Name: Video: Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice
Uploaded: 2016-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 13.9K Views. The University of Melbourne. This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

JCB e ELH-Y sono stati sostenuti dal Dipartimento della Difesa statunitense CDMRP Programma Autism Research (AR11034). NHMRC (1047674) per ELH-Y.The maggio Stewart Bursary-Università di Melbourne fiducia finanziato borse di studio a MS. Ringraziamo Ali Taher, Fátima Ramalhosa e Gracia Seger per i contributi tecnici.

movimentazione degli animali e dislocazione cervicale degli animali prima di tutti gli esperimenti sono stati eseguiti rigorosamente secondo protocolli approvati dal Comitato sperimentazione animale per l&#39;Università di Melbourne (Etica ID: 1.212.494,7) 1. Tessuto Raccolta e dissezione <ol><li> Euthanize topi adulti per dislocazione cervicale. Se possibile evitare l&#39;anestesia per evitare influenze sulla funzione intestinale attraverso recettori situati sulle popolazioni neuronali di interesse. </li><li> Registrare il peso totale del corpo dell&#39;animale, pin il corpo (attraverso i quattro zampe, lato ventrale esposto a sperimentatore) saldamente ad una tavola di dissezione utilizzando aghi ipodermici (Dimensioni: 20 G). </li><li> Utilizzando dissettore e forbici; fare un&#39;incisione attraverso l&#39;epidermide sovrapponendo strati muscolari addominali inferiori. Continuare a utilizzare le pinze e forbici per aprire la cavità addominale lungo la linea mediana dell&#39;addome allo sterno. </li><li> Per evitare che la disidratazione dei tessuti, versare Physisalina meto- (soluzione Krebs: 118 NaCl, 4.6 KCl, 2,5 CaCl 2, 1.2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-glucosio in mM - bollito a RT con gas CarboGen; 95% O 2 e 5 % CO 2 per almeno 20 min) sul contenuto addominale a intervalli regolari (per esempio, ogni 30-60 sec) durante il processo di dissezione. </li><li> Per isolare i due punti, mentre attaccato al cieco e retto, tenere premuto il cieco (che si trova adiacente alla estremità prossimale del colon) delicatamente con dissettore circa 4-5 cm sopra il corpo dell&#39;animale durante il taglio del mesentere con le forbici dissezione multa. </li><li> Fare attenzione a non gestire, allungare o tagliare il tessuto gastrointestinale durante la rimozione del mesentere adiacente. </li><li> Rimuovere il tessuto in eccesso (cioè, vescica e testicoli). Utilizzando le forbici dissezione grossolana, fanno due incisioni verticali (cioè, circa 0,5 cm dalla linea mediana) per tagliare l&#39;osso pelvico su EAlato ch del colon. </li><li> Usare le forbici sottili per separare il retto dalla adiacente tessuto pelvico e finiture che circonda il muscolo dal colon. </li><li> Posizionare il colon full-length (da cieco al retto) in un bicchiere contenente soluzione fisiologica (in precedenza ossigenata con CarboGen) e continuare a ossigenare a temperatura ambiente. Rimuovere il cieco e del retto con le forbici dissezione pregiati e sostituire in coppa. </li><li> Vuoti pellet fecali / contenuto intestinale da preparati colon mediante l&#39;applicazione di una leggera pressione positiva al termine orale utilizzando una siringa da 5 ml collegata ad un puntale 200 ml riempita con soluzione fisiologica. Al fine di orientare il tessuto in futuro, utilizzare un perno di insetto per marcare la fine più prossimale del colon, dove striature nella mucosa sono visibili. <ol><li> Modificare la punta di plastica della pipetta per adattare la siringa da 5 ml, rimuovendo circa 1 cm dalla fine più ampio / prossimale usando una lama di rasoio. Per aumentare la portata, ampliare l&#39;/ estremità più piccola distale tagliando su un angle (circa 45 ° C) usando una lama di rasoio. </li></ol></li><li> Grip il tessuto del colon delicatamente alla sua estremità prossimale con dissettore, inserire la punta della pipetta nel lume del colon e del filo soluzione fisiologica attraverso il lume. </li></ol> 2. Preparazione del colon tessuti e set up sperimentale per Video Imaging <ol><li> Salina fisiologica filo attraverso tutta la tubazione collegata ad un bagno di due Chambered organo impostare (Figura 1 e Figura 3), utilizzando una siringa collegata ad una punta di pipetta 200 microlitri. Questo passaggio rimuove i detriti all&#39;interno del