1. Generazione di X. tropicalis Uova Tutti Xenopus tropicalis rane sono ordinate da NASCO. Le nostre rane sono alloggiati in un habitat acquatici sistema di ricircolo dell&#39;acqua mantenuta a 27 ° C. Ci sono molte opzioni per i sistemi di acqua per la cura di X. tropicalis. Qualche buona informazione generale su questa specie di rana si possono trovare sui siti web dei laboratori di Harland e Grainger ( <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/" target="_blank">http://tropicalis.berkeley.edu/home/</a> , <a href="http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis/" target="_blank">http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /</a> ). Le nostre rane sono mantenuti in tankwater costituito da (0.4 g Ciclid Lago di sali, 0,6 g di sale marino, 0.625 g di NaHCO3 per litro d&#39;acqua, pH 7.0) 20. Ciò si traduce in una ricetta conduttività di ~ 1800 mS, che è una salinità elevata per X. tropicalis. Tuttavia, abbiamo scoperto che le nostre rane prosperano in this ambiente e la qualità degli ovociti è migliorata. Ricette tankwater alternativi si trovano sopra le risorse elencate per il generale X. cura tropicalis. <ol><li> Rane vengono iniettati con gonadotropina corionica umana (hCG) per tre giorni consecutivi per stimolare la deposizione delle uova: in primo luogo, preparare due concentrazioni di soluzione di hCG. Risospendere 10.000 U di polvere liofilizzata hCG in 10 ml sterile, deionizzata H 2 O per una concentrazione finale di 1.000 U / ml. Poi, diluire 1 ml di soluzione di hCG 1.000 U / ml in 9 ml di H 2 O per una concentrazione finale di 100 U / ml. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C. </li><li> Il giorno 1, preparare 4-6 rane per la deposizione delle uova, iniettando con hCG tra le 2:00-03:00. Iniettare ciascuna rana nella dorsale linfa cieco, vicino alla cloaca con 0,2 ml di soluzione di hCG 100 U / ml. Avere le rane velocemente durante le successive due iniezioni sarà ridurre al minimo la quantità di rifiuti presenti rana durante la deposizione delle uova, ma è facoltativo. </li><li> Il giorno 2, iniettare le stesse ranecon 0,2 ml U / ml soluzione 100 hCG tra 2:00-03:00. </li><li> Il giorno 3, iniettare le stesse rane con 0,2 ml di soluzione di hCG 1.000 U / ml, tra le 7:00-10:00. Impostare le rane a deporre le uova: riempire un secchio di plastica 6 quarti con tankwater fresco, aggiungere le rane e posto al buio a 25 ° C. Dopo questa iniezione, deposizione delle uova inizierà dopo 4 ore e sarà completata entro 7 ore. Le rane devono deporre le uova in un ambiente che è mantenuto a un minimo di 25 ° C. </li><li> Fai estrarre soluzioni e disporre di attrezzature pronte immediatamente prima di raccogliere le uova. </li></ol> 20X MMR: HEPES 100 mM, pH 7.8, 2 mM EDTA pH 7.8; 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl 2. Autoclave e conservare a temperatura ambiente. Preparare 1 L di 1X MMR appena prima di estrarre preparazione. XB 10X: 100 HEPES, pH7.7; 10 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2, 1 M KCl; 500 mM saccarosio. Autoclave e conservare a 4 ° C. Preparare 1 l di 1x XB just prima di estrarre preparazione. Soluzione Dejelly: preparare 250 ml di soluzione di cisteina 3% in H 2 O deionizzata e pH a 7,8-8,0 con NaOH 10 N. Preparare appena prima estrarre preparazione. CSF-XB: prendere 200 ml di 1X XB e aggiungere 2 ml di 0,5 M dell&#39;EGTA pH 7.7 e 200 ml 1 M MgCl2. Preparare appena prima estrarre preparazione. CSF-XB +: prendere 50 ml di CSF-XB e aggiungere 50 ml di LPC (10 mg / ml di ogni stock di leupeptina, Pepstatin e Chymostatin in DMSO). Aggiungere 50 microlitri Citocalasina D (10 mg / ml in DMSO). Preparare appena prima estrarre preparazione. Preparare una soluzione di gelatina 0,2% in acqua deionizzata H 2 O, forno a microonde per sciogliere e filtrare sterilizzare. Conservare a temperatura ambiente. Prenotazione 2 Beckman 2 x ½ tubi ultracentrifuga pollici. Preparare due provette da 15 ml a fondo rotondo in vetro con 0,5 ml di H 2 O in ciascuna per attutire l&#39;ultracentrifuga tubo. Fai Sfaccettate in vetro pipette Pasteur. Far scattare la fine off del 5 ¾ pipette di vetro di pollice per esporre un&#39;ampia apertura, ed esporre alla fiamma per lisciare il nuovo puntale a vista. <ol