Name: a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
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Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Tutte le procedure di Xenopus e gli studi sono stati condotti in conformità alla guida NRC per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio 8 ° edizione. I protocolli sono stati approvati dalla University of Wyoming Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (Assurance # A-3216-01). 1. Preparazione di X. Estratto laevis Egg (adattato da 27,28) <ol><li> Prime X. femminile laevis rane un minimo di tre giorni e un massimo di due settimane prima della raccolta delle uova con una singola iniezione 100 UI di gravidanza gonadotropina del siero di cavalla (PMSG). </li><li> Un giorno prima dell&#39;esperimento, iniettare rane vaccinati con 800 UI di gonadotropina corionica umana (HCG) e posto a 16 ° C in 1 L per rana di 1 / 3x dita modificati di Marc (MMR). Vedi Tabella 1 per tutte le composizioni di buffer. Nota: alcuni rane non deporre le uova o le uova saranno di scarsa qualità. Tipicamente 2 - 3 rane vengono iniettati per garantire almeno una rana getterà sufficiennumeri t di uova di buona qualità. La rana media getterà abbastanza uova per la produzione di almeno 1 ml di estratto uovo. </li><li> Preparare 1 L 1 / 3x MMR con acqua deionizzata fredda distillata (DDH 2 O), 500 ml di tampone B, 1 L tampone C, 500 ml di buffer di D, e 100 ml di tampone E. </li><li> Trasferimento dalle uova ad un piatto di vetro di cristallizzazione (150 x 75 mm). Usando una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata, coltivare fuori gonfi attivato uova bianche o uova lisati. mantenere solo uova con distinte e uguali pali animali scuro e poli vegetali bianchi. </li><li> Preparare 13 x 51 mm provette per centrifuga con 1 ml di tampone E integrato con 355 mM citocalasina D aggiunto appena prima di utilizzare nella fase 1.7. </li><li> Dejelly e lavare le uova. <ol><li> Lavare le uova brevemente con freddo 1 / 3x MMR in un bicchiere di dimensioni adeguate, modificare il buffer 3 - 4 volte. </li><li> Rimuovere i cappotti di gelatina delle uova da incubazione con tampone B. Questo vi porterà ovunque 3-10 min. Come i cappotti gelatina nuvoloso vengono rilasciati dall&#39;uovos, modificare il buffer. Nota: Dejellying è completa quando le uova appaiono accuratamente imballati in un angolo del piatto quando inclinati e poli vegetali sono orientate verso il basso. Le uova sono molto più fragili dopo dejellying, in modo da non incubare le uova con tampone B per più di lavaggi necessari e successive devono essere eseguite con molta attenzione. </li><li> Lavare le uova brevemente con 3 - 4 cambi di tampone C. </li><li> Lavare le uova brevemente con 2 cambi di tampone D. </li><li> Lavare le uova brevemente con 2 cambi di tampone E. </li></ol></li><li> Riempire provette da centrifuga con le uova utilizzando una vasta pipetta di vetro diametro o contagocce di plastica. Aspirare il tampone in eccesso. Per imballare le uova e rimuovere quanto più buffer come possibile, centrifugare a rotore secchio oscillante a 212 xg per 60 sec e poi a 478 xg per 30 sec. Aspirare il tampone in eccesso. Nota: È importante rimuovere il più eccesso di tampone possibile in questa fase per garantire l&#39;estratto dell&#39;uovo è minimamente diluito. </li><li> In una oscillazione<html> rotore secchio, ultracentrifuga sotto vuoto per 15 min a 12.000 xg e 4 ° C per schiacciare le uova aperto e separato in diversi strati, con il citoplasma essendo lo strato ambrata nel mezzo. Rimuovere provette da centrifuga e posto immediatamente in ghiaccio. </li><li> Raccogliere l&#39;estratto. <ol><li> Utilizzando un ago calibro 18 e la siringa, forare il tubo da centrifuga appena sopra lo strato pigmentato scuro sul fondo del tubo e rimuovere il ambrato livello citoplasmatico centrale. Non raccoglie dello strato lipidico superiore. Raccogliere il citoplasma in un tubo di dimensioni adeguate. Nota: In generale, 1 rana produce almeno 1 ml di estratto. </li><li> citoplasma Supplement con 1 / 1.000 il volume di 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 il volume di LPC magazzino, e 1/50 del volume di 50x mix energetico. