The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

I neutrofili sono stati isolati da volontari sani che hanno sottoscritto un consenso informato. La ricerca è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per il benessere umano. 1 placcatura e manutenzione di ombelicale Cellule endoteliali Vena <ol><li> Cellule Cultura ombelicale umano Vena endoteliali (HUVEC) secondo le istruzioni del produttore. Crescere HUVECs su fibronectina (FN) Rivestiti piatti (10 mcg / ml, disciolti in acqua demineralizzata) utilizzando supporti (Endothelial Basal Medium (EBM-2) media integrato con Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). Utilizzare coltura cellulare tra 4-8 passaggi per gli esperimenti. </li><li> 1 ° giorno: Cappotto portate camere con 100 ml di fibronectina (10 mg / ml in PBS) per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Giorno 2: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize le cellule dopo il lavaggio accurato con RT tampone fosfato (PBS) pH 7,4, centrifugare a 800 xg e risospendere a 800.000 cellule / ml utilizzando supporti. Piatto 80.000 cellule in ogni singolo canale delle portate camere FN-rivestiti e delicatamente pipetta la sospensione cellulare su e giù. Cultura O / N in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Giorno 3: Aggiornare i media nella diapositiva flusso camera inclinando delicatamente il vetrino con un angolo di 45 °. (Vedi Figura 1A). NOTA: Si raccomanda di rimuovere solo i media nei serbatoi e non nel canale stesso. Rimozione dei media nei canali può causare la perdita delle cellule endoteliali e la morte a causa della forza di trascinamento dei media causata da pipettaggio. </li><li> Controllare al microscopio a contrasto di fase se le cellule endoteliali hanno formato un monostrato (cioè, 100% confluenti). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media due volte al giorno fino a raggiungere il 100% di confluenza. </li><li> Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza, stimolare le cellule con i media (vedere il passaggio1.1) contenente mediatore infiammatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Stimolare HUVECs O / N (vale a dire, 12 ore) con risultati TNF-α in un fenotipo infiammatorio dell&#39;endotelio, cioè., Up-regolazione delle molecole di adesione delle cellule, quali ICAM-1 e VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucociti polimorfonucleati Isolamento Uso gradienti Percoll <ol><li> Preparare N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulfonic acido (HEPES) -buffer (qui di seguito denominato: flow-buffer) prima di isolare leucociti polimorfonucleati (PMN). Flow-tampone è usato per lavare PMN isolati e come tampone nel saggio flusso. Per preparare flow-tampone: diluire 7.72 g di NaCl (132 mm), 4.76 g HEPES (20 mm), 0,45 g KCl (6 mm), 0,25 g MgSO4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mm) in 1 l di acqua demineralizzata e regolare a pH 7,4 (questo stock può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane). </li><li> Aggiungere fresca 100 ml 1 M CaCl 2 &amp; #160, (1 mM), 2,5 ml di albumina umana da una concentrazione di 200 g / L stock (0,5% v / v) e 0,1 g di glucosio per 100 ml (0,1% w / v) di flusso-buffer. Successivamente, filtrare il flusso buffer utilizzando un filtro da 0,45 micron. NOTA: Questo flusso-tampone deve essere preparato fresco per ogni esperimento. </li><li> Prima di isolamento di PMN, preparare una soluzione al 10% di citrato trisodico (TNC) in PBS, pH 7,4. </li><li> Raccogliere 20 ml di sangue intero in vacuettes eparina di sodio da un volontario sano. Diluire sangue intero 1: 1 con 10% PBS / TNC in provette da 50 ml e 20 ml pipetta diluiti attentamente sangue sul 12,5 ml di Percoll (un 23% (w / w) soluzione colloidale in acqua con una densità di 1.130 g / ml) in un nuovo tubo da 50 ml. Posizionare con cura le provette nella centrifuga e centrifugare per 20 minuti a 800 xg con bassa accelerazione e nessuna rottura fissato a RT. NOTA: Quando si aggiunge il sangue diluito al Percoll, inclinare il tubo di Percoll-contenente, in un angolo di 45 ° e pipettare delicatamente il sangue diluito l&#39;arguzia tuboh il più lento impostazione pipetta ragazzo. </li><li> Rimuovere tutto il liquido e successivamente riempire il tubo con gelida lisi degli eritrociti-buffer (4.15 g di NH 4 Cl [0.155 M], 0,5 g KHCO 3 [0.01 M] e 18,5 mg di EDTA (triplex III) [0,1 mm] per 500 ml di ghiaccio-freddo H 2 O) per lisare eritrociti. Lasciare provetta in ghiaccio, talvolta invertendo il tubo, finché la sospensione diventa rosso scuro, seguita da centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C con pause abilitati. NOTA: la frazione pellet contiene i PMN (neutrofili, eosinofili, basofili) insieme ai eritrociti. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare pellet due volte gelida lisi-buffer a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet con flusso-buffer a RT e determinare la concentrazione di PMN utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. Sospendere i PMN nel flusso-buffer a 1 x 10 6 cellule / ml e conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 3 Etichettatura dei endoteliale Junctional VE-caderina e PECAM-1 <ol><li> Aggiungere il PECAM Alexa Fluor 647 anticorpi (clone WM59) ad una diluizione 1: 100 e l&#39;anticorpo VE-caderina-FITC calcio-indipendente (clone 55-7H1) ad una diluizione 1:50 di HUVEC terreno di coltura (vedere il punto 1.1), e incubare per 30 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento flusso di visualizzare la dinamica giunzionali di cellule endoteliali durante neutrofili trasmigrazione in condizioni di flusso fisiologiche. NOTA: Prima di aggiungere gli anticorpi direttamente etichettati al flusso-camere, assicurarsi che il volume di ciascun canale non superi i 100 ml. Questo aiuta a mantenere le spese di anticorpi più basso possibile. </li></ol> 4. PMN TEM Assay Under flusso <ol><li> Posizionare i PMN in un bagno di acqua per 15 min a 37 ° C prima di iniettarle nel flusso del sistema. </li><li> Collegare il tubo di un flusso-camera vuota e riempire con acqua calda (ad esempio, 37 ° C) Flusso-buffer (vedi punto 4.3) per evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante l&#39;impostazione thsistema di flusso e. </li><li> Collegare un lato di un flusso camera vuota per il sistema di flusso pompa a siringa utilizzando tubi in silicone contenente una siringa da 20 ml, e mettere il flusso-camera nella fase microscopio. </li><li> Collegare l&#39;altro lato di un flusso camera vuota nel pallone serbatoio riempito con 37 ° C di mandata-buffer (Figura 1B) e avviare la pompa a siringa per riempire tutte le tubazioni di flusso-buffer. La pompa tirerà il flusso buffer dal serbatoio attraverso il flusso camera nella siringa. NOTA: Questo tubo contiene anche una porta di iniezione in linea Luer, che permette PMN da iniettare con un ago in un esperimento in esecuzione senza arrestare il flusso e la creazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Sostituire il flusso-camera vuota con il flusso-camera contenente TNF-α-trattati HUVEC, collegare il tubo del flusso tampone contenente e posizionarlo nella fase di microscopio (Figura 1C). Pinch off i tubi prima di scollegare e ricollegare ilm alle camere contenenti il ​​HUVEC, come non pizzicare fuori può causare la formazione di bolle d&#39;aria all&#39;interno del tubo e / o velocità di flusso camere. </li><li> Regolare la velocità di flusso di 1 dyn / cm 2, in conformità con le velocità del flusso fisiologico in venule post-capillari (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Record interferenza differenziale contrasto (DIC), FITC (488 nm) e Alexa Fluor 647 (647 nm) simultaneamente utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. </li><li> Iniettare i PMN (passo 4.1) lentamente nel flusso attraverso il sistema in-linea Luer porta di iniezione (Figura 1D) con 1 ml siringhe. </li><li> Dopo pochi minuti, leucociti appaiono, aderire, e trasmigrare. Fermare l&#39;esperimento in qualsiasi momento desiderato scollegando il tubo dal flusso-camera e pipettaggio fissativo (3,7% di formaldeide in PBS) nel flusso-camera. Lasciare fissazione per 10 minuti, seguita da un lavaggio con PBS. I dati vengono analizzati con il software di imaging (vedi Materiali e attrezzature tabella). NOTA: Eseguire la egli esperimento utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotata di una camera climatica a temperatura costante a 37 ° C, 5% di CO 2, e un olio 63X-obiettivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases:+'+vascular+rheumatology.">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Per questo protocollo, è fondamentale per evitare la formazione di bolle d&#39;aria nel flusso-camere, dal momento che questo si tradurrà in apoptosi cellulare e un monostrato perturbato. Per evitare questo, vogliamo sottolineare di prestare particolare interesse alle fasi 4.2 e 4.5, dove i tubi sono collegati al flusso-camera. Un altro punto critico nel protocollo è il priming dei PMN che vengono tenuti a RT da loro incubazione per 15-30 minuti a 37 ° C prima di iniettarle al flusso-camera (passo 4.1). Ciò si traduce in priming delle integrine leucocitarie, permettendo loro di aderire a molecole di adesione, quali ICAM-1 e VCAM-1 presso l&#39;endotelio. Questo protocollo non si limita a studiare la trasmigrazione dei neutrofili. Possono essere utilizzati anche altri tipi di leucociti quali monociti o linfociti. Si noti che passo 4.1, vale a dire, adescamento leucociti possono differire tra i vari tipi di leucociti. Inoltre, possono essere utilizzati altri tipi di cellule endoteliali. Per questo rimane criticoper stimolare le cellule endoteliali con opportuni stimoli infiammatori come il TNF-α e IL-1β. Se neutrofili non rispondono in trasmigrante, si può prendere in considerazione il trattamento della neutrofili brevemente (5 min) con N-formil-L-metionil-L-leucyl-L-fenilalanina (fMLP) peptide 16. Ciò stimolerà i neutrofili, in particolare i loro integrine, ancora di più, che li rende più inclini ad aderire all&#39;endotelio. In genere viene utilizzato 1 dyn / cm 2 velocità del flusso. Questa velocità di flusso si misura in venule post-capillari, luoghi dove avviene la maggior parte della migrazione leucocitaria transendoteliale 17. Utilizzando le portate camere descritti, è possibile aumentare la velocità di flusso fino a 10 dine / cm 2. Tuttavia, non è consigliabile per aumentare ulteriormente il taglio. Essa può causare perdite indesiderate del tubo e il distacco delle cellule dal flusso-camera. I risultati descritti in figura 3 indicano che questiGli anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare e studiare la dinamica del endoteliali giunzioni cellula-cellula durante diapedesi leucocitaria. In particolare, oltre ai saggi di trasmigrazione esistenti questo protocollo permette di discriminare paracellular dalla migrazione transcellulare in condizioni fisiologiche di flusso in tempo reale. Dal momento che gli anticorpi macchiano le giunzioni cellula-cellula, si può segnare il numero di leucociti che attraversano VE-caderina / giunzioni PECAM-1-positivi rispetto non positiva VE-caderina / PECAM-1 siti. In questo modo, la migrazione transcellulare può essere discriminato dalla migrazione paracellulare. È importante sottolineare che questi anticorpi non interferiscono con la funzione delle proteine ​​che si legano a: la PECAM-1 anticorpo utilizzato in questo studio è diretto contro il secondo dominio extracellulare. Le cellule endoteliali che sono state piastrate in presenza dell&#39;anticorpo non presentavano difetti di diffusione o formare un monostrato, suggerendo che l&#39;anticorpo almeno non hainterferire con le interazioni omotipiche tra le cellule endoteliali. in aggiunta a ciò, entrambi gli anticorpi non compromettono la capacità dei neutrofili di migrare attraverso il monostrato endoteliale. Inoltre, il numero di neutrofili che trasmigrano attraverso il monostrato endoteliale in assenza o presenza di anticorpi non viene alterato (dati non mostrati). È importante sottolineare che, microscopio confocale a scansione laser ci dà la possibilità di registrare i canali fluorescenti diversi e DIC contemporaneamente. Pertanto, questo test permette di studiare le dinamiche della VE-caderina e PECAM-1 nello stesso momento in cui una neutrofili attraversa la giunzione cellula-cellula endoteliale e vi aiuterà a capire perché i leucociti scegliere una rotta sopra l&#39;altro, vale a dire, paracellulare contro transcellulare.

