Questo è un protocollo che studia come l'intestino tenue gestisce materiali di diverse proprietà fisiche e come distribuisce tali materiali nello spazio. È uno strumento complementare nel nostro studio della meccanosensibilità intestinale. I principali vantaggi di questo protocollo sono che può essere utilizzato per studiare materiali o miscele con proprietà fisiche diverse e che la risoluzione ci consente di risolvere transiti regionali su brevi segmenti intestinali.
Questa tecnica si aggiunge alla nostra comprensione della meccanosensibilità intestinale. Ci aiuta a capire come l'intestino tenue prende decisioni di transito in base ai segnali meccanici che riceve dal contenuto intraluminale. Per iniziare, preparare il gavage collegando un tubo di alimentazione di spessore 18 gauge e lunghezza di 50 millimetri a una siringa da 1 millilitro e aspirando 200 microlitri di soluzione RITC o soluzione di microsfere.
Quindi, trattenere manualmente l'animale a digiuno usando la tecnica di ritenuta con una sola mano, quindi inserire delicatamente il tubo di alimentazione attraverso la bocca e l'esofago del topo fino a quando non entra nello stomaco. Una volta inserito, espellere lentamente il contenuto della siringa nello stomaco e rimuovere con cautela il tubo dal mouse. Dopo il gavage, riportare il topo nella gabbia.
Prima di iniziare le dissezioni, accendere lo strumento di imaging in vivo in modo che raggiunga la temperatura desiderata. Dopo l'eutanasia, posiziona il topo in posizione supina su uno stadio di dissezione e appunta le sue quattro appendici sul palco per accedere all'addome. Quindi, bagnare la superficie dell'addome con etanolo al 70%.
Successivamente, utilizzare una pinza da micro-dissezione per tirare la pelle e fare un'incisione trasversale usando forbici chirurgiche affilate 1 centimetro sopra l'ano. Per esporre la cavità intraperitoneale, continuare l'incisione verticalmente sull'addome fino alla gabbia toracica. Maneggiare delicatamente l'intestino e apprezzare il loro orientamento nella cavità addominale prima di manipolarli.
Tagliare il prossimale alla giunzione gastroesofagea, separando così lo stomaco dall'esofago e sbrogliare delicatamente il colon, il cieco e l'intestino tenue tirando lentamente nella direzione opposta. Utilizzare forbici da micro-dissezione per separare gli attacchi del mesentere alle viscere. Successivamente, usando la pinza, trasferire le viscere sezionate sul foglio di misurazione.
Posizionare lo stomaco a 0 millimetri e disporre le viscere lungo il righello fino a 200 millimetri, quindi tagliare l'intestino a 200 millimetri con le forbici da microdissezione e ripetere questa procedura di allineamento intestinale. Una volta che il tessuto è disposto sul righello, disporre il cieco in parallelo con il tessuto, ma non a diretto contatto con esso. Posizionare il foglio di misurazione con il tessuto sezionato in un'area scura in modo che la fluorescenza possa essere conservata fino al momento dell'immagine.
Per avviare l'imaging ex vivo, aprire il software di imaging. Accedi e inizializza lo strumento di imaging per essere pronto per l'acquisizione delle immagini. Per il gavage RTC, impostare l'eccitazione a 535 nanometri e le emissioni, 600 nanometri.
Mentre per le sfere di microsfere verdi, impostare l'eccitazione a 465 nanometri e l'emissione a 520 nanometri. Ora, imposta l'esposizione su Auto e seleziona il campo visivo. Dopo essersi assicurati che l'intestino non si sia spostato durante il trasporto, posizionare il foglio di misurazione nello strumento all'interno del campo visivo.
Chiudere saldamente lo sportello dello strumento e selezionare Istantanea per fotografare il campo visivo. Salva le immagini raccolte su un'unità flash per l'analisi. Quindi, salva le singole acquisizioni delle immagini fluorescenti e fotografiche.
Una sovrapposizione della fotografia e della fluorescenza indica la posizione dei materiali fluorescenti nel tratto gastrointestinale. Aprire i file di immagine fluorescente e fotografare nel software di modifica delle immagini per l'analisi. Regola la dimensione in pixel di entrambe le immagini per avere le dimensioni esatte e chiudi il file della fotografia.