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Non eccessivamente pipettare l&#39;estratto. </li><li> Mantenere l&#39;estratto su ghiaccio e utilizzare entro 3 ore di preparazione per i migliori risultati. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 2. Preparazione di Demembranated X. laevis Sperma (adattato da 29) Nota: I volumi procedura qui presentati sono per un massimo di 8 testicoli. <ol><li> Rimuovere 0,05% benzocaina (10% benzocaina magazzino preparata in etanolo e diluita al 0,05% in acqua serbatoio rana) da 4 ° C e portarlo a temperatura ambiente. Anestetizzare e sacrificare maschio X. laevis rane in soluzione benzocaina a temperatura ambiente per 20 - 30 min. Assicurare morte per assenza di battito cardiaco esaminando e sentire il torace, dalla mancanza di risposta alla stimolazione meccanica, e / o per decapitazione. </li><li> Effettuare una incisione a forma di U lungo l&#39;addome. Rimuovere la massa tubulated di corpi grassi gialli. Nella parte superiore dei reni, individuare i testicoli, che sono masse rosa pallido circa 1 cm di lunghezza 29 di forma ovale. Accise L&#39;testicoli e li rotolare su carta assorbente per rimuovere il sangue e altri tessuti. </li><li> Lavare testicoli in Buffer T. Utilizzare un pestello stretto montato tritare testicoli con 1 ml di tamponeT in una provetta da 1,5 ml fino omogeneo (10 colpi o più). Centrifuga 5 - 10 sec in un mini centrifuga e raccogliere il surnatante, rimozione di grandi pezzi di tessuto. Ripetere la centrifugazione ancora una volta e raccogliere il surnatante. </li><li> Trasferire la soluzione sperma contenente un tubo di plastica da 15 ml. Aumentare il volume per un totale di 2 ml con tampone T. Centrifugare a 1.411 xg per 10 min a 16 ° C per far sedimentare lo sperma. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di buffer di T. Centrifugare a 1.411 xg per 10 min a 16 ° C. Ripetere questa operazione una o due volte come necessario per pulire il pellet di globuli rossi e somatiche. </li><li> Risospendere il pellet in 100 microlitri tampone T e 300 microlitri tampone S. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Nota: Buffer S contiene lisolecitina, che è responsabile per demembranation. </li><li> Aggiungere tre volumi di tampone R (preparato fresco prima dell&#39;uso). Capovolgere tubo esattamente una volta. Centrifugare a 1.411 xg per 15 min a 16 &amp;# 176; C. </li><li> Risospendere il pellet in 400 microlitri di buffer R e quindi aggiungere un ulteriore 2 ml di tampone R. Centrifugare a 1.411 xg per 15 minuti a 16 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer T. </li><li> Diluire 1 ml demembranated nuclei degli spermatozoi con 9 ml Tampone T. Applicare questa diluizione ad un emocitometro. Contare il numero di sottili nuclei degli spermatozoi a forma di S in un unico grande 4 x 4 griglia e moltiplicare quel numero per 100 per ottenere la concentrazione dello stock in nuclei degli spermatozoi per ml. </li><li> Diluire il brodo a 100.000 nuclei degli spermatozoi per ml con il tampone T, risultando in un magazzino 200x. Preparare 3 - 5 aliquote microlitri. Flash congelamento in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. Montaggio nucleare <ol><li> Supplemento 100 ml di estratto di uovo con 1,5 ml 35,5 mM cicloesimide (concentrazione finale ~ 0.5 mm), 6 ml 20x calcio di soluzione (concentrazione finale ~ 0,6 mm), e 0,7 ml 200x spermatozoi (concentrazione finale ~ 700sperma nuclei / ml). Scalare il volume di reazione verso l&#39;alto o verso il basso, se necessario. Invertire o picchiettare delicatamente per mescolare. Nota: estratto pedalato da metafase in interfase fornisce una piattaforma più solida e affidabile per il montaggio nucleare. </li><li> Incubare a bagnomaria a 16 - 20 ° C per 90 min. Mescolare picchiettando delicatamente ogni 15 min per assicurare nuclei rimangono sospese nell&#39;estratto. </li><li> Monitorare i progressi di assemblaggio nucleare a 45 min preparando una zucca come segue. <ol><li> Dispensare 2 ml di estratto su un vetrino e aggiungere 2 ml nucleo correzione. </li><li> Overlay con un coprioggetto 22 millimetri 2. Immagine su un microscopio a epifluorescenza con acqua, olio o aria 20 - obiettivi 100X e un filtro DAPI. Nota: I nuclei possono essere visualizzati da immagini in campo chiaro, ma sono molto più facili da visualizzare con la fluorescenza. </li><li> Utilizzare nuclei immediatamente o aliquote Flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Nota: L&#39;aggiunta di 4% glicerolo al pr nucleiIOR al gelo può aiutare a mantenere la loro integrità. nuclei congelati sono generalmente ancora vitale e capace di importazione nucleare, tuttavia il processo di congelamento può portare a nuclei fragili interrotte o più strutturalmente. Nuclei fino ad un anno dopo congelamento può essere utilizzato. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione di X. laevis Embryo Extract <ol><li> Indurre X. femminile laevis rane per deporre le uova, come descritto in 1.1 e 1.2. </li><li> Isolare testicoli da X. maschio laevis rane come descritto al punto 2.2. Immergere testicoli nei media L15 integrato con 50 UI / ml di penicillina e la streptomicina in un bicchiere di 35 x 10 mm Petri. Conservare a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li><li> Raccogliere e fertilizzare le uova. <ol><li> Raccogliere le uova appena deposte tenendo rane su un piatto di vetro riutilizzabile Petri e promuovere la deposizione delle uova, applicando una leggera pressione alla parte bassa della schiena vicino alla cloaca. Comprimendo la rana troppo duro può causare lesioni, portando ad un addome gonfio e requiring l&#39;eutanasia 29. </li><li> Prop il piatto con un angolo di circa 45 °, consentono di raccogliere le uova sul bordo del piatto, rimuovere tutti tampone in eccesso, e aggiungere abbastanza 1 / 3x MMR per coprire a malapena le uova. Fertilizzare uova entro 15 minuti dal prelievo. </li><li> Utilizzare un pestello strettamente montato a macerare ed omogeneizzare 1/4 di testicoli in una provetta da 1,5 ml con 500 ml di sale alto modificati di Barth Saline (sale alto MBS). Aggiungere testicoli macerati alle uova e consentire la fecondazione venga eseguita a temperatura ambiente per 15 - 20 min, poi inondare uova con 1 / 3x MMR. Nota: L&#39;efficacia dei testicoli diminuisce con il tempo di conservazione, quindi più testicoli tessuto può essere necessaria per la fecondazione di successo quando si utilizza testicoli che sono stati conservati per più di una settimana. </li><li> Conferma fecondazione controllando contrazione del polo animale pigmentata scura e dalla rotazione degli embrioni con i loro poli animali rivolto verso l&#39;alto, di solito circa 20 - 30 min dopo l&#39;aggiunta teste schiacciatoS. Aspettatevi la prima scissione delle cellule che si verifichi entro 90 min. </li><li> Utilizzando una vasta pipetta di vetro foro rimuovere diligentemente morti (bianco e gonfio o la distribuzione non uniforme del tuorlo e pigmento), lisato, o uova non fecondate (cioè non spaccati), in quanto saranno rapidamente indurre la morte in embrioni limitrofi. </li><li> Ovunque 1-2,5 ore post-fertilizzazione, dejelly embrioni in 2 - 3% cisteina sciolti in 1/3 x MMR e portati a pH 7.9 con 10 N KOH. Eseguire due modifiche del buffer che sono