Efficiente e strettamente controllato migrazione dei leucociti transendoteliale (TEM) è di fondamentale importanza nei processi fisiologici quali la sorveglianza immunitaria e l&#39;infiammazione acuta. Tuttavia, in determinate condizioni fisiopatologiche, TEM incontrollata ed eccessiva si osserva traduce in malattie infiammatorie croniche (ad esempio, l&#39;artrite reumatoide, aterosclerosi, asma). Anche durante metastasi tumorali delle cellule, il processo di migrazione transendoteliale è strumentale per le cellule tumorali di lasciare la circolazione di metastatizzare 1-3. Al fine di interferire specificamente con eccessiva leucociti o TEM cellule tumorali, è necessaria una conoscenza dettagliata della regolazione di questo processo. Si ritiene che il processo TEM avviene attraverso diverse fasi. Studi seminali, recensito due decenni fa da Butcher e Springer, hanno portato al modello multistep che descrive il processo di TEM 4,5. Questo modello è ancora valido, anche se alcuni annuncipassi nali sono stati inclusi 6. Alon et al. Descritto la necessità della presenza di chemochine immobilizzati sulla superficie dell&#39;endotelio 7. Di recente, hanno mostrato che l&#39;endotelio si genera chemochine che sono presentati alla superficie apicale endoteliale 8. Inoltre, lo stesso gruppo ha presentato l&#39;importanza delle condizioni di flusso durante TEM 7. Recentemente, diverse pubblicazioni incentrate sulle due rotte diverse leucociti possono prendere nella fase finale di diapedesi TEM. Essi possono sia passare attraverso le giunzioni cellula-cellula, cioè, il percorso di migrazione paracellulare, o attraversare il corpo delle cellule endoteliali, noto come il percorso di migrazione transcellulare 9. Carman e colleghi hanno studiato queste vie in dettaglio e ha concluso che leucociti preferenzialmente scegliere il percorso di migrazione paracellulare (90%) sul percorso transcellulare (10%) quando attraversano una vena ombelicale monostrato endoteliale 10.Tuttavia, quando sono stati utilizzati cellule endoteliali provenienti da altre origini, ad esempio, il cervello o microcircolo, più leucociti utilizzato il percorso transcellulare (30%) 11. Il gruppo Vestweber di recente ha mostrato che quando le giunzioni cellula-cellula erano in grado di dissociarsi tra loro utilizzando un knock-in modello animale, sostituendo endogena VE-caderina per VE-caderina-alfa-catenina chimera, leucociti TEM è stato completamente bloccato 12 . Sorprendentemente, gli autori hanno notato che il TEM è stato bloccato in alcuni, ma non tutti, i tessuti. Nel complesso, questi eleganti esperimenti hanno indicato che i leucociti preferito il percorso paracellulare sul percorso transcellulare, anche se i segnali regolatori che attivano questa decisione sono ancora sconosciute. Anche se la maggior parte dei leucociti preferiscono la rotta migratoria paracellulare, è ancora difficile discriminare tra i due percorsi. In aggiunta a ciò, nonostante vari studi focalizzati sul ruolo del junct cellula-cellula endotelialeioni, le dinamiche di queste giunzioni, in particolare le proteine ​​giunzionali VE-caderina e PECAM-1, durante la traversata dei leucociti è ancora in discussione. Abbiamo sviluppato una relativamente semplice test in cui queste molecole di giunzione possono essere monitorati in tempo reale durante la diapedesi dei leucociti in condizioni di flusso fisiologiche mediante anticorpi fluorescente-etichettati. Questi anticorpi non interferire con o bloccare l&#39;integrità giunzionale o mobilità delle proteine ​​target. Questo test ci permette di seguire la dinamica delle proteine ​​giunzionali durante il processo di paracellulare TEM. Inoltre, questo test permette anche di discriminare tra le rotte migratorie parametri e transcellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Durante l&#39;infiammazione, leucociti lasciano la circolazione e attraversano l&#39;endotelio a combattere invasori patogeni nei tessuti sottostanti. Questo processo è noto come migrazione leucocitaria transendoteliale. Sono stati descritti due percorsi per leucociti per attraversare il monostrato endoteliale: il percorso paracellulare, cioè, attraverso le giunzioni cellula-cellula e il percorso transcellulare, cioè, attraverso il corpo delle cellule endoteliali. Tuttavia, è stato tecnicamente difficile discriminare tra il paragrafo e itinerario transcellulare. Abbiamo sviluppato un semplice test in vitro per studiare la distribuzione di endogeno VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei neutrofili transendoteliale in condizioni di flusso fisiologiche. Prima di perfusione neutrofili, cellule endoteliali sono stati brevemente trattati con anticorpi fluorescenza marcata nei confronti di VE-caderina e PECAM-1. Questi anticorpi non interferiscono con la funzione di entrambe le proteine, come è stato determinato elettrico cellula-substrarilevamento impedenza te e FRAP misure. Usando questo test, siamo stati in grado di seguire la distribuzione dei endogeno VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione transendoteliale in condizioni di flusso e distinguere le parametri e migrazione transcellulare percorsi dei leucociti attraverso l&#39;endotelio.

