniezione di ciascun topo. <ol><li> Secondo l&#39;esempio di cui sopra, iniettare ogni 25 g mouse con 50 pg di DNA plasmidico in 2,5 ml di soluzione fisiologica (2,5 g di liquido). </li><li> Nel determinare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per un intero gruppo di topi, assumere l&#39;iniezione di un mouse aggiuntivo per gruppo per consentire il caricamento corretto delle siringhe. Considerando l&#39;esperimento data, calcolare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per 5 topi in ciascun gruppo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml di soluzione fisiologica per ogni gruppo (o 25 ml totale). Nota: Se topi dello stesso gruppo non sono lo stesso peso (differenza superiore al 10% del peso corporeo), preparare iniezione mescola separatamente. </li></ol></li><li> Utilizzare conservanti e privo di endotossine, soluzione salina sterile che è stato approvato per uso umano, in 10 ml, più flaconi di utilizzo. </li><li> Utilizzando un ago calibro 20 (0,9 mm x 25 mm) attaccato ad una punta luer-lock di una siringa da 20 ml,prelevare il liquido da fiale saline e svuotare le siringhe in una provetta conica da 50 ml. Per aiutare pipettaggio accurata salina durante la preparazione delle miscele di iniezione di DNA-salina, soluzione salina raccogliere più del necessario per l&#39;iniezione di tutti i topi nell&#39;esperimento. Per l&#39;esperimento di cui sopra, ritirarsi salina da 3, 10 ml fiale (per un totale di circa 30 ml), anche se l&#39;importo calcolato di soluzione fisiologica necessari per l&#39;esperimento è solo 25 ml. </li><li> Pipettare la quantità calcolata di DNA in un tubo da 50 ml differente. Fate attenzione a non toccare il lato del tubo con il corpo pipetta per evitare l&#39;introduzione di endotossine. Secondo l&#39;esempio, pipettare 250 pg di controllo e 250 pg di DNA plasmidico sperimentale in provette coniche separati. </li><li> Aggiungere la quantità richiesta di soluzione salina al DNA usando una pipetta sierologica. Considerando l&#39;esperimento campione, pipettare 12,5 ml di soluzione salina a ciascuno dei Master Mix (sperimentale e di controllo). </li><li> Consentire tutte le soluzioni per raggiungeretemperatura ambiente prima dell&#39;iniezione. </li></ol></li><li> Preparazione di siringhe <ol><li> Per ciascun topo, riempire una sterile, 3 ml, siringa luer-lock con la miscela di DNA-salina sterile utilizzando una, ago 20 gauge (0,9 mm x 25 mm). Fare attenzione ad evitare bolle d&#39;aria. Evitare di utilizzare siringhe volumi elevati, la portata di iniezione non può essere controllato molto bene, ed è difficile da manipolare siringhe più grandi in una mano. Espellere qualsiasi mix di DNA-salina in eccesso nel tubo conico in quanto questo può essere riutilizzato. </li><li> Passare l&#39;ago di una sterile, ago 27-gauge. Riempire l&#39;ago con il liquido completamente senza introdurre bolle d&#39;aria. Regolare il volume della miscela di DNA-salina calcolato sulla base del peso del mouse. </li><li> Non permettere che l&#39;ago senza cappuccio di toccare qualsiasi superficie non sterile. Se necessario, gli aghi possono essere nuovamente presenze con la tecnica con una sola mano: mettere il tappo su una superficie piana, inserire l&#39;ago, senza trattenendo il tappo con l&#39;altra mano e premere l&#39;ago copertocontro un oggetto fermo per fissare il tappo sul dell&#39;ago. Le siringhe sono ora pronti per iniezioni vena della coda. </li></ol></li></ol> 4. Consegna del DNA idrodinamica <ol><li> Si noti che i topi anestetizzante può ridurre la vitalità. Evitare di eseguire HGD in una stanza che è troppo freddo, in quanto questo sarà anche ridurre la vitalità. Se la stanza ha una temperatura ambiente di 20 ° C o se si utilizza l&#39;anestesia, posizionare il mouse su una piastra elettrica a 37 ° C procedura di post per evitare la perdita di qualsiasi animale. Se si utilizza l&#39;anestesia, assicurarsi che la bocca e il muso del mouse mentre si libera sulla rampa di calore e osservare il mouse fino a che non si riprenda pienamente. Non trattenere cibo né acqua dai topi prima di HGD. </li><li> Riscaldare i topi di dilatare i vasi sanguigni. <ol><li> Posizionare la gabbia del mouse (con letti preparati) su un tappetino di calore per 5 minuti in modo che la temperatura della lettiera è di circa 38-39 ° C. La temperatura deve essere sufficientemente bassa per mantenere i topi sul tappetino calore per unperiodo prolungato. </li><li> In alternativa, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione accesso dorsale con moderazione