start="6"><li> Preparare un bicchiere di vetro da 500 ml per memorizzare le uova agitando una soluzione di gelatina 0,2% circa per rivestire le pareti del becher. Eliminare la soluzione di gelatina da bicchiere dopo l&#39;uso. </li><li> Raccogliere le uova dal secchio di plastica utilizzato per la posa di 6-7 ore dopo la terza iniezione al giorno 3. Se lo si desidera, premere delicatamente ogni rana una volta per ottenere tutte le uova restanti. Lavare le uova una volta con tankwater fresco e trasferimento in bicchiere da 500 ml in vetro rivestito con soluzione di gelatina 0,2%. </li></ol> 2. Preparazione di estratto da X. tropicalis Uova Tutte le fasi di preparazione dell&#39;estratto possono essere effettuate a temperatura ambiente di circa 25 ° C. Durante i lavaggi, è importante mantenere l&#39;uovos sommersa sotto liquido in modo che rimangano bagnati. Esposizione all&#39;aria può provocare le uova per sfuggire arresto del ciclo cellulare o lisi. <ol><li> Decantare il più tankwater possibile riservandosi abbastanza liquido per mantenere le uova bagnato. Inclinare il bicchiere contenente uova di lato e aggiungere ~ 300 ml 1X MMR lentamente alla parete del bicchiere, in modo che l&#39;agitazione fisica delle uova è minimizzato. Lasciate che depositano le uova, poi decantare il surnatante contenente detriti. X. uova tropicalis sono filata in questa fase, in modo in cui le uova attivati ​​avviene dopo dejellying. Ripetere per un totale di tre lavaggi 1X MMR. </li><li> Dejelly le uova. Decantare il più MMR possibile e aggiungere metà della soluzione dejelly. Swirl continuamente per circa 5 min. Sciogliendo cappotti gelatina sarà visibile nel surnatante dopo un paio di minuti. Decantare ed aggiungere la soluzione dejelly rimanente. Continuare a girare continuamente fino a quando le uova imballare molto strettamente e tutto orientare con il loro polo vegetale (il polocon pigmento bianco) verso il fondo del piatto. Decantare rapidamente fuori come soluzione molto dejelly possibile. Una volta che le uova sono dejellied sono molto sensibili alle manipolazioni meccaniche. </li><li> Aggiungere con cautela XB alle uova. Nel primo lavaggio XB, togliere le uova che sono sfuggiti CSF arresto rimuovendo lisati, gonfi, uova bianche, e pseudocleavage. Activated X. uova tropicalis tendono a stabilirsi in alto al centro, in modo da utilizzare una pipetta di plastica trasferimento a tirare questi fuori. Rimuovere anche pezzi di pelle e rifiuti rana. Lavare le uova per un totale di tre volte con ~ 300 ml di soluzione 1X XB, rimestando delicatamente le uova tra un lavaggio e permettendo loro di stabilirsi sul fondo del bicchiere. Come prima, decantare quanto più di ogni soluzione di lavaggio possibile, mantenendo le uova bagnato. </li><li> Lavare le uova due volte con CSF-XB e decantare. </li><li> Aggiungi CSF-XB + alle uova. Utilizzando un incendio lucidato gelatina-trattato pipetta Pasteur, uova a tubi ultra-centrifuga di trasferimento con CSF-XB +, facendo attenzione a non esporre l&#39;eGGS nell&#39;aria. Posto all&#39;interno delle provette da centrifuga 15 ml di vetro con il cuscino d&#39;acqua. </li><li> Spin uova in una centrifuga clinica a 200 xg per 1 minuto, aumentare la velocità a 800 xg e girare per 30 sec. </li><li> Utilizzare un aspiratore per rimuovere il più possibile dal tampone uova. Dovrebbero essere quasi asciutti in cima. Spostare rapidamente le uova in una Sorvall RC-6 centrifuga dotata di un rotore HB-6 (o equivalente) e spin 17.000 xg per 15 min a 20 ° C. </li><li> Rimuovere lo strato citoplasmatico giallo tra pigmento e strati lipidici usando un ago di calibro 18 attaccato ad una siringa da 1 ml. Forare il lato del tubo e tirare il corpo della siringa lentamente per ottenere lo strato estratto citoplasmatico. Evitare di granuli di pigmento, per quanto possibile. </li><li> Trasferimento citoplasma al nuovo tubo ultracentrifugazione. È normale che l&#39;estratto di apparire leggermente nuvoloso in questa fase. Posto all&#39;interno del tubo di vetro da 15 ml per centrifuga con cuscino d&#39;acqua. Gira ancora 17.000 xg per 10 min a 20 ° C. Ripetere extraction con 18 gauge. </li><li> Trasferire citoplasma di una provetta da microcentrifuga 1,5. Stimare il volume estratto e