tubo che potrebbero bloccare il flusso di soluzione. Per tubi specifiche fare riferimento alla tabella dei materiali. </li><li> Assicurarsi che le camere del bagno per organi sono continuamente superfused con soluzione fisiologica bollito con CarboGen (95% O 2 e il 5% di CO 2, il tasso di 5 ml min -1 flusso). Utilizzando una sonda di temperatura ad intervalli regolari, affinché la temperature del bagno viene mantenuta tra 33 ° C -37 ° C. </li><li> Riempire il serbatoio afflusso collegato attraverso un rubinetto a 3 vie per il tubo di ingresso con 20-30 ml di soluzione salina fisiologica utilizzando una siringa da 50 ml. </li><li> Durante l&#39;esperimento, mantenere la pressione nel serbatoio afflusso utilizzando arubber tappo con un tubo di vetro (5 mm di diametro interno) inserito attraverso il suo centro. Assicurarsi che l&#39;apertura superiore del serbatoio di afflusso è sigillato in modo sicuro (con il tubo di vetro interno rimanendo sigillata). </li><li> Posizionare il colon (lunghezza 5-7 cm) nella camera di bagno per organi, assicurandosi che sia completamente immerso in soluzione salina fisiologica. </li><li> Cannulate ogni estremità del segmento colico ai due tubi di ingresso / uscita sommerse (ingresso / tubi di uscita di diametro può essere modificata in base alle dimensioni del lume tessuto es. Tessuto postnatale, topi adulti e cavia) in bagno usando standard di di cotone filati per cucire. Attaccare l&#39;estremità prossimale del colon al tubo di ingresso e laestremità distale del colon al tubo di uscita (collegato tramite un rubinetto a 3 vie per un tubo di efflusso verticale, 6 cm di altezza). Assicurarsi che il tessuto non sia ridotto al minimo o troppo rilassati dopo incannulamento per evitare interferenze con le misurazioni e le analisi future. </li><li> Registrare la lunghezza del colon misurando la distanza tra prossimali e distali cannulazioni utilizzando un righello di 15 cm. Questo è importante per interpretare variazioni di lunghezza di contrazione, velocità di propagazione e punti contrazione iniziazione. </li><li> Assicurare una pressione stabile di base del lume (cm H 2 O) è stabilito prima di iniziare l&#39;esperimento. Calcolare pressione luminale misurando la distanza verticale dal tessuto al menisco di soluzione fisiologica all&#39;interno del tubo di vetro di serbatoio di afflusso (orale) e il tubo di efflusso verticale (anale). </li><li> Mantenere preparati tissutali a pressione intraluminale costante (ad esempio, 1-2 cm H 2 O) assicurando che la pressio afflusso tappo ciecore è mantenuta costante e che non blocchi sono presenti nel set up. </li><li> Lasciare il colon ad equilibrarsi in soluzione salina fisiologica per 30 minuti prima di registrare i movimenti intestinali. Verificare la presenza di eventuali blocchi derivanti nei tubi in- o deflusso e rimuoverli applicando pressione attraverso il serbatoio di afflusso o da ri-cannulating le estremità orali e anali del colon. </li></ol> 3. Acquisizione Immagine e il protocollo sperimentale <ol><li> Movimenti intestinali record come file video con una videocamera (30 fotogrammi / sec, 640 x 840 pixel) posizionati 10-15 cm al di sopra del bagno per organi in una storta di laboratorio standard supporto (figura 1). </li><li> Aprire Virtual Dub (video software per la cattura) dalla icona sul desktop. Dalla scheda &#39;File&#39;, selezionare &#39;capture AVI&#39; per visualizzare l&#39;immagine della telecamera. Nella scheda deselezionare &#39;Audio&#39; &#39;consentire la cattura audio&#39; disabilitare il suono. <ol><li> Nella scheda Video selezionare &#39;compressione&#39; e &#39;DivX6.9.2. Codec &amp; #39; per comprimere i file video per ridurre al minimo l&#39;utilizzo di spazio di archiviazione. Questa funzione sarà disponibile sulla installazione del software di compressione &#39;DivX&#39;. </li></ol></li><li> Regolare manualmente la posizione della fotocamera in modo che l&#39;intero segmento del colon cannulato è visibile (con le regioni cannulated immediatamente adiacenti ai bordi verticali del fotogramma video) attraverso la finestra del software di acquisizione video (vedi Figura 1). Al fine di migliorare la qualità dell&#39;immagine e ridurre al minimo i riflessi, fissare uno schermo di carta / cartone al supporto della fotocamera per bloccare la luce estranea sul bagno di