ogni 3 - 4 min. Lavare accuratamente gli embrioni con 6 - 10 brevi cambiamenti di 1 / 3x MMR per rimuovere tutte le tracce di cisteina. Nota: gli embrioni Dejellied hanno una membrana vitellina e non sono così fragili come uova dejellied. </li></ol></li><li> Utilizzando una vasta pipetta di vetro foro, trasferire fecondati (cioè spaccati,) gli embrioni sani per una capsula di Petri contenente fresco 1 / 3x MMR e consentire loro di sviluppare allo stadio desiderato a temperatura ambiente o, se lo sviluppo più lento è preferito, 16 ° C. Continuare a rimuovere morti o menteembrioni sed indicato dalla mancanza di prima divisione o l&#39;aspetto gonfio bianco. </li><li> Verificare la fase degli embrioni controllando per quasi completa chiusura della blastoporo e confrontando ai disegni di embrioni in scena disponibili in materiali di riferimento 24. Nota: embrioni coltivati ​​a 16 ° C raggiungerà fase 11,5-12 in circa 12 ore. </li><li> Incubare fase 11.5 - 12 embrioni in fresco 1 / 3x MMR integrato con 0,5 mm cycloheximide per 1 ora a temperatura ambiente, per arrestare gli embrioni a fine interfase. </li><li> Trasferimento con ampio vetro diametro o pipetta di plastica da un minimo di 15 (preferibilmente di 30 o più) embrioni interfase-arrestato in una provetta. Nota: 15 embrioni sono sufficienti per produrre circa 20 ml di estratto. Scalare in base alle esigenze. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di lisi uovo (ELB) integrato con 1 ml di LPC magazzino. Capovolgere lavare embrioni, permettere che gli embrioni cadono sul fondo della provetta, e rimuovere il tampone. Ripetere questa fase di lavaggio altre due volte. &lt;/ Li&gt; <li> embrioni risospendere in 500 ml di ELB più 0,5 l di LPC magazzino, 5 ml di 19,7 mM cicloesimide, e 5 ml di 35,5 mM citocalasina D (per inibire polimerizzazione). Centrifugare a 200 xg per 1 minuto in una microcentrifuga da tavolo. </li><li> Rimuovere il tampone in eccesso e utilizzare un pestello per schiacciare a fondo gli embrioni. Centrifugare in un rotore secchio oscillante per 10 min a 10.000 xg e 16 ° C. </li><li> Perforare lo strato lipidico dall&#39;alto con una punta di pipetta 200 microlitri. Con un pulito 200 microlitri punta della pipetta, rimuovere lo strato ambrato citoplasmatica mezzo di un tubo di dimensioni adeguate. </li><li> Supplemento estratto embrionale con 1/50 del volume di 50x mix energetico (per fornire un sistema di rigenerazione ATP), 1/100 del volume di 35,5 mM Cicloesimide, 1/500 del volume di 19,7 mM citocalasina D, e 1 / 1.000 il volume di LPC magazzino. </li><li> Preparare una zucca come descritto al punto 3.3 di visualizzare nuclei embrionali endogeni nell&#39;estratto. Nota: estratto di embrioni possono essere congelati con<html> i nuclei endogeni a questo punto. Aliquotare per ridurre gelo / disgelo e conservare a -80 ° C. </li><li> Per rimuovere i nuclei dalla estratto embrionale, diluire l&#39;estratto con un volume uguale di ELB contenente 1/50 del volume di 50x mix energetico, 1/100 del volume di 35,5 mM Cicloesimide, 1/500 del volume di 19,7 mM citocalasina D, e 1/1000 il volume di LPC magazzino. Centrifugare in un rotore secchio oscillante a 17.000 xg per 15 min a 16 ° C. </li><li> Raccogliere il surnatante facendo attenzione ad evitare qualsiasi lipidi rimanendo in alto. Non disturbare i nuclei pellet sul fondo della provetta. Preparare una zucca come descritto in 3.3 per garantire che la maggior parte dei nuclei sono stati rimossi. Utilizzare l&#39;estratto fresco o aliquotare e conservare a -80 ° C. </li><li> Per riscaldare inattivare estratto embrionale per esperimenti di controllo, di calore 30 - 100 microlitri aliquote di estratto a 56 ° C per 30 minuti utilizzando un termociclatore. Lasciare che il calore estratto inattivato per tornare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. Nucleare