diluire Citocalasina D e LPC 1:1.000 in estratto. Mescolare bene con una punta di pipetta 1 ml, pipettare su e giù molte volte senza introduzione di bolle d&#39;aria. Una resa tipica di una colonia rana sano è di circa 300-500 ml di estratto / rana. Per conservare attività massima, è necessario immagazzinare l&#39;estratto ed eseguire manipolazioni sperimentali a temperatura ambiente (20-25 ° C). </li></ol> 3. Purificazione Taxol stabilizzato microtubuli da X. tropicalis estratto <ol><li> Aggiungere a una Taxol 100-200 microlitri aliquota dell&#39;estratto ad una concentrazione finale di 10 pM e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Per reazioni di controllo, trattare un volume equivalente di estratto con la microtubuli destablilzing Nocodazole farmaco (10 mM). Riserva 100 pl di estratto non trattato per l&#39;analisi. </li><li> Diluire il farmaco-trattatoestrarre con 10 volumi BRB-80 (80 mm TUBI pH 6.8, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) + 30% di glicerolo. Assemblare 14 tubi in polipropilene a fondo rotondo ml contenenti 10 ml di BRB-80 + 60% cuscino glicerolo. Utilizzando un&#39;ampia foro punta di pipetta, la reazione strato estratto farmaco-trattato delicatamente sulla sommità della BRB-80 + 60% glicerolo cuscino. Centrifugare per 10 minuti a 17.000 xg a 20 ° C in una centrifuga Sorvall RC-6 centrifuga dotata di un rotore HB-6 (o equivalente) e adattatori per provette. </li><li> Aspirare il surnatante contenente unsedimented materiale estratto, e lavare l&#39;interfaccia due volte con acqua deionizzata H 2 O. Aspirare il volume del cuscino restante lentamente, facendo attenzione a non disturbare il pellet simile a gel contenente microtubuli, proteine ​​associate ai microtubuli, e RNA associata ai microtubuli nel campione Taxol-trattato. Il campione Nocodazole-trattato non contiene materiale visibile. Risospendere il pellet in 1 ml TRIzol e procedere con le istruzioni del produttore per isolare l&#39;RNA. UntrEstratto eated (fino a 100 microlitri) può essere direttamente risospeso in 1 ml TRIzol. </li><li> Ora ci sono i kit disponibili in commercio per la preparazione di librerie di trascrittoma adatti per l&#39;RNA-Seq. Questi possono essere acquistati attraverso <a href="http://www.illumina.com/" target="_blank">http://www.illumina.com/</a> e <a href="http://www.454.com/" target="_blank">http://www.454.com/</a> . </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo rapporto abbiamo descritto un metodo semplice per la produzione di estratti di uova CSF-arrestati da X. tropicalis 19 e utilizzare questo estratto per studiare RNA associata ai microtubuli 7. La procedura di base per la produzione di estratti di uova CSF-arrestati da X. tropicalis è lo stesso utilizzato per X. laevis con alcune differenze chiave. Uno degli aspetti più difficili da lavorare con X. tropicalis rane è ottenere abbastanza uova di alta qualità per fare un estratto con la nucleazione dei microtubuli o attività di assemblaggio del mandrino paragonabile a X. laevis uovo estrae. Per ottenere i migliori condizioni di posa delle uova, evitando lo scivolamento dalla meiosi II arresto del ciclo cellulare, l&#39;intervallo tra le iniezioni di ormoni per X. tropicalis è più breve di quello utilizzato per X. laevis, e la temporizzazione della terza iniezione hCG per l&#39;inizio di deposizione è anche molto più breve. Con X. laevis la temporizzazione da quella di hCG per tha inizio ovodeposizione è tale che è conveniente ed efficiente per le uova stabilite durante la notte in tampone. Tuttavia, a causa del tempo breve tra di hCG e deposizione delle uova con X. tropicalis è spesso necessario per esprimere manualmente le uova da rane. Un&#39;altra differenza significativa tra fare estratto uovo da due diverse rane è il passo dejellying. Con X. laevis le uova sono così grandi che è facile stabilire quando il cappotto gelatina è sciolto osservando come da vicino le uova sono distanziati nel bicchiere. Poiché la reazione dejellying inizio, le uova iniziano a confezionare più densamente. Tuttavia, X. uova tropicalis sono molto più piccoli e può essere molto difficile determinare quando il cappotto gelatina si è sciolta da uovo imballaggio densità solo. Abbiamo trovato che il metodo