Questo è il primo protocollo che consente al tessuto mammario umano di essere mantenuto vivo ex vivo per lunghi periodi di tempo consentendo direttamente lo studio delle interazioni tra il tessuto mammario umano e il cancro al seno umano. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di mantenere in vita ex vivo pezzi macroscopici del tessuto mammario umano tra cui adipociti mammari, cellule immunitarie, strutture vascolari, strutture duttali e matrice extracellulare. Questa tecnica ha importanti implicazioni per diverse aree della ricerca sul cancro al seno tra cui la medicina personalizzata, lo sviluppo farmaceutico e la fisiopatologia dell'iniziazione al tumore e processi di cancro al seno più lenti come la fibrosi e il rimodellamento della matrice extracellulare.
A dimostrare questa procedura sono Katherine Hebert, una studentessa di tulane e Rakesh Gurrala una studentessa di medicina Tulane del mio laboratorio. Per iniziare, sciogliere la soluzione di gelatina preparata in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta sierologica a cinque o 10 millilitri per erogare 2,5 millilitri di questa soluzione su ogni pistone per pozzi di una piastra a sei pozzetti.
Una volta che la gelatina si è solidificata, spostare le piastre ASC codificate pNIPAAm nell'armadio di biosicurezza. Posizionare delicatamente i pistoni nei pozzi di questi piatti in modo che la gelatina contatti gli ASC. Posizionare una rondella metallica sullo stantuffo per appesantirla in modo che la gelatina sia a diretto contatto con la lastra ASC per 30 minuti a temperatura ambiente.
Spostare delicatamente la piastra con i pistoni nella scatola sterile nell'armadio di biosicurezza e posizionare il coperchio su di essa. Spostare la scatola in un frigorifero di quattro gradi o posizionare la piastra sul ghiaccio e un secchio di ghiaccio nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti. In un armadio di biosicurezza, lavare il tessuto mammario umano tre volte con 10 millilitri di PBS sterile.
Utilizzare forcelle sterili e una lama di rasoio per tritare grossolanamente la BC-MPS e cercare di rimuovere quanta più fascia e tessuto connettivo possibile. Una volta rimosso il tessuto connettivo, utilizzare una lama sterile per tritare finalmente il tessuto fino a quando non ha una consistenza liquida omogenea. Tagliare la punta di una punta della pipetta P1000 per facilitare la pipettazione del tessuto tritato.
In un tubo da 1,5 millilitri, unire il tessuto tritacanza, le linee cellulari tumorali e i supporti BC-MPS come descritto nel manoscritto testuale. Spostare la piastra ACS che verrà utilizzata per il foglio di celle inferiori dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e aspirare il supporto dalla piastra. Pipettare la miscela di tessuto mammario preparata al centro del pozzo della piastra ACS inferiore utilizzando la punta della pipetta tagliata, spostare la scatola contenente la piastra ACS superiore con pistoni nell'armadio di bio-sicurezza.
Rimuovere delicatamente i pistoni di gelatina dalla piastra rivestita pNIPAAm e posizionarli sopra la miscela di tessuto. Aggiungere i supporti BC-MPS al pozzo e spostare con attenzione le piastre ACS inferiori con la miscela BC-MPS e i pistoni nella scatola di plastica sterile. Posizionare il coperchio della scatola per il trasporto, facendo attenzione ad evitare la contaminazione della coltura.
Incubare la piastra inferiore nella scatola e l'incubatore di 37 gradi Celsius fino a quando la gelatina non viene sciolta e lo strato ACS superiore ha iniziato ad aderire allo strato inferiore. Quindi spostare la scatola con le piastre nell'armadio di biosicurezza, rimuovere delicatamente i pistoni dalle piastre inferiori per osservare il tessuto con le cellule tumorali ancorate sul fondo del pozzo. Riposizionare il coperchio della piastra a sei pozzi sulla piastra inferiore e incubare a 37 gradi per sciogliere completamente la gelatina e consentire allo strato superiore di ancorarsi allo strato inferiore.
Spostare delicatamente le piastre in un armadio di biosicurezza e aspirare il supporto dal bordo del pozzo con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Aggiungere due millilitri di mezzi freschi sul bordo di ogni pozzo per evitare di slogare il tessuto. Mantenere il BC-MPS a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per il periodo di tempo desiderato.
