Questo lavoro è stato sostenuto dal Medical Research Council e Marie-Curie internazionale reinserimento regime di Grant (a JKV).

1. Picking cloni di espressione di cDNA <ol><li> La libreria di cDNA è fornito come singoli cloni batterici in stock glicerolo in un formato a 96 pozzetti. Utilizzando il comando Rearray nel menu del selettore del CP7200 Norgen, scegliere cloni batterici dal piatto di origine e inoculare in 1,5 ml LB / amp in un 96-Deepwell (1 ml bene) piastra. </li><li> Sigillare le piastre Deepwell con un gas-permeabile tenuta e incubare una notte a 37 ° C in un agitatore. </li></ol> 2. Preparazione di cDNA library espressioni <ol><li> Far girare le piastre Deepwell contenenti i batteri a 2000 rpm per 20 minuti usando adattatori piastra in una centrifuga da tavolo. </li><li> Aspirare supporti dai pozzi, lasciando intatto il pellet batterico. </li><li> Configurare il ponte della workstation automazione Lab come mostrato in Figura 2. Soluzioni per la preparazione plasmide sono distribuiti in trogoli 1-5 e la piastra Deepwell è posto sul ponte. Un trogolo multipozzetto con soluzione di eluizioneè posto adiacente alla piastra Deepwell. Suggerimenti sono caricati nei rack per puntali. </li><li> Montare il collettore del vuoto. La piastra plasmide legame è collocato all&#39;interno del collettore e la piastra plasmide filtro è posto sulla parte superiore del collettore. </li><li> Risospendere pellet con 250 ul di soluzione 1 (tampone di risospensione) pipettando su e giù. </li><li> Lyse i batteri con l&#39;aggiunta di 250 ul di soluzione 2 (tampone di lisi). La piastrina è sigillata e invertito per consentire una miscelazione completa. </li><li> Start 2 timer min. </li><li> Aggiungere 350 ul di soluzione 3 (tampone di neutralizzazione). Sigillare la piastra e capovolgere 3 volte. </li><li> Trasferire i lisati batterici alle piastre filtranti plasmide. </li><li> Applicare il vuoto per 5 min. </li><li> Rimuovere la piastra filtrante e posizionare la piastra di attacco sulla sommità del collettore. Applicare il vuoto per 1 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di lavaggio supplementare (AW) buffer. </li><li> Applicare il vuoto per 2 min. </li><li> Aggiungere 900 ml di soluzione tampone di lavaggio 4. Applicare il vuoto per 2 min. </li><li> Ripetere step 2.14. Applicare il vuoto per altri 15 min. </li><li> Posizionare collezione di piatti del DNA all&#39;interno del collettore. Aggiungere 100 pl di tampone di eluizione alla piastra di attacco e incubare per 2 min. </li><li> Vuoto per 10 min. </li><li> Rimuovere la piastra di raccolta e concentrazione di DNA misura utilizzando il Nanodrop 8000. Tipicamente una resa di ~ 100 ng / mL può essere previsto con questo metodo. </li></ol> 3. Semina cellulare <ol><li> HEK293 cellule vengono tripsinizzate e contate. </li><li> 2 x 10 4 cellule vengono erogate in ciascun pozzetto di una Viewplate PerkinElmer usando il ThermoFisher 96-well multidrop. </li><li> Le cellule sono incubate per una notte a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol><li> Preparare una miscela di 100 ng GFP-Grb2 DNA plasmidico con 100 ng di cDNA in 25 pl terreno privo di siero per pozzetto a fondo rotondo a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 25 pl senza siero supporti contenenti 0,5 Transfectin microlitri per pozzetto. </li><li> Mescolare e avviare il timer for 30 min. </li><li> Trasferire 50 microlitri di cDNA / Transfectin mix di cellule utilizzando un metodo delicato di erogazione. In alternativa, la miscela di trasfezione può essere erogato in piastre prima e poi le cellule aggiunto il top (trasfezione inverso). </li><li> Incubare le cellule notte a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 5. Acquisizione di immagini <ol><li> Avviare il software Opera. Un&#39;istantanea schermata della procedura di configurazione è mostrata in Figura 3. Selezionare la scheda &quot;Configurazione&quot; e selezionare 20x obiettivo e il tipo di piastra corretto. Assicurarsi che &quot;collare&quot; è impostato al valore corretto per l&#39;obiettivo di consentire la messa a fuoco con diversi tipi di lastre. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Microscopio&quot;. Definire l&#39;esposizione 1 come FITC (488 laser) e l&#39;esposizione ai raggi UV 2 come (365 laser). Attivazione del filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 alla telecamera 1 e 2 per l&#39;esposizione della fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione a 800 msec per l&#39;esposizione 1 e 40 msec per l&#39;esposizione 2. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Microscopio&quot;. Definire eXposure 1 come FITC (488 laser) e 2 come esposizione UV (365 laser). Attivazione del filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 alla telecamera 1 e 2 per l&#39;esposizione della fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione a 800 msec per l&#39;esposizione 1 e 40 msec per l&#39;esposizione 2. </li><li> Selezionare l&#39;esposizione 1. Impostare lo stato attivo altezza a 0 micron. Selezionare &quot;Focus&quot;. Una volta concentrata, esporre la fotocamera 1. Regolare l&#39;altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e clicca su &quot;altezza Take&quot;. Modificare i tempi di esposizione e la potenza del laser per dare un&#39;intensità massima di pixel di circa 3000. Salvare i parametri di esposizione. Ripetere l&#39;operazione per l&#39;esposizione 2. </li><li> Selezionare &quot;Definizione Experiment&quot; tab. Creare layout e sublayout. Trascinare e rilasciare il relativo schema, l&#39;esposizione, immagine di riferimento, il file skewcrop e sublayout. Salva esperimento. </li><li> Selezionare &quot;Automatico Experiment&quot; scheda e acquisire immagini. </li></ol> 6. Image Analysis (Basato sulla versione ImageJ 1.46h.) <ol><li> Convertire il PerkinElmer proprietario. File flessibile per Tagged Image. Tif file utilizzando ilFlex2Volocity Acapella script. </li><li><ol><li> Importare immagini in ImageJ come una sequenza di immagini, risultante in una pila. </li><li> Convertire la pila in un canale 2 HyperStack selezionando l&#39;immagine / HyperStack / stack di voce di menu HyperStack. Il numero di fette deve essere impostato a metà della pila importato. </li><li> Duplicate il canale con il GFP Immagine / comando Duplica: selezionare la casella di controllo e specificare Duplica HyperStack Canali: 1-1. Appresso utilizzare lo stack duplicato. </li></ol></li><li> Selezionare Processo / Migliora contrasto con 0,01% dei pixel saturi, con istogramma stack e convertire a 8 bit con Image/Type/8-bit. </li><li> Definire a 15 segmentazione raggio locale pixel utilizzando l&#39;algoritmo adattivo Bernsen con soglia di contrasto (parametro 1) q = 30. Spunta gli oggetti bianchi su sfondo nero nella casella di controllo Immagine / Regola / Auto menù soglia locale. </li><li> Controllo di qualità Segmentazione: generare segmentato overlay contorno dell&#39;oggetto sulle immagini originali. </li><li> Featuri di estrazione analizzando le particelle: area di misurazione, media e l&#39;intensità totale di ogni organello. Salva file dei risultati. </li><li> Aprire il risultato caratteristiche file in R e generare un istogramma. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi In condizioni normali Grb2 è localizzato durante l&#39;intera cella. Dopo stimolazione di un recettore del fattore di crescita si trasloca alla membrana plasmatica e viene successivamente internalizzato in endosomi come mostrato in Figura 4. L&#39;espressione di un recettore di superficie cellulare capace di Grb2 legame è sufficiente per indurre questa traslocazione. In un esperimento tipico di screening, nessun cambiamento in GFP-Grb2 localizzazione viene osservata. Tuttavia, quando una proteina che è espressa Grb2 reclute ad un sub-cellulare sito, vi è un cambiamento di localizzazione che può essere facilmente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Ad esempio, l&#39;espressione dei risultati EGFR rilocalizzazione della GFP-Grb2 a endosome strutture simili (Figura4). Così, applicando un genoma biblioteca, si può prevedere che nuovi Grb2 proteine ​​leganti di superficie cellulare possono essere identificati. Questo metodo non è limitata alla rilevazione di proteine ​​di superficie cellulare. Per esempio, Dynamin2 induce un cambiamento nella localizzazione