Questo protocollo consentirà ai ricercatori di rispondere a domande importanti sui modelli neuronali di connettività e organizzazione spaziale che sono alla base della funzione all'interno di un circuito. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione di morfologie neuronali situate in profondità all'interno di tessuti tridimensionali intatti. Questo metodo è semplice e quindi facilmente riproducibile.
Gli sperimentatori per la prima volta dovrebbero essere a proprio agio nell'eseguire questa tecnica. È imperativo avere un campione di tessuto chiaro per ottenere dati di alta qualità. La dimostrazione visiva di un'appropriata chiarezza dei tessuti e delle tecniche di compensazione consentirà risultati facilmente riproducibili.
Per iniziare, posizionare il tessuto cerebrale immerso nell'idrogel in un incubatore a vuoto per tre ore a 37 gradi Celsius con meno 90 kilopascal di vuoto. Lasciare la parte superiore del tubo svitata per consentire al vuoto di formarsi correttamente. Lavare il tessuto con PBS per 10 minuti a temperatura ambiente con un leggero scuotimento.
Posizionare il campione di tessuto polimerizzato nella camera di elettroforesi, tenendo traccia dell'orientamento del tessuto all'interno della camera. Riempire la camera e il serbatoio con il buffer SDS per elettroforesi in dotazione. Eseguire il campione a 70 volt, un ampere e 35 gradi Celsius con corrente costante per circa due ore per millilitro di tessuto.
Controllare periodicamente il campione per una sufficiente pulizia del tessuto cerebrale rimuovendolo dalla camera e sostituendolo nello stesso orientamento. Dopo che il campione ha terminato la pulizia, lavarlo in PBS durante la notte a temperatura ambiente, sostituendo il PBS con PBS fresco il più spesso possibile. Dopo il lavaggio finale in PBS, lavare il tessuto per cinque minuti in acqua deionizzata a temperatura ambiente tre volte.
Il tessuto diventerà opaco e potrebbe espandersi. Incubare il tessuto nella soluzione corrispondente all'indice di rifrazione per almeno quattro ore a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, costruire una camera di alloggiamento adatta per l'immagine del campione.
Inizia usando una diapositiva di vetro come base per il montaggio, quindi posa i distanziali in gomma o plastica e fissali con super colla, assicurandoti che non ci siano fori. Posizionare il tessuto trasparente nella camera di montaggio preriempita con la soluzione corrispondente all'indice di rifrazione. Montare saldamente il tessuto posizionando una copertura di vetro sulla parte superiore e sigillandola con lo smalto per unghie.
Immagina questo tessuto aggiungendo una goccia di soluzione di montaggio corrispondente all'indice di rifrazione direttamente sulla parte superiore del vetro. Per costruire una grande camera di imaging tissutale per tessuti con uno spessore superiore a cinque millimetri, utilizzare un piatto di vetro di 10 centimetri con una parete alta. Posizionare un tubo conico da 50 millilitro al centro, assicurandosi che il diametro del tubo sia abbastanza grande da accettare la canna della lente dell'obiettivo utilizzato.
Fare il 3% di agarose in acqua e versarlo nello spazio tra il piatto di vetro e il tubo conico, quindi lasciarlo raffreddare per un'ora. Questo formerà un anello di agarose solido. Aderire saldamente il tessuto sul fondo della camera usando super colla e riempire la camera con una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, che può iniziare a polimerizzare a meno che non venga preservata dall'aria e conservata a quattro gradi Celsius.
Acquisire l'immagine utilizzando un microscopio confocale. Accendere tutte le apparecchiature di imaging pertinenti. Posizionare il campione sul palco.
Avvicinati con attenzione ai media di immersione con l'obiettivo e forma una colonna continua di media. Usando l'epifluorescenza, trova un campo di imaging appropriato. Inizia impostando le impostazioni di risoluzione e velocità di scansione.
Se si utilizza un microscopio confocale, chiudere completamente il foro stenopeico per ottenere la sezione ottica più piccola e quindi la migliore risoluzione Z. Aumentare gradualmente la potenza del laser o il guadagno del sensore fino a ottenere un'immagine adatta con un elevato rapporto segnale-rumore. Se si utilizza l'imaging a due colori EGFP o tdTomato standard, impostare le impostazioni di raccolta della luce.
Impostare i parametri Z-stack in base ai punti di inizio e fine osservati del tessuto. Impostare la dimensione del passo in base alla risoluzione Z desiderata. Le dimensioni dei gradini più piccole produrranno una maggiore risoluzione Z, ma potrebbero portare allo sbiancamento del campione.
Quando sei soddisfatto delle impostazioni di acquisizione dell'immagine, acquisisci l'immagine. Assicurarsi che l'immagine abbia un elevato rapporto segnale/rumore e mostri confini distinti delle strutture. Dopo l'acquisizione dell'immagine, la morfologia cellulare rappresentativa è stata analizzata utilizzando statistiche incorporate e classificando gli script all'interno del software di analisi.
I dati raccolti riflettono che il neurone 2 ha una struttura più grande di quella dendritica con una maggiore densità di spine rispetto al neurone 1. Per corroborare questo risultato, è stata eseguita un'analisi standard di Scholl, che afferma che il neurone 2 è più dendricomente complesso del neurone 1, come indicato dall'aumento del numero di intersezioni di Scholl a 50-100 micrometri dal soma. Il neurone 1 contiene una percentuale maggiore di spine con forme più simili a filopodi ed è un sottotipo di colonna vertebrale immatura.
Le spine con teste definite, chiamate spine di funghi, probabilmente contengono sinapsi più sviluppate e mature. Pertanto, il neurone 2 è più maturo con una maggiore densità di spine mature. Dopo la pulizia, i pezzi di tessuto possono essere colorati usando l'immunoistochimica tradizionale.