Shrinking Assay e immunofluorescenza <ol><li> Isolare nuclei assemblati in estratto uovo diluendo 25 - 150 ml di nuclei premontati in 1 ml ELB in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 1600 xg per 3 min a 4 ° C in una microcentrifuga da tavolo. Rimuovere tampone, facendo attenzione a non disturbare il pellet fragile nuclei sul fondo della provetta. </li><li> Risospendere nuclei in un volume di estratto embrionale pari al volume originale dell&#39;estratto dell&#39;uovo usato in 5.1. Utilizzare ELB o di calore estratto inattivato per le reazioni di controllo, a seconda dei casi. </li><li> Battere delicatamente il tubo per rompere il pellet e risospendere i nuclei. Incubare a temperatura ambiente per 90 min, picchiettando delicatamente la provetta per miscelare frequenza di 15 - 30 min. Nota: La maggior parte del restringimento nucleare si verifica entro i primi 30 min. </li><li> Monitorare i progressi di restringimento nucleare preparando una zucca. <ol><li> Dispensare 2 ml di estratto su un vetrino e aggiungere 2 ml nucleo correzione. </li><li> Sovrapposizione con un 22 millimetri 2 </sup&gt; vetrino. Immagine su un microscopio a epifluorescenza. </li></ol></li><li> Toccare il tubo per sospendere di nuovo i nuclei appena prima di aggiungere 500 ml di fissativo costituito da ELB, 15% glicerolo, e del 2,6% paraformaldeide. Invertire immediatamente, e posizionare il tubo su un rotatore per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Preparare spin down tubi per l&#39;allestimento di 15 ml provette di vetro con fondo arrotondato con inserti in plastica fondo tondo (progettazione e schemi disponibili su richiesta). Aggiungere 5 ml di tampone cuscino nucleare. Eliminare un vetrino circolare 12 millimetri nel tubo, essendo sicuro che adagiata sulla parte superiore del inserto in plastica. </li><li> strato delicatamente la soluzione contenente nuclei fissi sulla parte superiore del cuscino nucleare con una punta di pipetta ampio tunnel. Centrifugare in un rotore secchio oscillante per 15 min a 1000 xg e 16 ° C. </li><li> Utilizzare un aspiratore per rimuovere tutto il tampone ed estrarre l&#39;inserto in plastica alla sommità del tubo. Rimuovere il vetrino con un paio di pinze sottili, facendo attenzione a notare il lato del coperchioscivolare su cui i nuclei sono stati filate. Post-fix in metanolo freddo (conservato a -20 ° C) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire il lato coprioggetto nucleo su sopra un foglio di pellicola di plastica di paraffina fodera un grande piatto di plastica Petri. Posizionare salviettine monouso umide lungo il lato del piatto per prevenire la disidratazione. </li><li> Reidratare nuclei sul vetrino con 500 ml di PBS-NP40 (1x PBS più 0,1% NP40) e aspirare dopo 5 - 10 sec. </li><li> strato con cautela 75 ml di PBS-3% di sieroalbumina bovina (BSA) sul vetrino. Consentire al blocco 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere soluzione bloccante, e incubare con l&#39;anticorpo primario (ad esempio, mAb414 contro il complesso poro nucleare, 1: 1000) diluiti in PBS-BSA 3% per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Lavare con cinque cambiamenti immediati di PBS-NP40. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in PBS-BSA 3% per 1 ora a RT. Lavare con cinque cambiamenti immediati di PBS-NP40. </li><li> covarecon 10 ug / ml Hoechst diluito in PBS-BSA 3% per 5 minuti a RT. Lavare cinque volte con PBS-NP40. Rimuovere tutti i buffer di eccesso. </li><li> Montare il vetrino su un vetrino con 5 ml antifade mezzo di montaggio. Sigillare con smalto trasparente. Immagine immediatamente utilizzando un microscopio a epifluorescenza con 20 - 100x obiettivi o conservare a 4 ° C per l&#39;imaging in seguito. Nota: Eseguire la quantificazione come descritto in precedenza 23. </li></ol>