minima. Riscaldare la coda del topo per 1 min tenendolo delicatamente con una garza bagnata in acqua calda. Lasciare mouse per riposizionare, se necessario. Pulire la coda con un tessuto ad asciugare. </li><li> In alternativa, caldo mouse posizionando la gabbia sotto una lampada di calore per non più di 2 min. Se si utilizza una lampada di calore, cautela per evitare il surriscaldamento del mouse. </li></ol></li><li> Iniezione coda vena di grandi volumi <ol><li> Immobilizzare un accesso restrainer dorsale su una superficie piana nastro laboratorio. </li><li> Tenendo per la coda, posizionare il mouse delicatamente nel dispositivo di immobilizzazione e inserire la spina. Uso come poco fermo come necessario per mantenere la coda immobilizzato. Assicurarsi che il mouse respira liberamente. </li><li> Se il mouse è in grave crisi in qualsiasi momento durante la procedura, rimuovere il mouse dalla immobilizzazione immediatamente e lasciarlo riposare. </li><li> Posizionare il mouse in modouna delle vene caudale laterale è visibile. Individuare le vene caudali laterali da visto direttamente sul retro del mouse: la linea rossa scorre al centro della coda è un&#39;arteria, mentre le linee blu su entrambi i lati della coda sono le vene caudali laterali. </li><li> Pulire la coda del topo accuratamente con alcool. </li><li> Usando la mano non iniezione, tenere la coda stretta tra l&#39;indice e il medio in modo che la coda passa sotto l&#39;indice, il medio e l&#39;anulare e sotto il mignolo. Lasciare che il pollice di rimanere libero di muoversi. (Figura 1A) </li><li> Con l&#39;altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona. </li><li> Raccogliete la siringa caricata con il iniezione-mano e tenere per la canna tra il pollice e le altre quattro cifre. Non tenere su lo stantuffo. </li><li> Posizionare la siringa parallela alla coda con la punta dell&#39;ago verso il corpo del mouse ela smussatura (bordo inclinato) dell&#39;ago rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Inserire l&#39;ago nella vena della coda. Procedere con l&#39;iniezione solo se la vena è posizionata correttamente, che è evidente dall&#39;ago scorrevole in senza resistenza. Si noti che la profondità di inserimento dell&#39;ago è una questione di preferenze personali però, pieno di inserimento non è raccomandato a causa di un aumentato rischio di taglio della vena. Evitare di spostare l&#39;ago. </li><li> Usando il pollice della mano-coda tenendo, chiudere sul mozzo dell&#39;ago e premere mozzo contro la coda di tenere l&#39;ago in posizione. Non applicare una pressione estrema e non tenere sull&#39;albero ago, in quanto questi saranno ostacolare il flusso di liquido nella vena. Tenere la coda con il dito indice liberamente a questo punto in modo da non ostacolare l&#39;iniezione (Figura 1A). </li><li> Riposizionare la mano-siringa che tiene in modo che il dito indice e medio stanno trattenendo la flangia e il pollice si trova all&#39;estremità dello stantuffo (Figure 1A). </li><li> Premere verso il basso sul pistone in un movimento continuo ed iniettare l&#39;intero volume del liquido in 6-8 sec. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla vena e fermare l&#39;emorragia applicando una leggera pressione alla coda con un fazzoletto. </li><li> Rimuovere il mouse dal dispositivo di immobilizzazione e il luogo topo in una gabbia di recupero posta sulla cima di una piastra elettrica (biancheria da letto dovrebbe essere 37-38 ° C). Se la camera di iniezione è fredda, questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza del mouse. Tenere su la coda del topo fino sanguinamento si arresta completamente. </li><li> Osservare il mouse per 1 ora dopo la consegna del DNA idrodinamica. Un periodo iniziale di ansimare e di immobilità è normale a causa dell&#39;aritmia temporanea causata da HGD ma fare in modo che il mouse mostra segni di ripresa in circa 5 min. Se il respiro del mouse diventa estremamente superficiale, massaggiare delicatamente l&#39;addome del mouse per facilitare la respirazione. Si noti che il tasso di recupero può essere leggermente influenzata dal ceppo di topi utilizzato. </li><li> Topo di ritornoa gabbia alloggi e garantire che il mouse ha un abbondante approvvigionamento di cibo e acqua. </li></ol></li><li> Large-volume di iniezione coda vena con una posizione alternativa a mano <ol><li> Posizionare il mouse nel dispositivo di immobilizzazione e prepararsi per l&#39;iniezione seguendo i punti 4.3.1 tramite 4.3.5, come descritto in precedenza. </li><li> Appoggiare la mano non iniezione su una superficie piana con quattro dita piegate con un angolo di novanta gradi. Le dita (tutti tranne pollice) devono appoggiare su di loro, creando una piattaforma. Tenere la coda del topo tra il pollice e il dito di puntamento (Figura 1B). </li><li> Con l&#39;altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona. </li><li> Afferrare siringa con l&#39;iniezione mano tenendolo per la flangia e l&#39;estremità dello stantuffo, pronto per l&#39;iniezione. </li><li> Completare la procedura seguendo questo protocollo dal punto 4.3.9 fino al passo 4.3.17, come descritto in precedenza. </li></ol></li></ol>