organo. Ottimizzare la qualità video regolando le impostazioni di luminosità, contrasto e l&#39;esposizione utilizzando l&#39;interfaccia software della fotocamera. <ol><li> Prima della registrazione, impostare un nome di file specifico; nella scheda &#39;File&#39;, selezionare &#39;file di cattura Set&#39; e specificare un nome univoco per il video. </li><li> Iniziare la cattura video premendo &#39;file di Capture&#39; dalla barra degli strumenti &#39;Capture&#39;. Per interrompere Recording selezionare il pulsante &#39;Stop capture&#39; o il tasto &#39;Esc&#39; sulla tastiera. </li></ol></li><li> Sostituire la soluzione salina fisiologica contenuta nel serbatoio di afflusso con soluzione fisiologica salina fresca ogni 30 min. <ol><li> pressione Record luminale (vedi 2.9) e l&#39;utilizzo di una sonda di temperatura, prendono atto della temperatura del bagno d&#39;organo. Ripetere questi passaggi durante l&#39;esperimento (ad esempio, ogni 30 minuti), al fine di garantire che queste variabili sono costanti. </li></ol></li><li> l&#39;attività del colon Record in totale per 3 ore (compresa l&#39;applicazione di droga e la durata washout). Per scopi di archiviazione dati, registrare i dati in segmenti video 15 min. Una completa esperimento in genere composto da registrazioni video 12 x 15 min. <ol><li> attività Record per 1 ora in condizioni di controllo (soluzione fisiologica). </li><li> Applicare il farmaco (sia superfused nel bagno o somministrata nel lume attraverso il serbatoio di afflusso) per 30 minuti a 1 ora. Nota: diverse vie di somministrazione possono yield effetti diversi 23. </li><li> Applicare fisiologica fresco al bagno o lume nel corso di un periodo di washout 1 ora. </li></ol></li></ol> 4. Elaborazione dati e la generazione di mappe spazio-temporale <ol><li> Processo di ogni linea di registrazione video utilizzando il software in-house scritto in MATLAB (R2012a, la versione 7.4, disponibile a richiesta), al fine di generare mappe spazio-temporali che illustrano la motilità del colon. <ol><li> Aperto software di analisi dalla icona sul desktop. </li><li> Nella finestra di comando, digitare &quot;Analyse2&quot; per aprire il pannello di controllo di analisi. </li></ol></li><li> Utilizzare la funzione di rilevamento dei bordi per generare mappe spazio-temporali cliccando su &quot;rilevamento bordo per i file .avi&quot; nella finestra del pannello di controllo. Questa funzione permetterà al software di analisi per leggere i video ricodificato in formato Audio Video Interleaved (AVI). </li><li> Eseguire le seguenti operazioni in sequenza per generare mappe spazio-temporali utilizzando un adaalgoritmo di rilevamento dei bordi ptive. <ol><li> Aprire i file video registrati selezionando la scheda &quot;Aggiungi file&quot;, selezionare &#39;Apri video&#39; e selezionare la posizione dei file video. </li><li> Dalle file video elencati all&#39;interno del software di analisi, selezionare il file di interesse. </li><li> Selezionare una regione rettangolare di interesse all&#39;interno della cornice del video, ad esempio, l&#39;intera lunghezza del colon, dal punto in cui il colon è cannulata oralmente alla cannulazione anale. Assicurarsi che i punti di incannulamento prossimale e distale sono adiacenti ai confini verticali della regione di interesse. Linee rilevamento dei bordi (rosso e verde) saranno automaticamente appaiono sovrapposta l&#39;immagine in tempo reale su. </li><li> Assicurarsi che le linee di soglia di rilevamento dei bordi sono immediatamente adiacente al colon su entrambi i limiti superiore e inferiore del tessuto colon (questo può essere ottimizzato per ogni video alterando valori di soglia di rilevamento sul pannello di controllo). Assicurarsi che il bordo di rilevamento lines sono continui lungo la lunghezza dell&#39;immagine colon regolando il contrasto e luminosità utilizzando il pannello di controllo. </li><li> Inserire l&#39;intera lunghezza del colon (mm) nella finestra di dialogo larghezza (come registrato al punto 2.7). Quindi selezionare &quot;Genera mappa di calore&quot;. </li><li> Nella finestra pop-up, selezionare un percorso per il file da salvare e specificare un nome di file per la mappa spazio-temporale. </li><li> Selezionare il formato &#39;.su2&#39; e selezionare &#39;Aggiungi alla coda&#39;. Nota: formato .su2 comprime i