più affidabile per determinare quando il cappotto gelatina è dissolta è monitorare l&#39;orientamento dell&#39;animale (nero) e vegetali (bianco) poli. Quando tutto il vegetale poli orient verso il fondo del beaker del mantello gelatina è stato rimosso abbastanza per procedere con l&#39;estratto. Infine, mentre X. estratto uovo laevis può essere conservato a temperature fresche (4-12 ° C), abbiamo osservato che è fondamentale mantenere X. estratto uovo tropicalis a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante la preparazione e manipolazioni sperimentali preservare attività biochimica. A causa delle differenze nella facilità di uso preferiamo usare X. laevis rane per la produzione di estratto uovo. Tuttavia, per gli esperimenti che richiedono o sono facilitate da un organismo con un genoma sequenziato, X. tropicalis è un ottimo sistema alternativo. Il metodo che abbiamo descritto in questo rapporto utilizza taxolo come agente microtubuli stabilizzante per indurre la polimerizzazione dei microtubuli. Abbiamo scelto questo metodo perché taxolo è un agente stabilizzante i microtubuli robusto che facilita l&#39;isolamento su larga scala di microtubuli purificati. Il metodo Tha abbiamo descritto potrebbe probabilmente essere migliorato mettendo a confronto le proteine ​​e RNA associati a microtubuli che utilizzano metodi di polimerizzazione dei microtubuli alternativi. Alternative potrebbero includere polimerizzazione con GTP-indotta polimerizzazione (tecnica classica), 22 o utilizzando Ran-GTP come una polimerizzazione dei microtubuli di imitare i microtubuli indotte dal gruppo del mandrino cromatina guidato 23. Infine, l&#39;uso di sperma nuclei purificato per indurre polimerizzazione dei microtubuli sarebbe il più vicino mimica ai tipi di microtubuli che vengono nucleati durante la mitosi (cntrosoma, cromatina, e cinetocoro mediata). Inconvenienti di queste fonti alternative di nucleazione dei microtubuli sono che gli agenti di nucleazione non sono così facilmente disponibili come taxolo e non lo fanno nucleazione o stabilizzano i microtubuli nel modo più efficiente taxolo. Pertanto, ciascuno di questi metodi sarebbe più difficile da usare per purificazioni larga scala. Il vantaggio di confrontando più diversi tipi di nucleizzatori microtubuliè che potrebbe essere possibile identificare le proteine ​​e / o RNA che sono specifici per ciascun percorso di microtubuli nucleazione. Il metodo che abbiamo descritto qui sfrutta estratti citoplasmatici di anfibi. Tuttavia, questo approccio potrebbe essere esteso per l&#39;utilizzo del sistema estratto da altri microrganismi. Estratti mitotiche sono state descritte da sincronizzati colture cellulari umane 24 che fedelmente ricapitolare molti aspetti della formazione dei microtubuli. Abbiamo utilizzato con successo per identificare questi estratti RNA associata ai microtubuli da cellule HeLa 5. Schemi di purificazione microtubuli simili sono stati descritti per molti organismi differenti 25,26, anche se non sono stati esaminati i microtubuli RNA associati. L&#39;approccio qui descritto potrebbe essere utilizzato con qualsiasi organismo che può produrre un estratto citoplasmatico concentrato capace di nucleazione microtubuli. Infine, anche se l&#39;approccio che describa qui discute la purificazione dei microtubuli e proteine ​​e RNA associati, questo approccio potrebbe essere generalizzato ad altre strutture subcellulari. Mentre la maggior parte localizzate mRNA non sono stati identificati con metodi biochimici i recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento del DNA e RNA rendono questo approccio un metodo interessante per identificare RNA localizzate. In questo approccio ogni struttura subcellulare o sub-embrione di interesse potrebbe essere isolata o purificata. Poi le proteine ​​e RNA associati possono essere identificati su vasta scala genoma. RNA possono quindi essere confrontati con il contenuto della cella RNA totale o embrione di identificare RNAs localizzate arricchiti. Questo approccio potrebbe essere utilizzato con le uova intere (di origine animale e vegetale separazione, simile al metodo che ha individuato i primi RNA localizzate in Xenopus 27), actina associati RNA, RNA ER-associate, RNA mitocondri associati, o di qualsiasi struttura subcellulare che possono essere purificato con RNA associati intatti. Sulla baseil nostro lavoro sul associata ai microtubuli RNA Prevediamo che questo sarebbe un ottimo metodo per scoprire nuove proteine ​​che funzionano in un determinato luogo. Inoltre, l&#39;identificazione della posizione e l&#39;estensione di tutti gli RNA localizzate fornirà indizi su come le cellule e gli embrioni di utilizzare la localizzazione mRNA per controllare l&#39;espressione genica.

