Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, premio ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti.

1. Preparazione di campioni di RNA-Seq <ol><li> Colture cellulari e trattamento <ol><li> Cultura le cellule MCF7 in MEM Improved (IMEM) più medium fenolo-rosso con 10% di calore inattiva FBS, 1% di penicillina / streptomicina a 37 ° C in umidificata 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. Nota: linea cellulare stesso e condizioni di coltura cellulare viene utilizzato nel corso dello studio. </li><li> Seed 100.000 cellule MCF7 per pozzetto in 6 pozzetti. Hanno triplicato per ogni trattamento. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 24 ore a 37 ° C in umidificata 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di isolamento dell&#39;RNA reattivo (acido guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio) in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Poi raccogliere il reagente lisato cellulare pipettando e deposito in provette da 1,5 ml </li></ol></li><li> Isolamento RNA <ol><li> Aggiungere 200 ml chloroform a 1 ml di lisato cellulare reattivo (1.1.3) e vortex per 10 secondi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa (superiore) in una nuova provetta senza disturbare le altre fasi. </li><li> Aggiungere 500 microlitri 100% di isopropanolo in un tubo con la fase trasferita-acquosa, e mescolare invertendo. Incubare a -20 ° C per una notte. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. Osservare una pellet sul fondo della provetta. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 750 microlitri RNasi-free 70% di etanolo da breve vortice. </li><li> Centrifugare i campioni a 6.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e centrifugare il campione a 16.000 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere tutto l&#39;etanolo residuo. Rimuovere l&#39;etanolo residuo pipettando con una punta di gel-carico e impostare i tubi fino rivolto verso il basso per asciugare per 10 minuti. Sciogliere il pellet in 20-50 acqua DEPC trattati ul Depending delle dimensioni del pellet. </li></ol></li><li> Purificare l&#39;RNA utilizzando RNA kit di pulizia seguendo il protocollo 4. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando un kit di test fluorimetria basato seguendo il protocollo 9. NOTA: OD a 260 nm è presa per determinare la concentrazione di RNA e il rapporto di OD a 260 nm e 280 nm sono utilizzati per determinare la purezza del campione. Si raccomanda il controllo della qualità RNA utilizzando test Bio-analizzatore. </li><li> Prendere circa 0,5 a 1 mg di RNA purificato per il sequenziamento. NOTA: il centro Biotech prepara le librerie di sequenziamento ed esegue abbinato-end leggere sequenziamento utilizzando metodi precedentemente descritti 2. </li></ol> 2. Preparazione del campione ChIP-Seq <ol><li> Colture cellulari e trattamento <ol><li> Seed 500.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita. NOTA: Per ogni tirare verso il basso sono stati utilizzati 16 tavole. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 a ognipiatto. Trattare le cellule per 45 min (37 ° C in umidificata 5% CO 2 atmosfera). </li></ol></li><li> Reticolazione e Cell Harvest <ol><li> Aggiungere 250 microlitri 37% di formaldeide in 5 ml di mezzo di reticolare cromatina, incubare a temperatura ambiente per 15 min. Smettere di reticolazione lavando le cellule con 5 ml di ghiaccio freddo 1x MEM. </li><li> Raccogliere le cellule in 250 microlitri cellulare Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-ossido dimethyldodecan-1-ammina) per piastra. </li></ol></li><li> La frammentazione della cromatina <ol><li> Sonicare le cellule per 30 sec x 8 a amplificatore di 30 per raggiungere dimensioni cromatina richiesti. Raffreddare ogni campione sul ghiaccio dopo una sonicazione di 30 