dati di un file di dimensioni più piccole e più file video possono essere aggiunti alla coda. </li><li> Seleziona &#39;Inizia il rilevamento&#39; per generare mappe spazio-temporali. </li></ol></li></ol> 5. Analisi di mappe spazio-temporale <ol><li> Utilizzare mappe spazio-temporali per stimare i parametri come la frequenza, la velocità di propagazione, la lunghezza e la durata di CMMCs, diametro intestinale e il punto di inizio e la direzione delle contrazioni. <ol><li> Per avviare l&#39;analisi spazio-temporalemappe, tipo &#39;analyse2&#39; nella finestra di comando, come descritto nella sezione precedente. Invece di &quot;rilevazione Edge&quot;, selezionare il pulsante &quot;Heat mappa di analisi&quot;. </li><li> Aprire file mappa spazio-temporali (file .su2) selezionando la scheda &#39;Aggiungi file&#39; e specificando la posizione dei file precedentemente ottenuti .su2. </li><li> Una volta che la mappa spazio-temporale è visibile sullo schermo, specificare un intervallo di colori sul pannello di controllo, assicurando che il minimo è impostato su 1. Si noti che il massimo può variare del 5-10 secondo la contrattilità del tessuto. </li><li> Seleziona &#39;gamma di colori di blocco&#39; al fine di garantire tutte le mappe da un singolo esperimento sono analizzate nelle medesime condizioni. </li><li> Verificare che le impostazioni del telaio di tempo sono costanti per tutte le mappe spazio-temporali di un dato esperimento. </li></ol></li><li> Al fine di determinare la frequenza CMMC, contare manualmente contrazioni che attraversano più del 50% della lunghezza del colon. Queste contrazioni possono essere visuazato come striature rosso / arancio (indice di colore standard HSV) sulla mappa spazio-temporale (vedi figura 2 per un esempio). Altri contrazioni che sono più o non si propagano possono anche essere identificati e quantificati. </li><li> Se lo si desidera, condurre ulteriori analisi a una risoluzione maggiore di esse. Ad esempio, le proprietà dettagliate inclusa la velocità e la durata di ogni contrazione possono essere esaminati. <ol><li> Per misurare la velocità e la durata, selezionare il pulsante &quot;Annota onde contrazione&quot; sulla mappa di calore pannello di controllo analisi. </li><li> Successivamente, lo zoom per ogni CMMC facendo clic sul pulsante &quot;Zoom&quot; e selezionando la zona di interesse. Quindi selezionare il pulsante &quot;annotare manualmente&quot; per annotare ogni contrazione usando il mouse per disegnare una linea dalla posizione più iniziale alla fine di ogni contrazione. Questo metodo può essere usato per misurare la velocità di propagazione apparente e la durata di dilatazioni che sembrano propagare (per esempio, vedere unaal fine di mappe in Figura 2A, 2B). Nota: appariranno i dati per la velocità e la durata sotto la finestra dei risultati. Questi valori possono essere trasferiti ad un foglio di calcolo di interesse selezionando la scheda &quot;Esporta dati&quot;. annotazioni indesiderati possono essere rimossi facendo clic sul pulsante &quot;Rimuovi le annotazioni selezionati&quot;. </li></ol></li><li> Se lo si desidera, utilizzare il coordinate xey delle mappe spazio-temporali (tempo e posizione lungo il colon, rispettivamente) per determinare la posizione di apertura di piccole contrazioni o CMMCs. </li><li> Allo stesso modo, al fine di determinare gli intervalli tra le contrazioni, utilizzare la funzione &quot;Annota&quot; per misurare la durata tra le contrazioni. Come in precedenza, questi risultati possono essere esportati in un foglio di calcolo selezionando la scheda &quot;Esporta dati&quot;. </li><li> Al fine di misurare la larghezza intestino riposo, selezionare il pulsante &quot;Take sezione&quot; sul pannello di analisi cartina calore. <ol><li> Seleziona &#39;Aggiungi9; sul pannello sezioni trasversali temporale. Fare doppio clic in qualsiasi posizione all&#39;interno della mappa per generare una linea orizzontale sovrapposta alla mappa di calore. Dati diametro Gut verranno visualizzati in una nuova finestra. </li><li> Per misurare il diametro dell&#39;intestino, posizionare il cursore su un picco e di valle adiacente per ottenere larghezza media intestino per una condizione sperimentale specifica. Cambiamenti di diametro budello possono essere confrontati tra le condizioni sperimentali. </li></ol></li></ol>