Controllo spaziale e temporale dell&#39;espressione genica è importante per tutte le cellule, ed è particolarmente importante per il controllo dei primi embrionali picchiettare 1. Controllo spaziale di espressione genica è ottenuta attraverso la localizzazione attiva di mRNA per le destinazioni specifiche all&#39;interno di cellule o embrioni. In molti tipi di cellule molto grandi, (ad es ovociti, embrioni e neuroni) localizzazione mRNA viene utilizzato per limitare l&#39;espressione della proteina al sito di azione della proteina codificata. Dal momento che un mRNA localizzata può catalizzare molti cicli di produzione di proteine ​​è più efficiente di localizzare un mRNA che di localizzare molecole proteiche individuali. MRNA localizzati sono in genere translationally repressi fino a raggiungere la loro destinazione, che serve a limitare ulteriormente la localizzazione della proteina codificata 2. Oltre ai numerosi casi ben documentati di localizzazione di RNA per controllare patterning embrionale, diversi studi hanno documentato mRNA che sono localizzatial sito di azione della proteina codificata. Esempi importanti includono localizzazione della β-actina e Arp2 3/3 4 mRNA per il bordo di fibroblasti motili e localizzazione degli mRNA per molti regolatori mitotici a meiotica e mitotica mandrini 5-7. Molti degli esempi classici di mRNA localizzati sono stati identificati attraverso schermi genetici per le mutazioni effetto materno e successivamente sono stati determinati a codificare RNA localizzate. Tuttavia, recenti studi di genome-wide hanno cominciato a fornire una conoscenza più ampia nel campo di applicazione RNA localizzate. Un recente nella schermata di ibridazione in situ in embrioni di Drosophila ha dimostrato che circa il 70% di tutti gli mRNA hanno una localizzazione specifica, tra cui molte nuove destinazioni 8. Purificazione di pseudopodi da fibroblasti di topo ha identificato un gruppo eterogeneo di mRNA localizzato 9. Lavoro da nostro gruppo utilizzando purificazione biochimica dei microtubuli da meiotica Xenopus uovo estrae identificate centinaia di mRNA che copurify con il mandrino 5,7. Il nostro lavoro ha dimostrato che la maggioranza dei microtubuli localizzate mRNA codificano proteine ​​che funzionano nel controllo della mitosi, supportando l&#39;idea che mRNA sono localizzati al sito di azione della proteina codificata. Inoltre, la capacità di rilevare mRNA arricchimento in una frazione subcellulare da purificazione biochimica evidenzia la potenza di questo approccio per la identificazione di mRNA localizzate. RNA più localizzate utilizzano trasporto attivo sul citoscheletro, sia actina o microtubuli, per raggiungere il trasporto verso la destinazione finale 10. Per ottenere una migliore comprensione della portata e tipi di RNA che sono localizzati a destinazioni specifiche utilizzando un approccio biochimico è necessario disporre di un sistema in vitro che possono ricapitolare processi citoscheletriche. Uno dei sistemi di primo ministro per lo studio della biologia del citoscheletro è estratti di uova prodotteda uova non fecondate dalla rana Xenopus laevis. X. estratti di uova laevis sono stati utilizzati per decenni per studiare una vasta gamma di processi citoscheletro e hanno contribuito molto alla nostra comprensione dei meccanismi e le molecole che controllano assemblaggio del citoscheletro e la dinamica 11. Inoltre, X. estratti uovo laevis sono suscettibili di purificazioni larga scala di microtubuli e proteine ​​associate 12,13 e ci sono metodi ben progettato per la produzione di vari tipi di estratti uovo 14-16. Tuttavia, per gli studi genomici ci sono molti inconvenienti all&#39;utilizzo di X. laevis come sistema modello. Per decenni rane Xenopus laevis