sub-cellulare di GFP-Grb2 visualizzazione endosomi-like reclutamento (Figura 5). Dynamin2 lega al C-terminale del dominio SH3 Grb2 ed è coinvolto in endocitosi di questo complesso 9,10. Pertanto, questo approccio consente l&#39;identificazione di complessi proteici generali vincolanti e non è limitata alla individuazione di partner di interazione per il dominio SH2. Diversi tipi di traslocazione può prevedere come la localizzazione alla membrana plasmatica, ad endosomi, altre strutture vescicolari citoplasmatiche o al nucleo. Pertanto, si raccomanda che tutte le immagini siano anche ispezionate dagli occhi. Tuttavia, quando lo screening di grandi insiemi di cDNA un sistema automatizzatoalgoritmo di analisi immagine è più pratico. In questo caso, una combinazione di algoritmi è desiderabile, come il rilevamento punto per identificare endosomi, citoplasma / nucleo rilevazione per identificare algoritmi morfologici nucleari spola e generale per identificare cambiamenti forma cellulari. L&#39;uso di questi metodi di rilevazione differenti fenotipiche è stato discusso in dettaglio altrove 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale della sperimentazione. L&#39;esperimento i dettagli di un completo ad alto contenuto di flusso di lavoro di screening a partire con l&#39;amplificazione e la preparazione della libreria di cDNA, trasfezione di vettori di cDNA più costrutti reporter, l&#39;acquisizione di immagini e analisi di immagine utilizzando il software libero e open ImageJ. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figura 2. Configurazione del ponte Tecan. (1) Sulla sinistra, cinque trogoli 100 ml devono essere riempiti con buffer 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) e A4 (100 ml). A4 Trough dovrà essere riempito volta durante la procedura. (2) Il collettore di vuoto si trova sulla posizione 14 in questo esempio. (3) La piastra Deepwell con pellet batterici si trova in posizione 30, vicino al trogolo tampone di eluizione con 25 ml di tampone di eluizione. (4) punte monouso per la 8 canali testa devono essere caricati nei rack punta sul lato sinistro e suggerimenti per la testa multicanale devono essere compilati sulla posizione 40. Il liquido Tecan FreedomEvo gestore che viene utilizzato in questo esperimento è equipaggiato con 500 siringhe pl. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Figura3. Automazione di acquisizione dell&#39;immagine sulla LX Opera. A) Selezionare la scheda Configurazione (1). Attivare le linee laser necessari per l&#39;esperimento (2). Selezionare le telecamere per l&#39;acquisizione delle immagini (3). Selezionare il tipo di piastra e lente obiettivo dell&#39;esperimento (4). B) Selezionare la scheda microscopio (1). Definire la sorgente di luce e il tempo di esposizione per esposizione 1 (2,3). Focus su un pozzetto e prendere altezza (4). C) Selezionare la scheda Definizione Experiment (1). Trascinare e rilasciare l&#39;esposizione, skewcrop, di riferimento, il layout e file sublayout (2). Trascinare e rilasciare il file esperimento (3). D) Selezionare Esperimento automatico (1). Trascinare e rilasciare file di esperimento (2). Assegnare codice a barre del caso (3). Avviare l&#39;acquisizione di immagini facendo clic sul pulsante di avvio (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. GFP-Grb2 traslocazione di espressione di cDNA. GFP-GRB2 si trasferisce da una localizzazione citoplasmatica predominante di endosomi strutture simili su sovraespressione di un recettore del fattore di crescita transmembrana e interiorizza successivamente endosomi. A sinistra, le immagini di microscopia COS M6 cellule sono presenti che sono state trasfettate con GFP-Grb2 (in alto) o GFP-Grb2 più EGFR (in basso). La co-espressione dei risultati EGFR nel trasferimento di GFP-Grb2 di endosomi strutture simili. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Figura 5. Esempio di cDNA indotta traslocazione di GFP-Grb2. Il Dynamin2 GTPasi, che si occupa di Grb2 endocitosi mediata, trasferisce GFP-Grb2 di endosomi strutture simili (cerchio). In questo esperimento, GFP-Grb2 è stato co-transfettato in cellule con DNM2 HEK293T. Le cellule sono state colorate con Hoechst 33342 dopo 24 ore e le immagini sono state acquisite sul Opera LX. Un campo di vista del (GFP) e il canale verde UV (blu; Hoechst 33342) viene visualizzato.