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	<li>Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+integrity+is+essential+for+the+propagation+of+colonic+migrating+motor+complexes+in+the+mouse.">Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse.</a> Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).</li><li>Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+nutrient-induced+segmentation+in+isolated+guinea+pig+small+intestine.">Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).</li><li>Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+migrating+motor+complexes+occur+in+both+the+terminal+ileum+and+colon+of+the+C57BL/6+mouse+in+vitro.">Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro.</a> Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).</li><li>Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+migrating+motor+complexes+(CMMCs)+in+the+isolated+mouse+colon.">Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon.</a> Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).</li><li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+genetics,+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice.">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J Physiol. 587, 567-586 (2009).</li><li>Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+colonic+motility+in+the+neonatal+mouse-studies+using+spatiotemporal+maps.">Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).</li><li>Spencer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+migrating+motor+activity+in+the+colon.">Control of migrating motor activity in the colon.</a> Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).</li><li>Spencer, N. J., Bywater, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nerve+stimulation+evokes+a+premature+colonic+migrating+motor+complex+in+mouse.">Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse.</a> Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).</li><li>Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+of+colonic+motility+in+mouse+models+of+Hirschsprung's+disease.">Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).</li><li>Tough, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+peptide+YY+and+neuropeptide+Y+inhibit+colonic+ion+transport,+contractility+and+transit+differentially+via+Y(1)+and+Y(2)+receptors.">Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors.</a> Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).</li><li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps.">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li><li>Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Motility+Monitor+(GIMM).">Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM).</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Smith, T. K., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuttal+from+Terence+K.+Smith+and+Michael+D.+Gershon.">Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon.</a> J Physiol. 593, 3233 (2015).</li><li>Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrossTalk+opposing+view:+5-HT+is+not+necessary+for+peristalsis.">CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis.</a> J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).</li><li>Tabuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuroligin-3+mutation+implicated+in+autism+increases+inhibitory+synaptic+transmission+in+mice.">A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice.</a> Science. 318, 71-76 (2007).</li><li>Jamain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+X-linked+genes+encoding+neuroligins+NLGN3+and+NLGN4+are+associated+with+autism.">Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism.</a> Nat Genet. 34, 27-29 (2003).</li><li>Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+problems+in+children+with+autism,+developmental+delays+or+typical+development.">Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development.</a> J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).</li><li>Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+gastrointestinal+symptoms+in+children+with+autism:+a+population-based+study.">Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study.</a> Pediatrics. 124, 680-686 (2009).</li><li>Kohane, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+co-morbidity+burden+of+children+and+young+adults+with+autism+spectrum+disorders.">The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders.</a> PloS One. 7, e33224 (2012).</li><li>McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+symptoms+in+autism+spectrum+disorder:+a+meta-analysis.">Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis.</a> Pediatrics. 133, 872-883 (2014).</li><li>Peters, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid-compulsive+behaviors+are+associated+with+mixed+bowel+symptoms+in+autism+spectrum+disorder.">Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder.</a> J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).</li><li>Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+cholecystokinin+mediate+nutrient-induced+segmentation+in+guinea+pig+small+intestine.">Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).</li><li>Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+the+gut+microflora+of+children+with+autistic+spectrum+disorders+and+that+of+healthy+children.">Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children.</a> J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).</li><li>Buie, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation,+diagnosis,+and+treatment+of+gastrointestinal+disorders+in+individuals+with+ASDs:+a+consensus+report.">Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report.</a> Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).</li><li>Etherton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-linked+neuroligin-3+R451C+mutation+differentially+alters+hippocampal+and+cortical+synaptic+function.">Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).</li><li>Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autism-associated+point+mutation+in+the+neuroligin+cytoplasmic+tail+selectively+impairs+AMPA+receptor-mediated+synaptic+transmission+in+hippocampus.">An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus.</a> EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin+and+neuroligin+in+the+enteric+nervous+system+and+their+down-regulated+expression+levels+in+Hirschsprung+disease.">Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease.</a> Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+significance+of+neuroligins+in+myenteric+cells+of+Cajal+in+Hirschsprung's+disease.">Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease.</a> PloS One. 8, e67205 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+down-regulation+of+neuroligin-2+and+the+correlative+clinical+significance+of+serum+GABA+over-expression+in+Hirschsprung's+disease.">The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease.</a> Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).</li><li>Roberts, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+intestinal+motility+patterns+in+fetal+mice+are+not+mediated+by+neurons+or+interstitial+cells+of+Cajal.">The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal.</a> J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).</li><li>Barnes, K. J., Spencer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+colonic+migrating+motor+complexes+occur+in+mice+lacking+the+endothelin-3+gene?.">Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).</li><li>Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neural+oscillators+and+muscle+feedback+are+required+for+the+intestinal+fed+state+motor+program.">Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program.</a> PloS One. 6, e19597 (2011).</li><li>Heredia, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+role+of+mucosal+serotonin+in+colonic+propulsion+and+peristaltic+reflexes:+in+vitro+analyses+in+mice+lacking+tryptophan+hydroxylase+1.">Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1.</a> J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).</li><li>Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+of+intestinal+segmentation+in+guinea+pigs:+a+combined+computational+modeling+and+in+vitro+study.">Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).</li><li>Huizinga, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+segmentation+motor+activity+in+the+intestine.">The origin of segmentation motor activity in the intestine.</a> Nat Commun. 5, 3326 (2014).</li><li>Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatation+of+arterioles+by+acetylcholine+released+from+single+neurones+in+the+guinea-pig+submucosal+plexus.">Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus.</a> J Physiol. 420, 247-265 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Utilizzando questa tecnica di imaging video, frequenza CMMC è stata misurata come un&#39;indicazione di motilità del colon in topi wild-type e NL3 R451C, un modello murino di spettro autistico disturbo 17. I nostri risultati indicano una riduzione del numero di CMMCs nei topi mutanti NL3 R451C rispetto ai topi wild-type in presenza del 5HT 3/4 antagonista del recettore Tropisetron suggerendo che i topi NL3 R451C mostrano una maggiore sensibilità agli Tropisetron....