sono stati un potente sistema per lo studio della biologia dello sviluppo e delle cellule, a causa delle grandi dimensioni dell&#39;oocita e robusto sviluppo esterno 17. Inoltre, lo sviluppo di sistemi di estratto di uova che possono ricapitolare molti processe cellulares in una provetta ha reso questa rana un modello sperimentale potente. Tuttavia, Xenopus laevis è stata ostacolata dalla mancanza di una sequenza completa del genoma, che è stato rallentato dalla natura allotetraploide del contrasto genome.In, una specie simile, Xenopus tropicalis, ha un genoma diploide che è stato sequenziato nel 2010 18. Mentre X. tropicalis non è sperimentalmente trattabile come X. laevis 17 la disponibilità di un genoma sequenziato rende un sistema modello attraente per eseguire analisi a livello del genoma. In questo rapporto si descrive un metodo per rendere meiosi II-, citostatici estratti fattore-arrestati (CSF) da X. tropicalis 19. Descriviamo poi un metodo semplice per purificare microtubuli e RNA associati di questo estratto. Gli RNA possono poi essere convertiti in librerie suscettibili di sequenziamento utilizzando tecnologie di sequenziamento recentemente sviluppati ad alto rendimento. Una volta che le librerievengono sequenziati possono essere allineati al genoma della rana per identificare specifici mRNA che si arricchiscono nel campione rispetto al microtubulo estratto totale. Questo fornisce un potente metodo per rilevare microtubuli mirata localizzazione mRNA su un genoma scala. Oltre ad essere in grado di rilevare mRNA localizzate, l&#39;uso di sequenziamento ad alta produttività e un genoma sequenziato offrono la possibilità di scoprire nuovi trascritti che non sono attualmente presenti nelle annotazioni database pubblico.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus tropicalis </td>
			<td>NASCO</td>
			<td>LM00823MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, free base</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>14030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cichlid Lake Salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>47894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>SC7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid Plastic bucket</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Polyallomer 2 x &frac12; inch Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45500-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>45550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &frac34; inch glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall HB-6 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of xenopus tropicalis egg extracts to identify microtubule-associated rnas

Molti organismi localizzano mRNA a specifiche destinazioni subcellulari per l&#39;espressione del gene di controllo spazialmente e temporalmente. Recenti studi hanno dimostrato che la maggioranza del trascrittoma è localizzato in una posizione non casuale nelle cellule ed embrioni. Un approccio per identificare mRNA localizzate è purificare biochimicamente una struttura cellulare di interesse e per identificare tutte le trascrizioni associati. Utilizzando le tecnologie high-throughput sequencing sviluppati di recente, è ora semplice per identificare tutti gli RNA associati a una struttura subcellulare. Per facilitare l&#39;identificazione trascrizione è necessario lavorare con un organismo con un genoma completamente sequenziato. Un sistema interessante per la purificazione biochimica delle strutture cellulari sono estratti di uova prodotte dalla rana Xenopus laevis. Tuttavia, X. laevis attualmente non ha un genoma completamente sequenziato, che ostacola l&#39;identificazione trascrizione. In questo articolo si descrive un metodoper la produzione di estratti di uova da una rana correlato, X. tropicalis, che ha un genoma completamente sequenziato. Noi forniamo i dettagli per la polimerizzazione dei microtubuli, purificazione e isolamento trascrizione. Mentre questo articolo viene descritto un metodo specifico per l&#39;identificazione di trascritti associata ai microtubuli, riteniamo che possa essere facilmente applicato ad altre strutture subcellulari e fornirà un potente metodo per l&#39;identificazione di RNA localizzate.