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Espressione clonazione è un potente strumento che è stato utilizzato in passato per identificare nuovi componenti cellulari come recettori virali e antigeni cellule del sangue 12. Qui, si descrive un metodo per facilitare l&#39;identificazione di nuovi recettori putativi di trasduzione del segnale che si legano a Grb2. Ci sono alcuni punti critici del protocollo. <ol><li> Per la preparazione automatica plasmide è assolutamente essenziale avere completa risospensione del pellet batterico. Talvolta, è necessario includere una fase rigorosa agitazione o ulteriore miscelazione con pipette. </li><li> Dopo aggiunta di soluzione 2 e 3, la completa miscelazione è essenziale e abbiamo trovato che manualmente capovolgendo la piastra sigillata è più efficiente l&#39;uso di un agitatore automatico. Pipettaggio deve essere evitato in questa fase in quanto porterebbe al taglio del DNA. </li><li> In tutte le fasi di vuoto, si deve garantire che il liquido viene scaricato completamentedalla piastra. In caso contrario, i rendimenti bassi sono da aspettarsi. </li><li> Su di eluizione, è abbastanza comune che scende eluato modulo in fondo della piastra plasmide vincolante. Queste gocce devono essere raccolti nella piastra di eluizione, quindi si raccomanda che la piastra plasmide associazione viene sollevata delicatamente ed eventuali gocce residue al fondo sono accuratamente trasferiti alla piastra eluato. </li><li> Durante la trasfezione, il tempo di formazione del complesso è critica. Di solito aderire a 20-30 min. Tempi più lunghi fino a 1 h vanno bene, senza diminuzione delle rese, mentre la riduzione dei tempi non sono raccomandati. </li><li> Per la microscopia, la scelta di ingrandimento è importante. Sul sistema Opera LX usato qui, risoluzione a 20x è sufficiente per ottenere immagini di alta qualità. Se immagini di risoluzione superiore sono richiesti, l&#39;obiettivo può essere cambiato, ma al fine di ottenere numeri statisticamente significativi di cellule, un numero maggiore di campi e tempi di acquisizione più elevati sono richiesti. In generale, il nostro obiettivodi ottenere almeno 100 cellule per pozzetto impressi. </li></ol> Il saggio di traslocazione Grb2 è stato utilizzato da altri gruppi di identificare piccole molecole inibitrici di attivazione EGFR chinasi 6. In tal caso, l&#39;EGFR è specificamente attivati ​​con ligando causando reclutamento di Grb2 alla membrana plasmatica. Turbativa di questa interazione può essere studiata utilizzando composti di piccole molecole. Analogamente, si può prevedere che gli schermi siRNA possono essere impiegati per identificare geni endogeni coinvolti nella EGFR-Grb2 segnalazione o altri leganti Grb2 recettori del fattore di crescita come c-KIT o il recettore dell&#39;eritropoietina. Quindi, ci sono più applicazioni potenziali per questa tecnica. Un approccio analogo potrebbe essere applicato a GFP-tagged sistemi reporter per molecole adattatrici altri come Shc, Gab o IRS. Uno dei principali vantaggi di utilizzare questo saggio basato su cellule in cellule di mammifero è che consente l&#39;identificazione di fisiologicamente relinterazioni Evant. Il saggio è una lettura per la formazione di proteine ​​complesse, ma ancora più importante, le interazioni rilevanti vengono monitorati alla corretta subcellulare sito. A questo proposito, questa tecnica supera manufatti da altri proteina-proteina metodi di interazione come lievito-two-hybrid o in vitro. Occorre notare tuttavia che le interazioni indirette possono anche provocare reclutamento Grb2. Analogamente, l&#39;up-regolazione trascrizionale dei partner di legame può essere indotta da cDNA di espressione. Per distinguere tra queste possibilità, è necessario eseguire i saggi secondaria appropriata per distinguere tra effetti vincolanti diretti e indiretti. In conclusione, la GFP-adattatore saggio traslocazione molecola promette alto potenziale di genome-wide screening e applicazioni di scoperta della droga.