sec. </li><li> Centrifugare a 16, 000 xg per 10 min a 4 ° C, e con attenzione a pipetta il sopranatante senza disturbare il pellet sul fondo. </li><li> Prendete una un&#39;aliquota 5 ml del surnatante, e controllare la dimensione del DNA mediante elettroforesi attraverso 1,5% gel di agarosio come descritto in precedenza 10. La dimensione idealedi DNA deve essere compreso tra 200-500 bp. </li></ol></li><li> immunoprecipitazione della cromatina <ol><li> Risparmia il 25 microlitri di lisato cellulare come input. In un tubo da 50 ml, mescolare 4 ml di lisato cellulare con 20 ml di tampone di IP (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, e 0,5% Triton X), anticorpo ERα (500 microlitri F10 e 500 microlitri HC- 20), e 500 microlitri Prota e protg proteine ​​rivestimento sfere magnetiche. Incubare la miscela per rotazione a 4 ° C durante la notte per consentire la formazione di anticorpo chromatin-. </li></ol></li><li> Lavaggi e Reverse-reticolazione <ol><li> Utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline magnetiche sul lato magnetizzato per rimuovere il tampone di lavaggio. </li><li> Lavare le perline magnetiche in 25 ml di tampone di lavaggio I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 150 mM NaCl). Per lavare accuratamente le sfere magnetiche senza disturbare complessi DNA-proteina, aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio lentamente al tubo lungo il lato poi invertire i tubi fino a quando tutte le sfere magnetiche sono misti ben with il tampone di lavaggio senza apparire come una pallina. In alternativa, utilizzare il rotatore per invertire il tubo. Non vortice dei campioni. Lavare le perline magnetiche con lo stesso metodo nelle seguenti fasi. </li><li> Lavare le perline magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 500 mM NaCl). </li><li> Lavare le sfere magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer III (1,6 mm EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate e 250 mm LiCl). </li><li> Lavare le perline magnetiche in 25 ml 1x tampone TE (1 mM EDTA e 10 mM Tris HCl) due volte. </li><li> Eluire il DNA in 500 microlitri tampone di eluizione (1% SDS, e 10 mm NaHCO 3) e poi assegnare l&#39;eluizione 500 microlitri DNA in 4 tubi. Per il DNA da ingressi, eluire il DNA in 125 microlitri tampone di eluizione. </li><li> Incubare le provette a 65 ° C durante la notte su un blocco riscaldante. Coprire le provette sul blocco di riscaldamento con un foglio di alluminio per mantenere il calore anche su tutti i tubi. Mettere un peso sui tubi per impedire loro di apertura. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Isolamento del DNA <ol><li> Raffreddare le provette a temperatura ambiente per 5 min. Isolare il DNA da campioni di tirare verso il basso utilizzando il kit di isolamento DNA chip. Seguire le istruzioni del produttore. <ol><li> Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame per ogni provetta. Se le forme precipitato, aggiungere un altro tampone di legame 250 microlitri fino a quando la soluzione è chiara. </li><li> Caricare il campione attraverso la colonna e centrifugare a 16.000 xg per 30 sec. Lavare il campione con 250 ml di tampone di lavaggio. Ricordarsi di aggiungere etanolo al tampone di lavaggio quando prima volta usarlo. Ripetere il lavaggio. </li><li> Eluire il DNA in 15 microlitri tampone di eluizione. Combina il DNA della stessa tirare giù da 4 tubi per ottenere circa 55 ml di DNA. </li></ol></li><li> Isolare il DNA ingresso utilizzando un kit di purificazione del DNA. <ol><li> Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame in ogni provetta e incubare per 10 min. Caricare il campione attraverso la colonna in 2 ml collectisul tubo. </li><li> Lavare il campione con 750 microlitri tampone di lavaggio, centrifugare a 16.000 xg per 1 min. Ripetere