Il sistema nervoso enterico (ENS) è la rete neuronale intrinseca del tratto gastrointestinale e modula diverse funzioni come la digestione del contenuto intestinale, l&#39;assorbimento delle sostanze nutritive e la secrezione e riassorbimento di fluido. I neuroni del ENS si trovano nelle mienterici e sottomucosa plessi. Il plesso mioenterico svolge un ruolo importante nella regolazione della motilità gastrointestinale 1 mentre il plesso sottomucoso è principalmente coinvolto nel controllo della secrezione 2,3. Il plesso mioenterico si trova tra gli strati muscolari longitudinali e circolari della parete gastrointestinale. L&#39;attività contrattile degli strati muscolari lisce della parete intestinale facilita le funzioni primarie del tratto gastrointestinale mescolando e propulsione contenuto intestinale lungo la lunghezza dell&#39;intestino 3. Sebbene l&#39;innervazione estrinseca al tratto gastrointestinale dal CNS contribuisce alla funzione gastrointestinale in vivo, L&#39;ENS è in grado di regolare la funzione gastrointestinale in modo indipendente. Questa caratteristica unica permette l&#39;indagine funzionale dei circuiti neuronali enterici e il loro contributo alla motilità gastrointestinale ex vivo. Colon migrazione complessi a motore (CMMCs) sono spontanee, eventi neurogene che sono il modello del motore predominante osservato nel colon isolato mouse in assenza di pellet fecali 4-9. CMMCs sono definiti come contrazioni ritmiche che si propagano lungo una distanza orizzontale che è almeno metà della lunghezza totale del colon (cioè, dal cieco al retto) 10. Il rapporto tra CMMCs e gli schemi contrattili che spingono pellet fecali è ancora da essere chiaramente stabilita, tuttavia alcune differenze farmacologiche sono stati segnalati 11. Tuttavia, la capacità del ENS di funzionare indipendentemente del SNC e l&#39;esistenza di schemi motori neurali mediata nella SIcolon olated fornisce un sistema di test ideale per esaminare i disturbi della motilità che derivi dalla sottostante disfunzione ENS. La spontaneità di schemi motori gastrointestinali permette cambiamenti funzionali in risposta a stimoli farmacologici da valutare. L&#39;uso di immagini video e mappatura spazio-temporale è stato sviluppato per esaminare quantitativamente piccolo peristalsi intestinale nelle cavie 12. Qui, una tecnica ex vivo è descritto che consente lo studio di topo modelli di motilità del colon utilizzando immagini video e l&#39;analisi di queste registrazioni per costruire ad alta risoluzione (~ 100 micron, 33 msec) mappe del diametro del colon in funzione della posizione lungo il colon e di tempo (mappe spazio-temporali). L&#39;utilizzo in-house software di rilevamento dei bordi (Analyse2; a richiesta), i dati di piena lunghezza segmenti del colon contraente in tempo reale vengono elaborate per generare mappe spazio-temporali per ogni esperimento. In questa fase, i file video (AVI) sono summarizzato e convertito in mappe spazio-temporali che utilizzano Analyse2. Mappe spazio-temporali (Figura 2) descrivono contrattilità nel tempo e consentono di misurare più parametri quali la velocità di propagazione, ampiezza, lunghezza e durata. diametro Gut è registrato anche per tutta la durata dell&#39;esperimento come misura della contrattilità complessiva del segmento tissue. Questo metodo può essere applicato per identificare differenze nel punto di innesco di complessi contrattili che potrebbe indicare connettività neuronale enterica alterata. Un simile protocollo video di imaging progettato per valutare pellet propulsione in cavie &#39;stato segnalato 13 tuttavia qui descriviamo l&#39;applicazione dell&#39;approccio immagini video per la quantificazione della motilità del colon spontanea (cioè in assenza di pellet). Forniamo anche informazioni dettagliate per facilitare la dissezione e preparazione del tessuto gastrointestinale per l&#39;approccio di immagini video. Questoprotocollo fornisce ai ricercatori con uno strumento accessibile e facilmente replicato per l&#39;analisi enterico controllo neurale della funzione gastrointestinale in modelli animali di malattie tra cui modelli genetici di topo. La tecnica di immagini video permette l&#39;analisi della motilità del colon in risposta a vari agenti farmacologici. I farmaci possono essere somministrati tramite lume intestinale o il bagno per organi esterni alla preparazione del colon. Diverse regioni del tratto gastrointestinale topo mostrano modelli di motilità specifici come piccola segmentazione intestinale e CMMCs nel colon. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare le differenze di deformazione in piccola funzione intestinale; sensibilità differenziale 5-HT 3 e 5-HT 4 antagonisti sono stati osservati nel digiuno di Balb / c topi C57 / BL6 causa della natura polimorfica del gene TPH2 espressa nei due ceppi 6. L&#39;effetto di inibizione 5-HT sulla motilità rimane controversa, come dati contrastanti stato segnalato l&#39;importanza di endogena 5-HT su peristalsi del colon e CMMCs 14,15. Alterazioni della motilità pre e dopo la nascita durante lo sviluppo 7, e gli effetti di mutazioni del gene sulla motilità gastrointestinale in modelli animali di malattia 10 possono essere esaminati anche dal utilizzando immagini video. Qui illustriamo uso del metodo per lo studio della motilità del colon nel modello murino NL3 R451C di autismo, che esprime una mutazione missense nel gene che codifica per la NLGN3 sinaptica proteina di adesione neuroligin-3 16. Questa mutazione è stato identificato in pazienti con diagnosi di disturbo dello spettro autistico (ASD) 17, che è fortemente associato con IG disfunzioni 18-22. Abbiamo studiato se la mutazione sinaptica NL3 R451C colpisce uscite neurali nel ENS con la tecnica video di imaging. Presentiamo i dati che caratterizzano CMMCs al basale e in risposta alla 5H serotoninergicaT 3/4 antagonista del recettore tropisetron nel modello murino NL3 R451C di autismo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (MW: 58.44)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl (MW: 74.55)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (MW: 156.01)</td><td>Chem Supply</td><td>471-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (MW: 246.48)</td><td>Chem Supply</td><td>MA048</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (MW: 147.02)</td><td>Chem Supply</td><td>CA033</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anhydrous (MW: 180.16)</td><td>Chem Supply</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(MW: 84.01)</td><td>Chem Supply</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two chambered organ bath&lt;br/&gt; Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Contact Laboratory Directly&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1890573</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>0912-2006</td><td></td></tr><tr><td>SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-008</td><td></td></tr><tr><td>1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-007</td><td></td></tr><tr><td>1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 14</td><td></td></tr><tr><td>4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 15&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 -16</td><td></td></tr><tr><td>Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>100-400</td><td></td></tr><tr><td>CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water heater&amp;nbsp; (thermo regulator)&amp;nbsp;</td><td>Ratek&amp;nbsp;</td><td>TH7000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virtual Dub - 1.9 11</td><td>virtualdub.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2012a&amp;nbsp;</td><td>Graph Pad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam Software</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