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> libreria di cDNA </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gas-permeabili guarnizioni </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Kit Plasmid </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.625,4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Freedom Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Con collettore di vuoto </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Trasduzione del segnale da recettori del fattore di crescita è essenziale per le cellule a mantenere la proliferazione e la differenziazione e richiede uno stretto controllo. Trasduzione del segnale è iniziata dal legame di un ligando per un recettore esterno transmembrana e attivazione di cascate di segnale a valle. Un regolatore chiave della mitogenica segnalazione è Grb2, una proteina modulare composto da un interno SH2 (Src omologia 2) dominio SH3 fiancheggiata da due domini che manca l&#39;attività enzimatica. Grb2 è costitutivamente associato al GTPasi Son-Of-Sevenless (SOS) attraverso il suo N-terminale SH3 dominio. Il dominio SH2 di Grb2 si lega ai recettori del fattore di crescita a residui di tirosina fosforilati quindi giunto l&#39;attivazione del recettore per l&#39;SOS-Ras-MAP chinasi cascata di segnalazione. Inoltre, altri ruoli Grb2 come regolatore positivo o negativo di segnalamento e endocitosi sono state descritte. La composizione modulare di Grb2 suggerisce che può ancorare ad una varietà di recettori e trasduzionee segnali lungo una moltitudine di differenti vie 1-3. Qui descritto è un saggio microscopio semplice che monitora assunzione di Grb2 alla membrana plasmatica. Si è adattato da un metodo che misura variazioni di localizzazione sub-cellulare di green-proteina fluorescente (GFP)-etichetta Grb2 in risposta ad uno stimolo 4-6. Recettori di membrana che si legano al plasma Grb2 come recettore attivato fattore di crescita epidermico (EGFR) GFP recluta-Grb2 alla membrana plasmatica sull&#39;espressione cDNA e successivamente trasferirsi in compartimenti endosomal nella cella. Al fine di identificare in vivo di complessi proteici Grb2, questa tecnica può essere usata per eseguire un genoma ad alto contenuto dello schermo in base alle variazioni Grb2 localizzazione sub-cellulare. La preparazione di cloni di cDNA di espressione, trasfezione e acquisizione dell&#39;immagine sono descritti in dettaglio di seguito. Rispetto ad altri metodi genomici utilizzati per individuare partner di interazione della proteina, come lievito-due-HYbrid, questa tecnica permette la visualizzazione di complessi di proteine ​​in cellule di mammifero in sub-cellulare sito di interazione con un semplice saggio basato microscopia. Quindi entrambi caratteristiche qualitative, come modelli di localizzazione può essere valutata, così come la forza quantitativa dell&#39;interazione.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Un alto contenuto di metodo di screening per l&#39;identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti segnalazione è descritto. Questo metodo è suscettibile di larga scala di automazione e consente previsioni su<em&gt; In vivo</em&gt; Legame proteina e la localizzazione sub-cellulare di complessi di proteine ​​in cellule di mammifero.

Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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10.5K Views.  University College London. Un alto contenuto di metodo di screening per l'identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti segnalazione è descritto. Questo metodo è suscettibile di larga scala di automazione e consente previsioni su In vivo Legame proteina e la localizzazione sub-cellulare di complessi di proteine ​​in cellule di mammifero.

Video: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

L&#39;analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...