Abbiamo prima testato se gli anticorpi non hanno interferito con la funzione di barriera dell&#39;endotelio. Abbiamo misurato la resistenza di monostrati endoteliali mediante rilevamento impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS). Per dettagli, vedere Van Buul et al. 13 Nessun cambiamento nella resistenza è stata osservata quando l&#39;anticorpo anti-VE-caderina fluorescenza marcata è stato aggiunto alle cellule (Figura 2A). Un anticorpo anti-VE-caderina che è ben riconosciuto per bloccare VE-caderina funzione riduce drasticamente la resistenza (Figura 2A). Inoltre, gli anticorpi utilizzati per l&#39;imaging non alterano le dinamiche della VE-caderina, come è stato valutato misurando il recupero fluorescente dopo fotometabolismo (FRAP) di VE-caderina-GFP (Figura 2B). Dopo 1-2 minuti, neutrofili rispettate monostrato endoteliale attivato come potrebbe essere visualizzato nel canale DIC (Figura 3A). Dopo la scansione per 5-30 seC, la stragrande maggioranza dei neutrofili trasmigrato attraverso il monostrato endoteliale attraverso le giunzioni cellula-cellula che sono stati etichettati con gli anticorpi diretti contro PECAM-1 e VE-caderina. Durante il processo di diapedesi, la distribuzione di VE-caderina e PECAM-1 è stata seguita in tempo reale (Figura 3B). Nei siti di neutrofili diapedesi, VE-caderina è stato interrotto a livello locale e PECAM-1 ha mostrato una struttura più anulare. Dopo il completamento della diapedesi, le giunzioni strette e VE-caderina e PECAM-1 chiaramente trasferiti nei siti di diapedesi (Figura 3C). Si noti che le parti del anticorpo anti-PECAM-1 sono stati rilevati sulla superficie del neutrofilo, una volta raggiunta la neutrofili lato basolaterale dell&#39;endotelio. Tuttavia, questo non ha impedito neutrofili di attraversare l&#39;endotelio. Le dinamiche osservate del VE-caderina in tempo reale durante la migrazione dei neutrofili transendoteliale erano in accordo con il lavoro di Shaw e colleghi cheha mostrato, utilizzando la microscopia confocale e VE-caderina-GFP-trasfettate cellule endoteliali, che VE-caderina-GFP diffusa lateralmente quando leucociti attraversarono le giunzioni cellula-cellula endoteliali 14. Lavorare anche da Su e colleghi hanno sottolineato le nostre osservazioni di PECAM-1. Essi hanno dimostrato che, accanto al laterale VE-caderina diffusione sul passaggio dei leucociti, è stato ridistribuito localmente PECAM-1 in un anello intorno al trasmigrante neutrofili 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1 Nella camera di flusso vitro. (A) La freccia indica il serbatoio da cui il mezzo deve essere aggiornato. (B) tubo in silicone che collega la camera di flusso con la porta di iniezione Luer in-linea utilizzata per l&#39;iniezione di PMN senza scollegare il tubo (punta di freccia). (C) Connezione di un flusso-camera vuota al pallone serbatoio riempito con 37 ° C di flusso-buffer (punta di freccia). (D) Collegamento del flusso da camera con i HUVECs TNF-α-trattate per il tubo-flow-tampone contenente e posto in palco microscopio (punta di freccia). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 VE-caderina anticorpi non interferiscono con la dinamica o la funzione giunzionale. (A) delle cellule endoteliali impedenza monostrato viene misurata utilizzando ECIS. Y esprime impedenza in Ohm e asse x rappresenta il tempo in ore. VE-caderina anticorpi clone 55-7H1, marcato con ALEXA647 (linea blu) o isotipo di controllo IgG-ALEXA647 (linea rossa) non alterare l&#39;impedenza monostrato di cellule endoteliali, mentre la VE-caderina blocco CL75 anticorpo (linea nera) si riduce l&#39;impedenza . (B </strong&gt;) VE-caderina-GFP è stato espresso in HUVEC e analisi FRAP usando la microscopia confocale ha rivelato alcun cambiamento nel recupero di fluorescenza in presenza o assenza della VE-caderina 55-7H1 anticorpo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 VE-caderina e PECAM-1 durante la distribuzione dei neutrofili TEM in tempo reale. (A) dei neutrofili (contrassegnato con linea bianca) aderendo sull&#39;endotelio e attraversando la giunzione cellula-cellula senza influenzare la distribuzione di VE-caderina e PECAM -1. (B) dei neutrofili attraversando il monostrato endoteliale attraverso le giunzioni cellula-cellula. Una dispersione locale di VE-caderina e PECAM-1 possono essere osservati quando una neutrofili sporge attraverso le giunzioni cellula-cellula. Linea bianca illustra la presenza di neutrofili ancora in cima dell&#39;endotelio. Linea gialla mostra membrana dei neutrofili that è già sotto endotelio. (C) dei neutrofili ha completamente attraversato il monostrato endoteliale. VE-caderina e PECAM-1 sono trasferiti in siti di diapedesi. Linea gialla illustra confini neutrofili trasmigrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

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JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K Views.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione. 

Video: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...