video imaging and spatiotemporal maps to analyze gastrointestinal motility in mice

Il sistema nervoso enterico (ENS) gioca un ruolo importante nella regolazione gastrointestinale (GI) motilità e può funzionare indipendentemente dal sistema nervoso centrale. Cambiamenti nella funzione ENS sono una delle principali cause di sintomi gastrointestinali e malattie e possono contribuire a sintomi gastrointestinali riportati in disturbi neuropsichiatrici, tra cui l&#39;autismo. E &#39;ben noto che isolati segmenti del colon generano spontanei, contrazioni ritmiche note come colon Migrazione motore Complessi (CMMCs). Una procedura per analizzare la regolazione neurale enterica di CMMCs in ex vivo preparazioni di due punti del mouse è descritto. Il colon è sezionato dall&#39;animale e lavato per rimuovere i contenuti fecale prima di essere cannulate in un bagno d&#39;organo. I dati vengono acquisite tramite una telecamera posizionata sopra la vasca organo e convertito in mappe spazio-temporali ad alta risoluzione tramite un pacchetto software in-house. Utilizzando questa tecnica, i modelli contrattili di base e gli effetti farmacologici sulla funzione ENS a colon segments possono essere confrontati più di 3-4 ore. Inoltre, la lunghezza e la velocità di propagazione di CMMCs possono essere registrate così come i cambiamenti di diametro intestino e la frequenza di contrazione. Questa tecnica è utile per la caratterizzazione di modelli della motilità gastrointestinale in modelli di topi transgenici (e in altre specie, tra cui ratti e cavie). In questo modo, i cambiamenti indotti farmacologicamente in CMMCs sono registrati nei topi wild-type e nel modello di topo R451C neuroligin-3 di autismo. Inoltre, questa tecnica può essere applicata ad altre regioni del tratto gastrointestinale compreso il duodeno, digiuno e ileo e a diverse età dello sviluppo nei topi.

