Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi, come il meccanismo di regolazione dietro la rete mitotica e le proprietà e le funzioni dinamiche dell'orologio del ciclo cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genererà una grande quantità di goccioline con più cicli cellulari in ciascuno, fornendoci un framework ad alta produttività per la manipolazione e l'analisi quantitativa. Per iniziare, scartare lotti di uova che hanno confini poco chiari tra pali animali e vegetali o macchie bianche irregolari sopra i pali degli animali.
Quindi, selezionare un lotto appropriato di uova da una rana femmina e trasferire le uova in un becher da 600 millilitri. Versare un eccesso di tampone MMR 0,2x e aggiungere delicatamente la cisteina in 1x tampone di estrazione alle uova. Dopo questo, agitare vigorosamente il becher a mano per rimuovere le meduse delle uova.
Ripetere questo lavaggio tre volte con un totale di 800 millilitri di tampone di cisteina o fino a quando le uova si aggregano e si depositano sul fondo del becher. Dopo aver rimosso la medusa, lavare le uova quattro volte in un litro di soluzione MMR 0,2x. Usa una pipetta di vetro per raccogliere e scartare le uova che diventano bianche.
Versare il tampone MMR dal becher e aggiungere 200 millilitri di soluzione di ionoforo di calcio nelle uova. Utilizzare una pipetta di vetro per mescolare delicatamente le uova fino a quando non vengono attivate e rimuovere la soluzione di ionoforo di calcio. Lasciare le uova in soluzione di ionoforo di calcio per troppo tempo inizierà l'apoptosi.
Mescoliamo le uova per 1,5 minuti e controlliamo l'efficienza di attivazione. Se non vengono attivati, riprendere l'agitazione e controllare più frequentemente fino al 90% di attivazione. Dopo che le uova si depositano sul fondo del becher, controllare l'efficienza di attivazione.
Le uova ben attivate hanno circa il 25% del polo animale e il 75% del polo vegetale. Successivamente, lavare le uova due volte con un volume totale di 50 millilitri di tampone di estrazione integrato con inibitori della proteasi. Quindi, trasferire attentamente le uova su un microtubo snap-cap da 0,4 millilitri.
Centrifugare il microtubo per 60 secondi a 200 g e poi a 600 g per 30 secondi per imballare le uova. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per rimuovere il buffer in eccesso sopra le uova dopo ogni passaggio. Dopo questo, schiacciare le uova a 15.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Utilizzare una lama di rasoio per tagliare i tubi per separare i tre strati di uova schiacciate e mantenere il citoplasma grezzo nello strato intermedio. Quindi, trasferire il citoplasma grezzo per pulire i tubi ultracentrifugo. Integrare il citoplasma con inibitori della proteasi e citocalcasina B a 10 microgrammi per millilitro ciascuno.
Centrifugare il citoplasma grezzo a 15.000 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tubo e mantenere il citoplasma nello strato intermedio. Mettere gli estratti appena preparati sul ghiaccio.
In primo luogo, aggiungere l'mRNA di cartolarizzazione-mCherry agli estratti preparati. Aggiungere quindi 200 microlitri di fluorosurfactant PFPE-PEG al fluorosurfactant estratto. Utilizzate un mixer vortice per generare goccioline, regolando la velocità e la durata del vortice in base alle esigenze.
Quindi, ispezionare visivamente le goccioline per assicurarsi che siano di dimensioni uniformi. Utilizzando una pipetta da 200 microliter, trasferire le goccioline che galleggiano sulla parte superiore e un volume uguale di tensioattivi su un tubo PCR. Immergere un tubo di vetro nello strato di goccioline e attendere che le goccioline riempiano circa il 75% del tubo.
Quindi, spingere il tubo nello strato tensioattivi e riempire completamente il tubo. Quindi, riempire un piatto con fondo di vetro con olio minerale. Quindi, utilizzare una pinzetta fine per immergere il tubo pieno di goccioline nell'olio.
Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere eventuali detriti visibili o goccioline trapelate. Per evitare movimenti e perdite di goccioline, il tubo di vetro pieno di goccioline deve essere immerso con cura sotto l'olio minerale. Possiamo spingere il tubo su entrambe le estremità con equilibrio o aggiungere alcune gocce di olio minerale sulle estremità del tubo contemporaneamente prima.
Successivamente, utilizzare un microscopio a epifluorescenza dotato di uno stadio xy motorizzato per immagini le goccioline. Registra video time-lapse nel campo luminoso e più canali di fluorescenza ogni sei-nove minuti fino a quando le goccioline perdono la loro attività. Utilizzando questo protocollo, sono state prodotte oscillazioni mitotiche sia in celle semplici e senza nucleare che in celle complicate con nuclei.
Le goccioline senza nuclei hanno generato oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli non smorzati nell'over 92 ore. È stata anche esaminata la capacità dell'oscillatore mitotico di guidare eventi mitotici a valle. L'oscillatore mitotico auto-sostenuto ha guidato i cambiamenti della morfologia nucleare osservati attraverso l'alterazione autonoma di distinte fasi del ciclo cellulare.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare a mente il momento in cui si fa l'estratto, in quanto è sensibile al tempo, e tenere sempre le uova ed estrarre sul ghiaccio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei sistemi per esplorare i principi fondamentali delle proprietà complesse dell'orologio, come la tonnibilità e la stochasticity in Xenopus laevis.