Per l'immagine fluorescente, utilizzare uno strumento gomma per rimuovere lo sfondo e renderlo trasparente. Create un nuovo livello. Scegliete un riempimento nero sul livello e trascinate il livello in modo che si trovi sotto il livello con l'immagine fluorescente e create uno sfondo completamente nero.
Salvare la nuova immagine fluorescente contenente solo il segnale fluorescente su sfondo nero come nuovo file TIF. Aprire le nuove immagini fluorescenti e fotografare in ImageJ. Trasforma ogni immagine in un'immagine a 30 bit scegliendo Immagine, quindi Tipo e 30 bit.
Create un'immagine unita di entrambi scegliendo Immagine, quindi Colore e Unisci canali. Nella finestra di dialogo visualizzata, selezionate il file di fotografia per il canale grigio e il file fluorescente in qualsiasi canale colorato. Disattivate la scala dell'immagine unita selezionando Analizza, quindi Imposta scala e fate clic per rimuovere scala.
Selezionate lo strumento rettangolo in ImageJ. Disegna un rettangolo attorno a una sezione dell'intestino tenue prestando molta attenzione alla larghezza di questa regione di interesse, poiché dovrebbe rimanere costante tra tutte le regioni di interesse. Duplicare la regione di interesse selezionando Immagine, seguita da Duplica e selezionare solo il canale corrispondente al canale colorato.
Anche in questo caso, utilizzate lo strumento Rettangolo per disegnare una regione di interesse su tutta la nuova immagine e recuperate un profilo di fluorescenza selezionando Analizza, seguito da Traccia profilo. Apri l'elenco dei valori e copiali nel software del foglio di calcolo. Ripetere i passaggi dal disegno della regione di interesse al recupero di un profilo di fluorescenza per ogni sezione dell'intestino tenue come descritto in precedenza su una riga di righello diversa.
Nel software del foglio di calcolo, moltiplicare ogni valore di intensità media per la larghezza costante del rettangolo della regione di interesse creata nel passaggio precedente. Questo produrrà il valore di intensità reale lungo l'intestino tenue in ogni punto. Di seguito sono mostrate le tracce medie di fluorescenza lungo la lunghezza dell'intestino tenue.
La distribuzione del materiale fluorescente varia in base alle proprietà del materiale del contenuto intraluminale. L'aumento del numero di contenitori utilizzati per ordinare gli stessi set di dati grezzi rivela caratteristiche di traccia granulari irrisolvibili con un numero inferiore di contenitori. I contenitori più piccoli riducono l'incertezza di misura, aumentano la risoluzione spaziale e riflettono meglio la componente distributiva della motilità dell'intestino tenue.
Il centro geometrico non riesce a caratterizzare completamente la distribuzione spaziale dei contenuti intraluminali. Questa limitazione della misura del centro geometrico è evidente nel confronto tra liquidi e perline più grandi. La traccia fluorescente delle perle più grandi è più distribuita, ma si attesta in media a un punto simile a quello del liquido, indipendentemente dalla granularità del binning, che evidenzia il limite di concentrarsi esclusivamente sul centro geometrico.
Per spiegare la natura distributiva delle contrazioni dell'intestino tenue, un'analisi spettrale di potenza è stata incorporata nel presente studio. Il grafico dello spettro di potenza dimostra che man mano che le dimensioni dei contenitori si riducono, possiamo osservare frequenze significativamente dominanti nello spettro delle perle più grandi, ma non in quello delle perle piccole. Alcune, ma non tutte, di queste frequenze dominanti aggiuntive sono presenti nello spettro liquido.
I passaggi più delicati di questo protocollo sono il gavage e la dissezione. Questi dovrebbero essere standardizzati dagli sperimentatori prima di eseguire questa tecnica per scopi sperimentali. Questo è un esperimento terminale, poiché l'animale ha bisogno di essere sacrificato.
Quando possibile, massimizza l'uso del tuo modello animale eseguendo altri esperimenti non terminali prima di questo. Il nostro gruppo ha recentemente utilizzato questa tecnica per supportare la nostra scoperta di set di contatto intestinale in cui l'intestino utilizza meccanorecettori epiteliali per percepire proprietà fisiche più fini, proprio come fanno le nostre dita.