Fino al 90% dei pazienti con ASD sperimentare una vasta gamma di disturbi gastrointestinali, come diarrea e costipazione 18,24,25. Tuttavia, le cause di questi problemi gastrointestinali sono sconosciuti. Molte mutazioni identificate nei pazienti con ASD sono associati a proteine ​​sinaptiche che contribuiscono ad alterazioni e disturbi nella trasmissione o la funzione sinaptica. Una tale mutazione, nel gene che codifica per la molecola di adesione delle cellule neuroligin...

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Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

video-imaging-spatiotemporal-maps-to-analyze-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K Views.  The University of Melbourne. This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video: Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabbricazione e impianto di miniatura a doppio elemento Estensimetri per misurazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinale Contrazioni nei roditori.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Ricerca

Bioingegneria

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Immunologia e infezioni

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia per<em&gt; In Vivo</em&gt; Guarigione Imaging Multimodale di Cancerogenesi e valutazione della ferita intestinale e infiammazione

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Medicina

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor motilità gastrointestinale (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Biologia

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mappatura spazio-temporale di motilità in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparazioni di intestini

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion and absorption. For this reason, some of the motility patterns in the small bowel include segmentation for mixing of luminal contents and peristalsis for their propulsion. Physical properties of luminal contents modulate the patterns of small bowel motility. The mechanical stimulation of GI mechanosensory circuits by transiting luminal contents and underlying gut motility initiate and modulate complex GI motor patterns. Yet, the mechanosensory mechanisms that drive this process remain poorly understood. This is primarily due to a lack of tools to dissect how the small bowel handles materials of different physical properties. To study how the small bowel handles particulates of varying sizes, we have modified an established in vivo method to determine small bowel transit. We gavage live mice with fluorescent liquid or tiny fluorescent beads. After 30 minutes, we dissect out the bowels to image the distribution of fluorescent contents across the entirety of the GI tract. In addition to high-resolution measurements of the geometric center, we use variable size binning and spectral analysis to determine how different materials affect small bowel transit. We have explored how a recently discovered "gut touch" mechanism affects small bowel motility using this approach.

To study how the small bowel handles particulates of varying sizes, we have modified an established in vivo method to determine small bowel transit.

Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

Riepilogo

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Fabbricazione e impianto di miniatura a doppio elemento Estensimetri per misurazione

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in

Murino Endoscopia per