centrifugazione per eliminare ogni residuo di buffer. Eluire il DNA in 30 ml di EB. </li></ol></li><li> Misurare la concentrazione di DNA Utilizzando un commerciale Fluorocromo Assay con Modifica 11. <ol><li> Diluire il tampone TE 20x in 1x TE come tampone per diluire i campioni dei reagenti e del DNA. Prendere 5 ml DNA isolato e diluirlo in 50 ml di 1x TE. </li><li> Da / DNA ml di soluzione 2 mg fare uno standard di DNA che vanno dal bianco per 1, 10, 100, 1000 mg / ml. In un piatto ben 96, allocare 25 ml di ogni standard così come la diluizione del DNA in duplice copia. (Si consiglia triplicato per standard.) </li><li> Preparare il reagente di lavoro facendo una diluizione 200 volte da dsDNA reagente in tampone 1x TE in tubo di plastica. Coprire la soluzione reagente di lavoro con un foglio di alluminio per evitare la luce. Aggiungere 200 ml di reagente di lavoro in ogni campione. Incubate a temperatura ambiente per 5 min. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce. </li><li> Misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione a 480 nm, emissione 520 nm). Generare la curva standard del DNA di fluorescenza in funzione della concentrazione di DNA. Determinare le concentrazioni dei campioni in base alla curva standard generata DNA. </li></ol></li></ol></li><li> Verifica della ChIP esperimento utilizzando qPCR <ol><li> Take 2 ml isolate DNA e diluito in 20 ml di acqua. Impostare la reazione qPCR in triplice copia mescolando 2,5 ml di diluizione del DNA, 5 ml Green I PCR Master Mix, 1 ml di primer, e 1,5 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Eseguire il qPCR con il sistema rapido Real-Time PCR utilizzando il seguente programma: Fase 1: 95 ° C per 60 sec, Fase 2: 95 ° C per 10 secondi, 60 ° C per 60 secondi, ripetere il punto 2 39 volte. </li></ol></li><li> Invia campione di DNA 10 ng per il centro Biotech per il sequenziamento. NOTA: Il Biotech Centro prepara il DNA ChIP in librerie in base alle istruzioni, ed esegue la sequenza singola lettura utilizzando metodi precedentemente descritti 2. </li></ol> 3. Metabolomica Assay Preparazione del campione <ol><li> Colture cellulari e trattamento <ol><li> Seed 400.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita. Per ogni trattamento preparare tre campioni. Utilizzare due piastre in ciascun campione per ricevere abbastanza cellule per la rilevazione. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 alle cellule. Trattare le cellule per 24 ore (37 ° C in umidificata 5% CO 2 atmosfera). </li></ol></li><li> Raccolta dei campioni <ol><li> Aggiungere 5 ml ghiacciata PBS 1x alla piastra, aspirare il PBS dopo breve inclinando la piastra più volte. Ripetere due volte, e rimuovere il più PBS possibile dopo l&#39;ultimo lavaggio. </li><li> Aggiungere 750 ml di acetone pre-freddo per ciascuna piastra e raschiare le cellule. Combinare le cellule in acetone da due piastre ain una provetta 2 ml su ghiaccio. </li><li> conta delle cellule per la normalizzazione <ol><li> Per ogni trattamento, usare due piastre supplementari per la quantificazione delle cellule. Per de-fissare le cellule dalla piastra, aggiungere 2 ml di SE tampone (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO 3 e 1 mM EDTA) in ogni piatto e incubare per 5 min. </li><li> Raccogliere e mescolare bene le cellule pipettando le cellule nel buffer HE. Utilizzare totale di 20 microlitri soluzione cella per contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol></li></ol></li><li> Conservare i campioni a -80 ° C prima di inviare al centro Metabolomica di identificare e quantificare i metaboliti mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC-MS) analisi. </li></ol> 4. Analisi Integrativa <ol><li> RNA-Seq Analisi dei dati: <ol><li> Eseguire il controllo qualità dei file FASTQ utilizzando FastQC: Leggi QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Selezionare FastQC: Leggere sotto lo strumento di NGS: QC e manipolazione. Carica il file di dati grezzi da histor correntey. NOTA: Si raccomanda di dare un titolo per il file di output per ricordare ciò che il lavoro è stato per dato che ci potrebbe essere più uscite. </li></ol></li><li> Esegui e apparirà il file di output sotto la Storia. Ripetere la stessa procedura per ogni file di sequenza. adattatori trim mediante clip in NGS: FASTX Toolkit. </li><li> Allinea legge per hg19 utilizzando Tophat2 con RefSeq genoma di riferimento annotazione 12 (valori di default). <ol><li> Selezionare Tophat2 sotto strumento di NGS: analisi di RNA. Indicare libreria di tipo accoppiato (single-end vs abbinato-end). </li><li> Carica il file di input FASTQ dalla storia attuale. Selezionare il genoma di riferimento. Scegliere le impostazioni predefinite. Oppure utilizzare l&#39;elenco dei parametri completo da modificare. </li><li> Esegui e produrrà due file di output: uno è UCSC LETTO traccia di raccordi; un altro è un elenco di allineamenti di lettura in formato BAM. </li></ol></li><li> Caricare file BAM di strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Calcolare i valori di espressione utilizzando QuantStrumento ification. </li><li> Identificare geni differenzialmente up-regolati utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento&gt; 2 e p-value &lt;0.05. Allo stesso modo, identificare i geni differenzialmente down-regolato utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento &lt;0,5 e p-value &lt;0.05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Analisi dei dati: <ol><li> Allineare FASTQ Legge di hg19 utilizzando Bowtie2 13 (valori di default) in Galaxy. <ol><li> Selezionare Bowtie2 sotto lo strumento di NSC: Mapping. Verificare se la libreria è mate-abbinato (single-end vs abbinato-end). Carica il file FASTQ dalla storia attuale. </li><li> Selezionare il genoma di riferimento. Utilizzare le impostazioni dei parametri di default. Esegui e produrrà file di output con la sequenza mappata legge come file di BAM. Ripetere la procedura per ogni file di sequenza. </li></ol></li><li> Identificare i picchi che utilizzano MACS 14 un valore p di taglio del 6.0e-7 e FDR di 0,01, come descritto in precedenza 2. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomica Analisi dei dati: <ol><li> Convertire nomi chimici dei metaboliti di KEGG_IDs. </li><li> Identificare metaboliti differenziale regolamentati confrontando i livelli rilevati nel veicolo vs. E2 trattati campioni (2 volte cut-off è stato utilizzato in questo studio). </li></ol></li><li> Analisi Integrativa: <ol><li> Identificare i geni che hanno siti di legame ERα utilizzando lo strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Tradurre Regioni alla funzione geni utilizzando 20 kb come distanza di cut-off. </li><li> Identificare geni differenzialmente l&#39;alto e verso il basso-regolato dalla analisi dei dati di RNA-Seq utilizzando cambiamento fold&gt; 2 e ripiegare il cambiamento &lt;0,5, rispettivamente, con il p-value &lt;0.05 come tagliare. Confrontare l&#39;elenco dei ERα sito di legame che contengono geni che utilizzano Venn confronto diagramma. </li><li> Utilizzare questo elenco per identificare E2 vie metaboliche modulati utilizzando il modulo Metscape 15 di Cytoscape. <ol><li> Selezionando modulo Metscape da applicazioni, scegliere costruire una rete e poi pathway-basopzione ed. </li><li> Selezionare l&#39;Organismo (umano). Selezionare file di dati di E2 elenco composto non regolamentata (KEGG ID) e E2 up-regolata lista gene. </li><li> Scegli Composto -Reaction -Enzyme-Gene come tipo di rete. Scegli composti / geni come la query. </li><li> Costruire una rete. Ripetere con l&#39;E2 down-regolato composto e geni. </li></ol></li></ol></li></ol>

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University of Illinois ha ricevuto una sovvenzione di investigatore Iniziato da Pfizer Inc. ZME e YCZ ha ricevuto il sostegno di stipendio da questa concessione.

In questo articolo, abbiamo descritto la generazione e l&#39;analisi integrativo di RNA-Seq, Chip-Seq dati e metabolomica da cellule MCF-7 che sono trattati con E2. Abbiamo sviluppato una serie di protocolli strategizing di utilizzare i metodi più efficienti e user-friendly articoli molli che producono scoperta biologicamente rilevanti. A nostra conoscenza, il nostro è il primo studio a integrare omiche dati provenienti da tre diverse analisi e nuove vie metaboliche identificate che ERα regolato direttamente nelle ce...

Gli estrogeni sono importanti regolatori di molti processi fisiologici in entrambi i maschi e femmine, tra cui tessuti riproduttivi, tessuti metabolici, cervello e ossa 1. Oltre ai benefici effetti in questi tessuti, estrogeni guidare anche i tumori che derivano da mammaria e tessuti riproduttivi. Estrogeni lavorano principalmente attraverso ER per indurre effetti specifici tipo di cellula. sequenziamento profondo delle trascrizioni regolate da ERα utilizzando RNA-Seq e genome-wide ERα DNA analisi siti di legame con ChIP-Seq ha dimostrato di essere utile per capire come funziona ERα in diversi tessuti e tumori che ne derivano. Noi e altri abbiamo pubblicato profili di espressione genica associati a recettori diversi (ERα vs ERβ) 2,3, differenti ligandi 3-5 e diverse coregulators 2,4,6,7. RNA-Seq è il metodo principale per esaminare il trascrittoma, offrendo una maggiore precisione ed efficienza rispetto a ba microarraygene sed analisi di espressione 8. RNA ottenuto da linee cellulari 2-4,7, tessuti o campioni di tumore sono in sequenza, mappato alle assemblee genomiche disponibili e geni differenzialmente regolati sono identificati. Immunoprecipitazione della cromatina (chip) è impiegato per sezionare il fattore di trascrizione e coregulator legame con noti siti di normative vincolanti cromatina. ChIP-Seq (ChIP seguita da alta sequenziamento rendimento) fornisce il rilevamento imparziale dei siti di legame a livello mondiale. Metabolomica è un altro approccio di sistema biologico sempre più utilizzato, che quantitativamente misure, risposta multiparametrica dinamica dei sistemi viventi a vari stimoli, tra cui i prodotti chimici e le perturbazioni genetiche. Eseguendo profilo metabolico globale, una lettura funzionale può essere ottenuta da cellule, tessuti, e sangue. Inoltre, le informazioni da esperimenti trascrittoma non riflettono sempre i cambiamenti reali nel livello di enzimi che contribuiscono alla vie biochimiche. Combinatoanalisi dei dati trascrittoma e metaboloma ci permette di identificare e correlare i cambiamenti nell&#39;espressione genica con i cambiamenti dei metaboliti attuali. Sfruttando le informazioni provenienti da tutti questi gruppi di dati su larga scala forniscono i dettagli meccanicistici per comprendere il ruolo dei fattori di trascrizione che regolano i sistemi biologici complessi, in particolare quelli che riguardano lo sviluppo e malattie come il cancro e il diabete umano. La natura complessa del genoma dei mammiferi rende difficile integrare e interpretare i dati ottenuti dagli esperimenti trascrittoma, cistrome e metaboloma completamente. Identificare gli eventi di legame funzionali che avrebbe portato a cambiamenti nell&#39;espressione dei geni bersaglio è importante perché una volta che i siti di legame funzionali sono identificati; conseguente analisi, tra cui vincolante di trascrizione (TF) analisi motivo, potrebbero essere eseguite con maggiore accuratezza. Questo porta alla identificazione di cascate TF biologicamente significativi e meccanismi. Comparis anche direttisu esperimenti RNA-Seq e Chip-Seq non sempre possibile in quanto i dati di ciascun esperimento sono diverse scale e rumori e in alcuni casi segnali significativi vengono oscurati dal rumore popolazione. Non siamo a conoscenza di alcun studio che integra le informazioni da questi tre approcci indipendenti ma collegati per capire la regolazione metabolica diretta da ERα nel cancro al seno. Pertanto, il nostro obiettivo generale di questo lavoro è di mettere in relazione gli eventi produttivi vincolanti alle espressione genica e le modifiche dei metaboliti. Al fine di raggiungere questo obiettivo, abbiamo integrato i dati da RNA-Seq, Chip-Seq esperimenti e metabolomica e individuato i estrogeni indotti ERα eventi che avrebbero portato a cambiamenti di espressione genica in vie metaboliche vincolante. Per la prima volta, mettiamo a disposizione un set completo di protocolli (Figura 1) per la generazione di ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolomica profiling e l&#39;esecuzione di analisi integrativa dei dati per scoprire circuiti genici romanzo che regolano il metabolismo del senolinee cellulari di cancro.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Soluble powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA isolation of input sample&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA Quantitation</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>DEPC Treated Water&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>With 1/8 probe&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>For sound reduction</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 bags of 100 ea.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% agarose gel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA quantification (100 assays)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>For 100 assays</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer

Con l&#39;avvento dei -omica si avvicina la nostra comprensione delle malattie croniche come il cancro e la sindrome metabolica è migliorata. Tuttavia, efficace estrazione di informazioni contenute nei set di dati di grandi dimensioni che si ottengono da microarray di espressione genica, esperimenti di sequenziamento profonde o profili metabolici è essenziale per scoprire e quindi efficacemente indirizzare i regolatori critici del fenotipo delle cellule malate. Estrogen Receptor α (ERα) è uno dei fattori di trascrizione maestro che regolano i programmi genetici che sono importanti per i tumori al seno estrogeno sensibili. Al fine di comprendere il ruolo di ERα segnalazione in seno metabolismo del cancro abbiamo utilizzato i dati trascrittomica, cistromic e metabolomica da MCF-7 cellule trattate con estradiolo. In questa relazione abbiamo descritto la generazione di campioni per l&#39;RNA-Seq, Chip-Seq e gli esperimenti di metabolomica e l&#39;analisi computazionale integrativa dei dati ottenuti. Questo approccio è utile nel delineare romanzo talpameccanismi colari e circuiti gene regolatore che sono regolati da un particolare fattore di trascrizione che impatti il ​​metabolismo delle cellule normali o malati.

trascrittomica Per analizzare i geni espressi in modo differenziale di trattamento E2, abbiamo scelto di eseguire un esperimento di RNA-Seq. Oltre a fornire informazioni sui livelli di mRNA, sequenze di Rna-Seq possono anche essere utilizzati per monitorare i cambiamenti (RNA lunghi non codificanti, microRNA) non codificanti RNA e gli eventi di splicing alternativo. Noi non forniamo informazioni sull&#39;analisi dei geni non codificanti RNA o, in alternativa trascritte, in quanto ...

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Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Views.  University of Illinois, Urbana-Champaign. Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol. 

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An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Ricerca

Biochimica

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Ricerca sul cancro

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicina

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

A Modified<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion test per determinare il ruolo potenziale di ormoni, citochine e / o fattori di crescita nella mediazione Cancer Invasion cellulare

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using 16&#945;-[18F]-Fluoro-17&#946;-Estradiol PET to Visualize Estrogen Receptor &#945; Expression in Human Breast Cancer Xenografts in Female Ovariectomized Mice

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET), ovariectomized BALB/c nude mice were injected with ER&#945;-positive breast cancer cells (MCF-7, 3 &#215; 106 cells; shoulder [n = 10] or 4th inguinal mammary fat pad [n = 10]) or ER&#945;-negative breast cancer cells (MDA-MB-231, 1 &#215; 106 cells; mammary fat pad [n = 5]). Mice harboring MCF-7 cells received subcutaneous injections of 20 &#181;g of 17&#946;-estradiol (20 &#181;g/20 &#181;L; corn oil:ethanol, 9:1) in the nape of their necks 2 days prior to cell injection, followed by daily injections five times per week for 5 weeks. Tumor volumes were measured according to the formula: (L*W2)/2 (L; length, W; width). Once tumor volumes reached approximately 100 mm3, 17&#946;-estradiol injections were halted 2 days prior to mice receiving 18F-FES for PET imaging to avoid competitive binding with ER&#945;. Upon 18F-FES administration via the lateral tail vein, PET/MRI was performed for 15 min at 1 h to 1.5 h post-injection. 18F-FES uptake was not observed in ER&#945;-negative, MDA-MB-231 tumor-bearing mice. 18F-FES uptake was most pronounced in mice harboring MCF-7 tumors in the shoulder. In MCF-7 tumors grown in the inguinal mammary fat pad, 18F-FES uptake was less visible, as the intestinal excretion pattern of 18F-FES obscured the radioactivity detectable in these tumors. To use 18F-FES PET as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts, we demonstrate that the visibility of 18F-FES uptake is clear in tumors located away from the abdominal region of mice, such as in the shoulder.

Here, we demonstrate a protocol to use 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET) as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts.

Utilizzo della PET 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolo per visualizzare l'espressione del recettore degli estrogeni α negli xenotrapianti di carcinoma mammario umano in topi femmina ovariectomizzati

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using ...

Meccanismo del salidroside nella soppressione della migrazione e della proliferazione cellulare MCF-7

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

Autore in primo piano: Esplorazione dei meccanismi molecolari del salidroside nel trattamento del cancro al seno 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

A Modified

Un

Utilizzo della PET 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolo per visualizzare l'espressione del recettore degli estrogeni α negli xenotrapianti di carcinoma mammario umano in topi femmina ovariectomizzati

Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7

Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7

Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7