La microscopia intravitale della piccola mucosa intestinale può fornire informazioni sulla dinamica spaziotemporale delle interazioni cellulari all'interno dell'epitelio tra diversi tipi di cellule immunitarie o tra questi due compartimenti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'acquisizione di immagini ad alta velocità e ad alta risoluzione all'interno della mucosa intestinale in tempo reale. L'imaging vivo dell'intestino può fornire ulteriori informazioni sulle interazioni cellulari o sulla segnalazione cellulare coinvolta nell'immunità mucosa, nella biologia epiteliale o nella biologia del cancro.
Questo è un metodo impegnativo che richiede la pratica della tecnica chirurgica, nonché pazienza e posizionamento ottimale del mouse per l'acquisizione di immagini. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un topo transgenico anestetizzato, esprimendo una proteina fluorescente verde migliorata, o EGFP, recettore delle cellule T Gamma-delta, utilizzare una siringa tubercolina per iniettare lentamente 200 microlitri di soluzione colorante Hoechst 33342 appena preparata nel seno venoso retro-orbitale. Uno o due minuti dopo l'iniezione, applicare un unguento agli occhi dell'animale per evitare che si asciughino.
Quindi, fare un'incisione verticale di 2 CM attraverso la pelle e il peritoneo, lungo la linea mediana dell'addome inferiore e utilizzare forcep angolate per estrarre attentamente il caecum dalla cavità peritoneale. Identificare un'area di 2-3 CM dell'intestino tenue che contiene un contenuto fecale minimo, facendo attenzione a non strappare i vasi sanguigni mesenterici e riportare con cura il mento e l'intestino tenue rimanente nella cavità peritoneale, lasciando esternalizzato il segmento di interesse. Posizionando due paia di forcep su entrambi i lati del mesentere di sottolineatura tra i vasi sanguigni, strofinare delicatamente le punte delle forcep insieme per creare un buco nella membrana.
Usando pini angolati e un ago conico-punto curvo attaccato a una sutura da 5 CM, penetrare un lato del peritoneo attraverso il foro nella membrana e verso l'alto attraverso l'altro lato del rivestimento peritoneale, posizionando una sutura nella parte superiore e un'altra vicino alla parte inferiore dell'incisione per chiudere l'incisione, mantenendo l'anello dell'intestino esternalizzato. Per aumentare la probabilità di successo, non legare o strappare alcun vasi sanguigni mentre si posiziona la sutura addominale e limitare qualsiasi manipolazione estranea dell'intestino. Quindi, chiudere la pelle sotto l'anello intestinale nello stesso modo, posizionando una sutura nel mezzo dell'incisione tra le suture precedenti nel peritoneo di sottolineatura.
Utilizzando un elettrocautery, fare una linea di perforazione lungo il bordo antimesenterico e applicare immediatamente alcune gocce d'acqua sulla superficie dell'intestino per prevenire ulteriori danni ai tessuti indotti dal calore. Coagulare con un kimwipe per rimuovere l'acqua residua. Utilizzare le forbici vanna per tagliare una fessura orizzontale di circa 1,5 CM sul bordo distale del tessuto cauterizzato, lungo la lunghezza della linea cauterizzata, verso l'estremità prossimale del segmento tissutale esternalizzato.
Quando la superficie della mucosa è esposta, coprire l'addome con un kimwipe umido per mantenere il tessuto idratato. Per la microscopia confocale a disco rotante, trasportare il mouse al microscopio in un recipiente coperto. Lancia il software di imaging e inclina la testa del microscopio indietro e aggiungi 150 microlitri di 1 colorante micromolare alexa fluor e la soluzione salina tamponata di Hank sul fondo scivolato della copertura di vetro.
Posizionate il mouse in modo che la superficie mucosa aperta contatti direttamente il coverslip. Posizionare il mouse e il piatto sullo stadio di imaging in un'incubatrice pre-riscaldata. Impostate l'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione per ogni laser su non più di 10-15 milliwatt e 120-150 millisecondi, rispettivamente, e regolate la media fotogrammi su 2.
Attivate la funzione Guadagno moltiplicatore di elettroni per ridurre il rumore di fondo e selezionate la calibrazione obiettivo 63X per garantire una corretta misurazione della dimensione dei pixel. Utilizzando il laser da 405 nanometri e l'obiettivo dell'aria 20X, visualizzare manualmente i nuclei per localizzare un campo di villi privi di movimento o deriva evidenti, evitando aree di movimento artefatto dovuto alla respirazione, alla peristalisi o al battito cardiaco. Utilizzando la scansione X-Y, registrare la coordinata X-Y del campo di interesse e passare all'obiettivo 63X di immersione in glicerolo.
Acquisire un'immagine dal vivo sul canale di 405 nanometri per un massimo di 1 minuto per confermare che i villi nel campo selezionato sono stabili, regolando la messa a fuoco per trovare il piano ortogonale appena sotto la punta del villus. Quindi acquisire z-stack, partendo da appena sotto l'epitelio punta del villus, circa 15-20 micrometri fino al villus fino a quando non è difficile risolvere i nuclei, utilizzando 1,5 micrometri-gradini. 3-5 minuti dopo l'inizio dell'acquisizione, confermare la stabilità dell'immagine e la motilità delle cellule intraepiteliali Gamma-delta e continuare ad acquisire immagini per 30-60 minuti per ogni campo di villi.
I linfociti intraepiteliali gamma-delta mostrano un comportamento di sorveglianza dinamica, in cui pattugliano l'epitelio migrando lungo la membrana basale e nello spazio intercellulare laterale allo stato di studio. In queste immagini rappresentative, le tracce colorate indicano i percorsi migratori dei singoli linfociti intraepiteliali gamma-delta nel corso di 30 minuti. Sebbene la frequenza dei linfociti intraepiteliali nello spazio intercellulare laterale sia stata aumentata nei topi trattati con anticorpi beta del recettore anti-interleuchina-2, oltre il 30% di questi linfociti intraepiteliali gamma-delta presentava un comportamento al minimo.
Questo fenotipo al minimo è stato confermato da una significativa riduzione sia della velocità istantanea che del rapporto di confinamento dei linfociti intraepiteliali gamma-delta, a seguito del blocco interleuchina-2-recettore, rispetto ai controlli. Inoltre, i linfociti intraepiteliali gamma-delta inattivi avevano tempi di vita più lunghi, ed erano più frequentemente localizzati all'interno dello spazio intercellulare laterale, rispetto ai linfociti intraepiteliali gamma-delta mobile. Può essere difficile identificare campi di villi che mancano di movimenti eccessivi a causa della peristalisi.
Il riposizionamento del mouse può aiutare a localizzare un campo più stabile. Un'ulteriore analisi dei dati di tracciamento cellulare può aiutare a identificare un comportamento di motilità specifico o a fornire metriche aggiuntive per misurare le interazioni cellulari. L'imaging intravitale e l'analisi della motilità IEL sono diventati una lettura standard della funzione IEL, fornendo informazioni su come la segnalazione immunitaria innata regola la funzione IEL gamma-delta.