Per identificare X. trascrizioni tropicalis associati microtubuli, prepariamo un estratto citosolico da uova non fecondate arrestati in metafase della meiosi II (CSF). Trattamento di questo estratto con taxolo permette la formazione di microtubuli stabili che possono essere purificati mediante sedimentazione attraverso un cuscino di glicerolo (Figura 1A). Coomassie analisi gel conferma che i sedimenti α / β-tubulina in maniera taxolo-dipendente, e rappresenta le principali specie proteiche recuperati in queste preparazioni (Figura 1B). Bassi livelli di altre proteine ​​sono presenti anche nella taxolo pellet, ma non in preparazioni trattate con farmaco depolimerizzazione dei microtubuli nocodazole, indicando che le proteine ​​della frazione taxolo specificamente associato con i microtubuli (MAP). Un Agilent Bioanalyzer viene utilizzato per esaminare composizione generale RNA in tutto X. tropicalis estratto frazioni (Figura 1C </strong&gt;). Sia rRNA e tRNA specie sono presenti in estratto di CSF e il microtubulo contenente taxolo pellet, in linea con i risultati precedenti che di traduzione si verifica sui microtubuli e mandrini in X. laevis uovo estratto di 5,21. Una traccia linea della proiezione gel rivela il segnale di mRNA è marcatamente inferiore nel microtubuli contenente taxolo pellet, in particolare nella regione di migrazione sopra 28S rRNA, indicando che un sottoinsieme di mRNA cosediment con microtubuli in X. tropicalis. RNA isolato in questo modo è adatto per esperimenti di RNA-seq utilizzano reagenti disponibili in commercio. <img src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg" /> Figura 1. Purificazione di MT-RNA per la RNA-Seq. (A) schema di purificazione per isolare MT-RNA. Le uova vengono raccolte da femmina X. trorane picalis. Dopo la preparazione di un estratto citoplasmatico, taxolo viene aggiunto per indurre polimerizzazione dei microtubuli. Microtubuli e MT-RNA sono purificati mediante sedimentazione attraverso un cuscino di glicerolo. (B) Analisi Coomassie del gel di proteine ​​isolate utilizzando lo schema descritto in (A). CSF totale estratto rispetto alle proteine ​​sedimentate in presenza di taxolo o nocodazole. (C) Bioanalizzatore analisi del gel di RNA isolato utilizzando lo schema descritto in (A). RNA isolato da CSF estratto rispetto a RNA sedimentato in presenza di taxolo o nocodazole. Sia la proiezione gel e le tracce di linea sono mostrati. Ristampato con il permesso di Sharp, et al., (2011). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Descriviamo la raccolta di non fecondato<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uova e la produzione di un estratto uovo II-arrestato meiosi. Questo estratto uovo può essere usata per purificare microtubuli e RNA associata ai microtubuli.

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

13.6K Views.  Massachusetts General Hospital. Descriviamo la raccolta di non fecondato Xenopus tropicalis Uova e la produzione di un estratto uovo II-arrestato meiosi. Questo estratto uovo può essere usata per purificare microtubuli e RNA associata ai microtubuli.

Video: Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Ricerca

Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

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In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

Utilizzando SCOPE per identificare potenziali Motivi regolamentari in geni Coregulated

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Studio del danno al DNA con Checkpoint<em&gt; Xenopus</em&gt; Uovo Estratti

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...