Cambiare i media ogni due o tre giorni. Spostare la piastra nell'armadio di biosicurezza quando bc-MPS è pronto per essere analizzato. Rimuovere i supporti con una pipetta sierologica per evitare lo slogaggio accidentale di qualsiasi tessuto.
Aggiungere un volume di PBS a ciascun pozzo. Quindi rimuovere il PBS con una pipetta sierologica. Aggiungere un millilitro di soluzione di dissociazione cellulare ad ogni pozzo e spostare la piastra nell'incubatrice per cinque minuti per consentire a queste cellule di staccarsi.
Dopo l'incubazione, utilizzare un raschietto cellulare per staccare completamente le cellule e il tessuto dalla piastra di coltura in un armadio di biosicurezza. Trasferire la soluzione con il tessuto in un tubo conico da 15 millilitri e raccogliere tutte le cellule rimanenti aggiungendo due millilitri di PBS. Avvolgere il tubo con un foglio di alluminio se le celle sono fluorescenti.
Incubare il tubo a 37 gradi sotto agitazione costante in uno shaker orbitale in una volta G per 10-20 minuti per dissociare completamente le cellule dal tessuto. In un armadio di biosicurezza, utilizzare una pipetta sierologica per interrompere eventuali grumi rimanenti di cellule nel tubo. E filtrare il campione attraverso un colino tissutale da 250 micro metri in un nuovo tubo da 15 millilitri.
Risciacquare il colino con un millilitro di PBS per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Centrifugare i campioni a 500 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti per separare gli adipociti che galleggiano nello strato superiore dalle cellule tumorali e dagli ASC mescolati insieme in un pellet. Trasferire lo strato di adipocite su un nuovo tubo utilizzando una punta di pipetta con taglio smussato.
Centrifugare nuovamente il campione e utilizzare una siringa e un ago per rimuovere la soluzione rimanente dal basso degli adipociti. Aspirare la soluzione rimanente dal tubo contenente gli ASC e le cellule tumorali senza interrompere il pellet cellulare. Sospendere di nuovo il pellet nei supporti PBS o BC-MPS e utilizzare la citometria di flusso per ordinare le cellule in base alla fluorescenza.
Il modello stri-aided del foglio ASC confluente è mostrato qui. Il tessuto mammario umano vivace era ancorato stabile dai fogli cellulari ASC sul fondo del pozzo dopo 14 giorni di coltura. Le immagini di microscopia fluorescente dimostrano la stabilità del BC-MPS con MDA-MB-231 che esprime linee cellulari RFP dopo 14 giorni e con triplo tumore negativo espianta PDX per almeno sei giorni.
Bc-MPS contenente tessuto mammario è stato coltivato in vitro per 14 giorni, macchiato e immagine per dimostrare gli elementi nativi del tessuto con ingrandimento 100X e 20X. La colorazione dei marcatori dei macrofagi è stata utilizzata per mostrare la conservazione dei macrofagi primari dopo tre e sette giorni di coltura. L'analisi citometrica del flusso delle cellule MDA-MB-231 macchiate di Bodipy dopo 14 giorni indica un minimo accumulo lipidico nella coltura 2D e un ampio accumulo lipidico e BC-MPS.
La proporzione di cellule MDA-MB-231 lipidiche positive era 26,2 volte maggiore in BC-MPS rispetto alla coltura 2D. Le cellule coltivate in BC-MPS visualizzate aumentano le goccioline lipidiche rispetto alle cellule coltivate in coltura 2D standard. Le immagini time-lapse di RFP etichettate BC-MPS con cellule MDA-MB-231 mostravano un movimento ameboide di 231 cellule con pseudo pod e alta motilità.
Il tessuto mammario deve essere tritato abbastanza piccolo e separato abbastanza da essere distribuito sul fondo del pozzo. Il tessuto mammario è molto vivace e se i pezzi sono troppo grandi o raggruppati troppo strettamente insieme, i fogli cellulari ASC non saranno in grado di ancorare il tessuto mammario al fondo del pozzo. I costrutti di cancro al tessuto mammario risultanti possono subire una digestione enzimatica per isolare particolari tipi di cellule di interesse.
Ciò consentirà di rispondere a domande chiave come come le cellule tumorali nel tessuto mammario rispondono in modo diverso alla chemioterapia rispetto alla coltura 2D tradizionale o agli organoidi.