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M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis:+Epidemiology+and+control.">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li><li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors.">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li><li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trypanolytic+factor+of+human+serum.">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li><li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum.">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li><li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum.">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li><li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Quando eseguito correttamente, HGD è un mezzo straordinariamente efficace e sicuro di consegna transgene. I passaggi critici di successo HGD sono: 1) fornire la giusta quantità di DNA in un grande volume di soluzione salina veicolo 2) nella vena della coda del topo 3) in meno di 8 sec. Sebbene il processo di iniezione stesso richiede innegabilmente una certa destrezza manuale, il successo di questa procedura sei secondi si trova spesso in preparazione accurata dell&#39;esperimento. La quan...

Fin dalla sua prima descrizione da Liu et al. Ed Zhang et al., Consegna del gene idrodinamico (HGD) è diventato uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene in sistemi modello roditore 1, 2. La tecnica prevede l&#39;iniezione rapida (5-7 sec) di un grande volume (8-12% del peso corporeo) di soluzione nella vena caudale di topi per facilitare l&#39;assorbimento di DNA plasmidico da cellule di organi bersaglio 1, 2. Queste condizioni portano ad espressione genica robusta nel fegato e meno espressione genica nel rene, milza, polmone e cuore. Iniezione di 10 mg pCMV-LacZ plasmide può trasfettare fino al 40% degli epatociti, rendendo il HGD non virale in vivo metodo più efficiente, il trasferimento genico ad oggi 1. A differenza di vettori virali, pDNA è facile da preparare, non suscitare una risposta immunitaria nell&#39;ospite roditore 3 e non costituisce un rischio per la salute ricombinando con finevirus esogeni. Inoltre, poiché le molecole di DNA forniti da HGD non necessitano imballaggio, questo metodo è adatto per la consegna dei cromosomi batterici artificiali (BAC) grandi come 150 kb 4. Altri tipi di molecole che sono state fornite da un metodo idrodinamico includono RNA 5-10, Morpholinos 11, proteine ​​12, 13 e altre piccole molecole 12, 14. I vantaggi e gli svantaggi di HGD rispetto ad altri metodi di consegna sono stati discussi in eccellenti recensioni in letteratura 15-20 e un certo numero di autori hanno fornito una descrizione dettagliata della procedura 21-23. Introdurre transgeni in topi da HGD è sicuro ed efficace 1-3, 24 e il metodo è stato utilizzato in ratti con successo paragonabile 25. Con alcune modifiche, proof of concept esperimenti sono stati condotti in polli 26, rabi bit 27 e 28 suini, anche se, l&#39;applicazione in vivo di questa tecnica in animali più grandi rimane una sfida. Quando si utilizza questo metodo, un altro limite comune è che molti dei vettori di espressione di mammifero disponibili mancano i componenti per realizzare una persistente, elevato livello di espressione genica. Utilizzando un plasmide, espressione genica pCMV-Luc in organi bersaglio è evidente già dieci minuti dopo HGD, tuttavia, il livello di espressione iniziale elevato scende bruscamente nella prima settimana dopo l&#39;iniezione 1. Espressione del transgene a lungo termine è possibile a seconda del promotore e introni utilizzato nella progettazione plasmide 3, 24 iniezioni tuttavia, manutenzione di espressione genica di alto livello spesso richiede ripetuti. Per questo motivo, HGD potrebbe essere meno adatto per studiare le malattie croniche che sono il risultato di esposizione a lungo termine alle proteine ​​dannose o prodotti proteici. Con queste limitazioni, HGD è uno strumento estremamente potente per studiare il Poziale ruolo di un gene e l&#39;effetto di essa mutanti in vivo, così come gli effetti terapeutici e regolazione delle proteine ​​e per la creazione di modelli animali di malattia (per una rassegna, si veda 15). Ad esempio, HGD può essere utilizzato per assegnare funzioni ai domini e aminoacidi di proteine ​​introducendo singolarmente vari costrutti genici in topi che hanno i rispettivi geni messo fuori. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata in qualsiasi ceppo di topi. Questo protocollo descrive HGD in topi con un focus sugli aspetti tecnici necessari per raggiungere trasfezione di successo: corretto inserimento ago nella vena, volume di iniezione e la velocità di consegna. L&#39;applicazione di questo metodo è dimostrato in un modello murino di tripanosomiasi africana, una malattia fatale di esseri umani e animali 29, 30. Mentre diverse specie di trypanosomes causano malattie nel bestiame, la maggior parte non può causare malattie negli esseri umani a causa di complessi immuni innate in blood chiamate fattori litici tripanosoma (TLFs) 29, 31, 32. Questi, lipoproteine ​​ad alta densità formanti pori (HDL) contengono due uniche, specifiche primate-proteine:. HPR, il ligando, che facilita l&#39;assorbimento di TLFs in trypanosomes e APOL-I, la componente litica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense è in grado di infettare gli esseri umani a causa di espressione di una resistenza associata proteine ​​del siero (SRA) che si lega e neutralizza umano APOL-I 34, 39. Baboon TLF non è neutralizzato da SRA grazie alla sua divergente APOL-I proteica 40. Come riportato in precedenza, utilizzando un vettore di espressione di mammifero (pRG977), espressione transgenica di babbuino componenti TLF nei topi conferisce protezione contro trypanosomes umane-infettivi 40. I dati rappresentativi presentati dimostrano come gene delivery idrodinamico può essere applicato per studiare gli effetti terapeutici di una proteina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

Espressione efficace dei transgeni in vivo è di fondamentale importanza nello studio funzione del gene e lo sviluppo di trattamenti per le malattie. Negli ultimi anni, la consegna del gene idrodinamico (HGD) è emersa come un metodo semplice, veloce, sicuro ed efficace per la consegna di transgeni in roditori. Questa tecnica si basa sulla forza generata dalla iniezione rapida di un gran volume di soluzione fisiologica per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari di organi perfusi e quindi consegnare DNA nelle cellule. Uno dei principali vantaggi del HGD è la possibilità di introdurre transgeni in cellule di mammifero usando nuda DNA plasmidico (pDNA). L&#39;introduzione di un gene esogeno utilizzando un plasmide è minimamente laborioso, altamente efficiente e, contrariamente ai vettori virali, notevolmente sicuro. HGD è stato inizialmente utilizzato per trasportare i geni nei topi, è ora utilizzato per fornire una vasta gamma di sostanze, tra cui oligonucleotidi, cromosomi artificiali, RNA, proteine ​​e piccole molecole in topi, rattie, in misura limitata, altri animali. Questo protocollo descrive HGD nei topi e si concentra su tre aspetti fondamentali del metodo che sono fondamentali per eseguire la procedura correttamente: corretto inserimento dell&#39;ago nella vena, il volume di iniezione e la velocità di consegna. Esempi sono forniti per mostrare l&#39;applicazione di questo metodo per l&#39;espressione transiente dei due geni che codificano proteine ​​secrete, specifico primate-, apolipoproteina LI (APOL-I) e proteine ​​aptoglobina correlata (HPR).

Il corretto posizionamento dell&#39;ago nella vena della coda del topo (come illustrato nella Figura 1) è un prerequisito per ottenere con successo un transgene mediante trasfezione basato idrodinamica. Spesso la parte più impegnativa della tecnica, tuttavia, è il mantenimento dell&#39;ago all&#39;interno della vena caudale senza movimento in modo che l&#39;intero volume di iniezione può essere formulato entro 6-8 s. Piccoli errori durante il processo di iniezione possono causare notevolmente ridott...

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Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.3K Views.  Hunter College, CUNY.  In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati. 

Video: Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Espressione transiente di proteine da parte idrodinamica Gene Consegna in topi