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E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISWI+remodeling+complexes+in+Xenopus+egg+extracts:+identification+as+major+chromosomal+components+that+are+regulated+by+INCENP-aurora+B.">ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).</li><li>Goehring, N. W., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+growth+control+through+limiting+pools+of+cytoplasmic+components.">Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components.</a> Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).</li><li>Du Toit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development:+Honey,+I+shrunk+the+nucleus.">Development: Honey, I shrunk the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).</li><li>Buchner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+kinase+C+in+the+regulation+of+cell+growth+and+in+signalling+to+the+cell+nucleus.">The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).</li><li>Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C,+an+elusive+therapeutic+target.">Protein kinase C, an elusive therapeutic target.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink...

Le dimensioni di organelli cellulari tipicamente scala con la dimensione della cella, e questo è stato forse meglio documentati per la disincrostazione di dimensioni nucleare con dimensione delle celle 1-10. Questo è particolarmente vero durante l&#39;embriogenesi e la differenziazione cellulare, quando drammatiche riduzioni sia cellulare e dimensione nucleare sono spesso osservate 11,12. Inoltre, la dimensione nucleare alterato è un parametro fondamentale nella diagnosi del cancro e la prognosi 13-17. I meccanismi che contribuiscono alla regolazione di formato nucleare sono in gran parte sconosciuti, in parte a causa della complessità e la natura essenziale della struttura nucleare e funzione. Il metodo descritto qui è stato sviluppato come un test in vitro per il ridimensionamento della dimensione nucleare, che è suscettibile di manipolazione biochimica e delucidazione dei meccanismi di regolazione dimensione nucleare. Xenopus laevis estratto uovo è un sistema consolidato di ricapitolare e lo studio dei processi cellulari complessi in un in vitro </em&gt; Contesto. Questi estratti hanno rivelato nuove informazioni fondamentali sui diversi processi cellulari, tra cui l&#39;assemblaggio e la funzione del fuso mitotico, reticolo endoplasmatico, e il nucleo 18-22. Uno dei principali vantaggi del sistema estratto è che X. laevis estratti uova rappresentano un citoplasma quasi non diluito cui composizione può essere facilmente modificato, ad esempio con l&#39;aggiunta di proteine ​​ricombinanti o immunodeplezione. Inoltre, si è in grado di manipolare processi essenziali utilizzando trattamenti che altrimenti potrebbero essere letali in un contesto in vivo. Le modifiche della procedura di estratto di uovo permettono l&#39;isolamento di estratti di X. laevis embrioni piuttosto che uova, e questi estratti embrionali sono ugualmente suscettibili di manipolazione biochimica 23. Durante X. laevis sviluppo, l&#39;embrione fecondato singola cellula (~ 1 mm di diametro) subisce una serie di dodici divisioni cellulari rapidi (punti 1 - 8) per generare diverse migliaia 50 μm di diametro e le cellule più piccole, raggiungendo una fase di sviluppo definito il passaggio midblastula (MBT) o la fase 24-26 agosto. La MBT è caratterizzata dalla comparsa di trascrizione zigotico, la migrazione delle cellule, divisioni cellulari asincrone, l&#39;acquisizione delle fasi gap, e la creazione di formati di stato stazionario nucleari piuttosto che l&#39;espansione nucleare continua come nell&#39;embrione pre-MBT. Dalla fase 4 per gastrulation (stadi 10.5 - 12), il volume dei singoli nuclei diminuisce di più di 10 volte 11. Qui, l&#39;obiettivo è quello di individuare i meccanismi responsabili di queste riduzioni delle dimensioni nucleare durante la progressione evolutiva. L&#39;approccio è quello di assemblare prima nuclei a X. laevis estratto uovo e isolare i nuclei dall&#39;uovo citoplasma / estratto. Questi nuclei sono poi risospese nel citoplasma da embrioni fase avanzata gastrula. Dopo un periodo di incubazione, i nuclei di estratto di uova diventano più piccoli in estratto fase avanzata embrionale. Abbiamo ragionato che questo woulD un test utile per identificare i componenti citoplasmatici presenti negli embrioni fase avanzata che contribuiscono al ridimensionamento dimensione nucleare di sviluppo. Usando questo test, insieme con la convalida in vivo, abbiamo dimostrato che la proteina chinasi C (PKC) contribuisce alla riduzione di sviluppo in termini di dimensioni nucleari a X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>creatine phosphate disodium</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasin D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>disposable wipes (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glass crystallizing dish (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Human Chorionic Gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolecithin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin + Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom glass tubes, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fade mounting medium)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation

Una questione fondamentale nella biologia delle cellule è come dimensioni delle celle e organelli sono regolati. È stato riconosciuto che la dimensione del nucleo generalmente diminuisce con la dimensione della cella, in particolare durante l&#39;embriogenesi quando si verificano drammatiche riduzioni sia cella e dimensioni nucleari. Meccanismi di regolazione dimensione nucleare sono in gran parte sconosciuti e possono essere rilevanti per il cancro in cui le dimensioni nucleare alterato è un parametro diagnostico e prognostico chiave. In vivo approcci per identificare i regolatori di dimensioni nucleari sono complicate dalla natura essenziale e complessa della funzione nucleare. L&#39;approccio in vitro descritto qui per studiare il controllo dimensione nucleare sfrutta le normali riduzioni di dimensioni nucleare che si verificano durante lo sviluppo laevis Xenopus. Innanzitutto, nuclei sono assemblati in X. laevis estratto uovo. Poi, questi nuclei sono isolati e risospese nel citoplasma da embrioni in fase avanzata. Dopo un 30 - periodo di incubazione di 90 minuti, la superficie nuclearediminuisce di 20 - 60%, fornendo un test utile per identificare i componenti citoplasmatici presenti negli embrioni fase avanzata che contribuiscono al ridimensionamento dimensione nucleare di sviluppo. Un importante vantaggio di questo approccio è la relativa facilità con cui gli estratti uova e embrioni possono essere manipolati biochimicamente, consentendo l&#39;identificazione di nuove proteine ​​e attività che regolano dimensione nucleare. Come con qualsiasi approccio in vitro, convalida dei risultati in un sistema in vivo è importante, e microiniezione di X. embrioni laevis è particolarmente adatto per questi studi.

Assemblea dei nuclei a Egg estratto I primi passi di questo protocollo sono da preparare X. laevis estratto di uovo (protocollo 1) e nuclei degli spermatozoi demembranated (protocollo 2). Questi reagenti vengono poi utilizzati per assemblare nuclei de novo (protocollo 3). La Figura 1 mostra alcuni dati rappresentativi. Aggiunta di calcio spinge dell&#39;estratto dell&#39;uovo...

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A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Un test cellulare gratuitamente utilizzando<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; Embryo Estrae per studiare i meccanismi del regolamento Size nucleare

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

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Biology

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

8.3K Views.  University of Wyoming. Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Biochimica

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Un test cellulare gratuitamente utilizzando

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Manipolazione e

Utilizzando Analisi confocale di

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Produzione di

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi