The Authors would first like to acknowledge all students from the freshman Biology 121- Ecology Module lab at Juniata College for their help in generating data used in this study. We would also like to thank Dr. Randy Bennett, Chris Walls, Sherry Isenberg, and Taylor Cox for their assistance in acquiring materials necessary to develop this methodology. Additionally, we would like to thank Dr. Norris Muth and Dr. John Unger for their advice on methodological development and Dr. Jill Keeney and the Biology department for their support of this endeavor. We would also like to thank the anonymous reviewers that have helped to shape and focus this manuscript.&#160; Last but not least, I&#39;d like to thank Hudson Grant for his help with the initial stonefly collection for use in development of this technique

Nota: Questo esperimento non ha utilizzato i vertebrati e quindi non richiede l&#39;approvazione da parte dell&#39;Istituto di Juniata College for Animal Care e del Comitato Usa. Tuttavia per gli individui adattano questo metodo per l&#39;utilizzo con i vertebrati, l&#39;approvazione IACUC dovrebbe essere cercato. 1. Campo Raccolta del campione <ol><li> Determinare e valutare potenziali siti di campo per la capacità di raccogliere, memorizzare e plecotteri trasporto rapidamente per ridurre al minimo il tempo in transito con un tempo massimo raccomandato in transito di 1 ora. </li><li> Eseguire il campionamento calcio-net nel sito campo selezionato seguendo le procedure di kick-net standard di volte sufficiente a raccogliere almeno 35 stoneflies 12. </li><li> Raccogliere 50 L di acqua corrente e rocce con un diametro massimo di 2 cm dai flussi. </li><li> Posizionare acquari in frigorifero è impostato sulla temperatura del sito stream. Distribuire rocce raccolti nel sito di flusso in acquari e riempire con 4 litri di acqua corrente per acquario. Mettere 20-30 Plecotteri raccolti per acquario e mettere un pietra spumeggiante collegato a un gorgogliatore acquario in ogni serbatoio e si accendono bubblers aggiungere continuamente aria ambiente per l&#39;acqua. </li><li> Lasciare le plecotteri per regolare al nuovo ambiente negli acquari per un periodo di 48 ore. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54430/54430fig1.jpg" /> Figura 1. Configurare per la manipolazione di ossigeno disciolto. (A) 1) Raccordo per tubo rame per tubo maschio sbavatura 2) Posizione di tenuta del tappo di esaminare per garantire ben pallone di tenuta. (B) 1) 2 L pallone braccio laterale riempito con 1,9 L di acqua 2) tubo del gas e bubbler aria (blu) per l&#39;utilizzo in gorgogliamento di azoto e camera d&#39;aria spumeggiante, rispettivamente, 3) serbatoio di azoto e valori calibrate 4) 2 L pallone riempita con 0,4 L di acqua con tubo a vuoto sommerso 5) disciolto misuratore di ossigeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54430/54430fig1large.jpg" target="_blank">cliccate qui per</a>visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. set up sperimentale <ol><li> Su un banco, collegare un tubo a vuoto murata standard al braccio laterale di un pallone braccio laterale 2 L come mostrato (1 nella Figura 1B). </li><li> Riempire il pallone con 1,9 L di acqua corrente da contenitori di plastica 3 L in possesso di flusso di acqua raccolta in frigorifero impostato a 12 ° C. </li><li> Porre il pallone e il tubo su un vassoio abbastanza grande da contenere un bagno di ghiaccio attorno al pallone di braccio laterale senza oscurare la vista dell&#39;interno pallone e riempire il vassoio con ghiaccio. </li><li> Praticare due fori di diametro 3 mm in un tappo di gomma per consentire il passaggio di 1) un tubo di rame per trasportare il gas nel contenitore e 2) la sonda di metro DO nel pallone braccio laterale 2 L (1 nella Figura 1B) . </li><li> Effettuare una incisione laterale dal bordo del tappo ad uno dei fori per consentire sedere del filo della sonda DO nel tappo. </li><li> Collegare un accoppiatore con un tubo maschio 3 millimetriardiglione ad un pezzo di tubo di rame del diametro di 2 mm (1 nella Figura 1A). Assicurarsi che il tubo è abbastanza lungo da raggiungere entro 10 cm dal fondo del pallone mentre raggiunge attraverso il tappo. </li><li> Posizionare il tubo con accoppiatore se il secondo foro nel tappo finché la lunghezza dalla parte inferiore del tappo è sufficiente a raggiungere entro 10 cm dal fondo del pallone. </li><li> Collegare un 0,75 m di lunghezza, sottile tubo parete gas polietilene con un diametro di 3 mm al raccordo sul tubo. </li><li> Far scorrere sia la sonda DO e tubo di rame nel pallone e sigillare il pallone con il tappo. </li><li> Vedi per una tenuta sicura tra il tappo e il matraccio, nonché una perfetta aderenza tra il tubo e la sonda all&#39;interno del tappo. </li><li> Riempire un pallone da 1 L con 0,4 L di acqua di rubinetto e posizionare adiacente al vassoio con il bagno di ghiaccio e pallone di vuoto. </li><li> Immergere il tubo di polietilene proveniente dalla beuta a vuoto su nell&#39;acqua del pallone 1 L. Fissare iltubo con nastro adesivo tale che rimanga sommersa attraverso l&#39;esperimento. </li><li> Collegare la linea del gas diametro di 3 mm dalla boccetta di vuoto ad un gorgogliatore camera con aria acquario. Inizia a bolla l&#39;acqua nel pallone da 2 L collegando il gorgogliatore acquario, che introduce aria ambiente e ossigeno all&#39;acqua. </li><li> Monitorare la concentrazione DO e temperatura dell&#39;acqua con il misuratore DO per 5 minuti o fino a quando si stabilisce l&#39;equilibrio della DO all&#39;interno della camera in modo tale che pochi cambiamenti in DO sta avvenendo. </li></ol> 3. testare la stabilità del set up sperimentale <ol><li> Testare ogni setup per DO stabilità prima dell&#39;aggiunta di stoneflies. </li><li> Aggiungere tre o quattro pietre nel pallone 2 L in modo che plecotteri hanno substrato favorevole per flessioni. </li><li> Iniziare una manipolazione di prova di DO staccando il tubo del gas dal gorgogliatore e di collegarlo alla linea del gas di azoto. </li><li> Inizia gorgogliare azoto a 20 piedi cubi per ora (CFH) per circa 40sec a 1 min. </li><li> Una volta che la DO è scesa entro 0,5 mg / L della concentrazione target, ridurre il flusso a 15 CFH e consentire la concentrazione per ridurre al bersaglio. </li><li> Cessate flusso di azoto non appena viene raggiunta la concentrazione target. </li><li> Utilizzare l&#39;acquario bubbler stanza con aria per riportare la concentrazione la concentrazione target se la DO si riduce al di sotto dell&#39;obiettivo. </li><li> Se il DO è instabile durante il controllo di un set-up quindi controllare il volume d&#39;acqua è ancora a 1,9 L e l&#39;acqua non è bollito fuori, la temperatura dell&#39;acqua è stabile e non cambia, e sigilli su tutti i raccordi sembrano essere stretto e sigillato. </li><li> Una volta che tre prove sono state eseguite e lo sperimentatore ha fiducia nella capacità di controllare DO, collegare la linea del gas nel gorgogliatore e bolla all&#39;equilibrio di nuovo. </li><li> Bubble all&#39;equilibrio collegando la linea del gas 3 mm di diametro nel gorgogliatore acquario e iniziare l&#39;aggiunta di aria ambiente in acqua fino alla concentrazione diossigeno nell&#39;acqua non aumenta o cambiate per 3 min. </li><li> Una volta in equilibrio, fermare spumeggiante e unseal del pallone. </li></ol> 4. Stonefly Esperimento Push-up <ol><li> Dividere il numero totale di stoneflies per il numero di osservatori per determinare il numero di prove da eseguire. </li><li> Determinare diversi livelli di DO tra 2 e 10 mg / L per valutare la risposta comportamentale di plecotteri (numero di flessioni). </li><li> Impostare un pallone per ogni prova e aggiungere un numero uguale di plecotteri in quanto vi sono osservatori il recipiente (4 stoneflies all&#39;interno di questo disegno), posizionare la sonda e il tubo di nuovo nel pallone, poi richiudere il pallone con il tappo di gomma. Nota: Un primo DO concentrazione di 10 mg / L è stato scelto come il primo punto di osservazione in quanto era la concentrazione DO del torrente da cui sono stati campionati i stoneflies. </li><li> Una volta che l&#39;acqua è a 10 mg / L facendo gorgogliare di seguito i passaggi 2,10-2,11, registrare la temperatura dell&#39;acqua a partire e lasciare laplecotteri da allegare al substrato di roccia nel pallone. </li><li> Assegnare solo un osservatore a guardare un singolo Stonefly per garantire un conteggio preciso del comportamento push-up, che è il movimento del corpo su e giù esibita dal Stonefly. </li><li> Contare e registrare il numero di flessioni osservate nel corso di un periodo di osservazione di 3 min. </li><li> Manipolare DO al livello successivo sperimentale DO e ripetere periodo di osservazione di 3 minuti per i livelli sperimentali aggiuntivi. Nota: All&#39;interno di questo progetto sperimentale, tre diversi livelli di DO sono stati valutati. </li></ol> 5. Analisi statistica <ol><li> Per eseguire numero medio uso l&#39;analisi statistica dei push-up attraverso le quattro plecotteri in un gruppo per un determinato processo DO. </li><li> Utilizzare la libera R software di calcolo statistico 12 per eseguire una analisi della varianza (ANOVA) sul numero di push-up e le concentrazioni di DO con l&#39;ordine di ogni prova sperimentale (DO livello) e la temperatura come COVariates. Analizzato DO come livelli discreti di un singolo fattore. </li><li> Utilizzare un test di normalità di Anderson-Darling residui per verificare la normalità 13. </li><li> Eseguire una regressione lineare sui dati tracciando il numero medio di push-up contro le concentrazioni di fare. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoback, W., Stanley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insects+in+hypoxia.">Insects in hypoxia.</a> J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).</li><li>Craig, J., Crowder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+habitat+shifts+and+energetic+consequences+in+Atlantic+croaker+and+brown+shrimp+on+the+Gulf+of+Mexico+shelf.">Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf.</a> Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).</li><li>Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+Physiological+Responses+of+Largemouth+Bass+to+Rain-Induced+Reductions+in+Dissolved+Oxygen+in+an+Urban+System.">Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System.</a> T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).</li><li>Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Push-up+response+of+stonefly+larvae+in+low-oxygen+conditions.">Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions.</a> Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).</li><li>McCafferty, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , (1983).</li><li>Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+ecology+of+macroinvertebrates+in+a+swamp-river+system+of+east+Africa.">Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa.</a> Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).</li><li>Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+environmental+temperature+and+oxygen+concentration+on+the+recovery+of+largemouth+bass+from+exercise+implications+for+live+-+release+angling+tournaments.">The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments.</a> J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).</li><li>Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquatic+surface+respiration+and+swimming+behaviour+in+adult+and+developing+zebrafish+exposed+to+hypoxia.">Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia.</a> J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).</li><li>Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+apparatus+for+degassing+viscous+liquids+and+removing+gas+bubbles+suspended+therein.">Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein.</a> US patent. , (1974).</li><li>Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+degassing+liquids.">Apparatus for degassing liquids.</a> US patent. , (2001).</li><li>Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum+degassing.">Vacuum degassing.</a> US patent. , (2002).</li><li>Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+number+EPA+841-B-99-002.">Report number EPA 841-B-99-002.</a> Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , (1999).</li><li>Anderson, T., Darling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Test+of+Goodness+of+Fit.">A Test of Goodness of Fit.</a> J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).</li><li>Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+A6+Field+Measurements.+Section+6.2+DISSOLVED+OXYGEN.">Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN.</a> National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , (2013).</li><li>Hem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , (1985).</li><li>Burggren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Air+Gulping&amp;#34;+Improves+Blood+Oxygen+Transport+during+Aquatic+Hypoxia+in+the+Goldfish+Carassius+auratus.">34;Air Gulping&amp;#34; Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus.</a> Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).</li><li>Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+Ventilatory,+and+Metabolic+Responses+to+Severe+Hypoxia+and+Subsequent+Recovery+of+the+Hypogean+Niphargus+rhenorhodanensis+and+the+Epigean+Gammarus+fossarum+(Crustacea:+Amphipoda).">Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda).</a> Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).</li><li>Ultsch, G., Duke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+Exchange+and+Habitat+Selection+in+the+Aquatic+Salamanders+Necturus+maculosus+and+Cryptobranchus+alleganiensis.">Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis.</a> Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

passaggi critici Questa procedura fornisce un modo semplice ed efficace per manipolare fare in un ambiente di laboratorio per eseguire studi comportamentali sugli organismi acquatici. Abbiamo trovato lì per essere diversi critici passi / oggetti di essere a conoscenza di quando si esegue questo esperimento che direttamente correlata ai risultati. All&#39;interno di un processo, è fondamentale per mantenere la pressione della camera per evitare variazioni della pressione parziale del gas sopra l&#39;acqua, e la ...

ossigeno disciolto (DO) è un parametro fisico-chiave importante nel mediare una serie di processi biologici ed ecologici all&#39;interno degli ecosistemi acquatici. Le esposizioni verso ipossia acuta e cronica sub-letali di ridurre i tassi di crescita in certi insetti acquatici e riducono la sopravvivenza degli insetti esposti 1. Questo protocollo è stato sviluppato per fornire un metodo controllato per manipolare i livelli facciamo in acqua corrente per osservare gli effetti sul comportamento animale. Dal momento che la sopravvivenza tutti gli organismi acquatici aerobici che dipende dalla concentrazione di ossigeno per vivere e riprodursi, i cambiamenti nella concentrazione di DO sono spesso riflettono in cambiamenti comportamentali da parte di organismi. Altri invertebrati acquatici mobili e pesci sono stati osservati per rispondere a basse concentrazioni di ossigeno (ipossia) attraverso la ricerca di locali con una maggiore DO 2,3. Per gli organismi acquatici mobili meno, adattamenti comportamentali per aumentare l&#39;assunzione di DO può essere l&#39;unica opzione praticabile. L&#39;ordine di macroinvertebrati acquatici di PlecOPTera (Stonefly) è stato notato per eseguire movimenti &quot;push-up&quot; per aumentare il flusso di acqua, e l&#39;assorbimento di ossigeno, attraverso le loro branchie esterne 4 - 6. Tali comportamenti adattativi sono stati osservati negli ambienti naturali e in esperimenti di laboratorio. manipolazione Laboratorio di DO in acqua apre notevoli opportunità per gli studi del comportamento animale, ma esistono lacune significative nella distribuzione metodologica. Per esempio, uno studio ha utilizzato grandi acquari per valutare il tempo di risposta fisiologica di persico trota (Micropterus salmoides) per ambienti di ipossia seguito gassificazione con l&#39;azoto, ma i dettagli scarsa è dato per la metodologia 7. Un altro studio condotto su Zebra pesce (Danio rerio) descritta utilizzando gas di azoto e una pietra porosa per fornire il gas per l&#39;acqua e ridurre il DO dell&#39;acqua 8. Per applicazioni chimica basata, metodi per la degasificazione di solventi utilizzano specializzatoApparecchi 9 - 11 per rimuovere ossigeno da solventi, ma non sarebbe adatto per studi sul comportamento animale. Mentre questi studi impiegano metodi per rimuovere ossigeno da acqua, nessun metodo descrittivo potrebbe essere identificato che permetterebbe valutazione del comportamento animale in risposta ai cambiamenti DO. Questo metodo descritto qui di seguito è un tentativo di descrivere completamente un protocollo per la manipolazione di DO di acqua utilizzando gas azoto. Inoltre, questo metodo è stato sviluppato verso osservando le relazioni tra comportamento Stonefly (flessioni) e DO che è stato impiegato in un laboratorio di biologia a livello di matricola. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che può facilmente essere eseguita all&#39;interno di un laboratorio con vetro e di prodotti accessibili alla maggior parte degli istituti di istruzione secondaria e superiore comune. Il protocollo è anche facilmente adattabile, permettendo alle persone di scalare la procedura per raggiungere gli obiettivi stabiliti per le applicazioni di ricerca e di insegnamento. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>Filter flask 2 L</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stopper size 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z164534</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 Clear Plastic Tubing</td><td>Thermo Scienfitic</td><td>8001-1216</td><td></td></tr><tr><td>Whisper 60 air pump</td><td>Tetra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard flexible Air line tubing</td><td>Penn Plax</td><td>ST25</td><td></td></tr><tr><td>0.25 inch Copper tubing</td><td>Lowes Home Improvement</td><td>23050</td><td></td></tr><tr><td>Male hose barb</td><td>Grainger</td><td>5LWH1</td><td></td></tr><tr><td>Female Connector</td><td>Grainger</td><td>20YZ22</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter</td><td>Extech</td><td>407510</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Matheson TRIGAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radnor AF150-580 Regulator</td><td>Airgas</td><td>RAD64003036</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple approach to manipulate dissolved oxygen for animal behavior observations

La capacità di manipolare ossigeno disciolto (DO) in un ambiente di laboratorio ha un&#39;applicazione significativo per indagare su una serie di domande comportamento ecologico e degli organismi. Il protocollo qui descritto fornisce un metodo semplice, riproducibile e controllato per manipolare DO per studiare risposta comportamentale in organismi acquatici ottenuti da ipossia e condizioni anossiche. Durante l&#39;esecuzione di degassificazione di acqua con azoto è comunemente usato in laboratorio, nessun metodo esplicita per ecologica applicazione (acquatico) esiste nella letteratura, e questo protocollo è il primo a descrivere un protocollo per degassano acqua per osservare risposta organica. Questa tecnica e il protocollo sono stati sviluppati per l&#39;applicazione diretta di macroinvertebrati acquatici; Tuttavia, piccoli pesci, anfibi e altri vertebrati acquatici potrebbero essere facilmente sostituiti. Esso consente una facile manipolazione dei livelli DO vanno da 2 mg / L a 11 mg / L con stabilità fino ad un periodo di osservazione animali-5 min.Al di là di un periodo di 5 minuti di osservazione la temperatura dell&#39;acqua ha cominciato a salire, ed a 10 min DO livelli è diventato troppo instabile per mantenere. Il protocollo è scalabile per l&#39;organismo studio, riproducibile e affidabile, consentendo una rapida implementazione in laboratori didattici introduttivi e applicazioni di ricerca di alto livello. I risultati attesi di questa tecnica dovrebbe riferirsi sciolto modifiche ossigeno alle risposte comportamentali degli organismi.

<html> Sei prove del setup descritto sono stati eseguiti da 24 matricole studenti universitari in un ambiente di laboratorio didattico per quantificare il numero di push-up plecotteri in atto in risposta a differenti concentrazioni DO in acqua. Il numero medio di push-up eseguito all&#39;interno di un livello di DO e all&#39;interno di ogni processo è stato riunito per tracciare push-up contro il livello di DO nella figura 2. Un&#39;ANOVA è stata eseguita inizialmente u...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations at JoVE.com

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

Questo articolo descrive un protocollo semplice e riproducibile per manipolare le condizioni di ossigeno disciolto in un ambiente di laboratorio per gli studi di comportamento animale. Questo protocollo può essere utilizzato in entrambe le impostazioni di insegnamento e laboratorio di ricerca per valutare la risposta organismal di macroinvertebrati, pesci, anfibi o alle variazioni di concentrazione di ossigeno disciolto.

Un approccio semplice per manipolare ossigeno disciolto per Osservazioni Comportamento animale

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

a-simple-approach-to-manipulate-dissolved-oxygen-for-animal-behavior

Research

JoVE Journal

Environment

9.2K Views.  Juniata College.  Questo articolo descrive un protocollo semplice e riproducibile per manipolare le condizioni di ossigeno disciolto in un ambiente di laboratorio per gli studi di comportamento animale. Questo protocollo può essere utilizzato in entrambe le impostazioni di insegnamento e laboratorio di ricerca per valutare la risposta organismal di macroinvertebrati, pesci, anfibi o alle variazioni di concentrazione di ossigeno disciolto. 

Video: A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The Benthic Exchange of O2, N2 and Dissolved Nutrients Using Small Core Incubations

The measurement of sediment-water exchange of gases and solutes in aquatic sediments provides data valuable for understanding the role of sediments in nutrient and gas cycles. After cores with intact sediment-water interfaces are collected, they are submerged in incubation tanks and kept under aerobic conditions at in situ temperatures. To initiate a time course of overlying water chemistry, cores are sealed without bubbles using a top cap with a suspended stirrer. Time courses of 4-7 sample points are used to determine the rate of sediment water exchange. Artificial illumination simulates day-time conditions for shallow photosynthetic sediments, and in conjunction with dark incubations can provide net exchanges on a daily basis. The net measurement of N2 is made possible by sampling a time course of dissolved gas concentrations, with high precision mass spectrometric analysis of N2:Ar ratios providing a means to measure N2 concentrations. We have successfully applied this approach to lakes, reservoirs, estuaries, wetlands and storm water ponds, and with care, this approach provides valuable information on biogeochemical balances in aquatic ecosystems.

The Benthic Exchange of O2, N2 and Dissolved Nutrients Using Small Core Incubations

Here, we present small core incubations for the measurement of sediment-water gas and solute exchange. These will provide reliable measurements of sediment-water exchange that assess the role of sediment in influencing biological and biogeochemical processes in aquatic ecosystems.

La Borsa bentonici di O<sub&gt; 2</sub&gt;, N<sub&gt; 2</sub&gt; e nutrienti disciolti Utilizzo piccolo nucleo Incubazioni

The measurement of sediment-water exchange of gases and solutes in aquatic sediments provides data valuable for understanding the role of sediments in ...

Ricerca

Ambiente

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling from hydrothermal sources in the Precambrian ocean was oxidized by molecular oxygen [O2] produced by cyanobacteria. The oldest BIFs, deposited prior to the Great Oxidation Event (GOE) at about 2.4 billion years (Gy) ago, could have formed by direct oxidation of Fe(II) by anoxygenic photoferrotrophs under anoxic conditions. As a method for testing the geochemical and mineralogical patterns that develop under different biological scenarios, we designed a 40 cm long vertical flow-through column to simulate an anoxic Fe(II)-rich marine upwelling system representative of an ancient ocean on a lab scale. The cylinder was packed with a porous glass bead matrix to stabilize the geochemical gradients, and liquid samples for iron quantification could be taken throughout the water column. Dissolved oxygen was detected non-invasively via optodes from the outside. Results from biotic experiments that involved upwelling fluxes of Fe(II) from the bottom, a distinct light gradient from top, and cyanobacteria present in the water column, show clear evidence for the formation of Fe(III) mineral precipitates and development of a chemocline between Fe(II) and O2. This column allows us to test hypotheses for the formation of the BIFs by culturing cyanobacteria (and in the future photoferrotrophs) under simulated marine Precambrian conditions. Furthermore we hypothesize that our column concept allows for the simulation of various chemical and physical environments &#8212; including shallow marine or lacustrine sediments.

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

We simulated a Precambrian ferruginous marine upwelling system in a lab-scale vertical flow-through column. The goal was to understand how geochemical profiles of O2 and Fe(II) evolve as cyanobacteria produce O2. The results show the establishment of a chemocline due to Fe(II) oxidation by photosynthetically produced O2.

Simulazione Laboratorio di ferro (II) ricchi di Precambriano Marine Upwelling sistema per esplorare la crescita di batteri fotosintetici

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response to diel-cycling hypoxia. A Wheatstone bridge was connected to strain gauges that were attached to the shells of oysters (Crassostrea virginica). The recorded signals allowed for the opening and closing of the bivalves to be recorded continuously over two-day periods of experimentally-induced diel-cycling hypoxia and diel-cycling changes in pH. Here, we describe a protocol for developing an inexpensive strain gauge monitor and describe, in an example laboratory experiment, how we used it to measure the valve gape behavior of Eastern oysters (C. virginica), in response to diel-cycling hypoxia and cyclical changes in pH. Valve gape was measured on oysters subjected to cyclical severe hypoxic (0.6 mg/L) dissolved oxygen conditions with and without cyclical changes in pH, cyclical mild hypoxic (1.7 mg/L) conditions and normoxic (7.3 mg/L) conditions. We demonstrate that when oysters encounter repeated diel cycles, they rapidly close their shells in response to severe hypoxia and close with a time lag to mild hypoxia. When normoxia is restored, they rapidly open again. Oysters did not respond to cyclical pH conditions superimposed on diel cycling severe hypoxia. At reduced oxygen conditions, more than one third of the oysters closed simultaneously. We demonstrate that oysters respond to diel-cycling hypoxia, which must be considered when assessing the behavior of bivalves to dissolved oxygen. The valve SGM can be used to assess responses of bivalve molluscs to changes in dissolved oxygen or contaminants. Sealing techniques to better seal the valve gape strain gauges from sea water need further improvement to increase the longevity of the sensors.

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Understanding the behavioral responses of bivalve suspension-feeders to environmental variables, such as dissolved oxygen, can explain some ecosystem processes. We have developed an inexpensive, laboratory-based, strain gauge monitor (SGM) to measure valve gape responses of oysters, Crassostrea virginica, to diel-cycling hypoxia and cyclical pH.

Un Monitor di Strain Gauge (SGM) per misurazioni continue di Gape valvola nei molluschi bivalvi in risposta all'ipossia laboratorio indotto Diel-ciclismo e pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological states of islet hypoxia, especially in transplant environments. Standard hypoxic chamber techniques cannot modulate both stimulations at the same time nor provide real-time monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors. To address these difficulties, we applied a multilayered microfluidic technique to integrate both aqueous and gas phase modulations via a diffusion membrane. This creates a stimulation sandwich around the microscaled islets within the transparent polydimethylsiloxane (PDMS) device, enabling monitoring of the aforementioned coupling factors via fluorescence microscopy. Additionally, the gas input is controlled by a pair of microdispensers, providing quantitative, sub-minute modulations of oxygen between 0-21%. This intermittent hypoxia is applied to investigate a new phenomenon of islet preconditioning. Moreover, armed with multimodal microscopy, we were able to look at detailed calcium and KATP channel dynamics during these hypoxic events. We envision microfluidic hypoxia, especially this simultaneous dual phase technique, as a valuable tool in studying islets as well as many ex vivo tissues.

Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.

Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Bioingegneria

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Biochimica

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Biologia dello sviluppo

A Low-Cost Method of Measuring the In Situ Primary Productivity of Periphyton Communities of Lentic Waters

Measuring the in situ primary productivity of periphyton during the growing season gradient can elucidate the quantitative effect of environmental drivers (mainly phosphorus concentration and light intensity) and species composition on primary productivity. Primary productivity is mainly driven by light intensity, temperature, availability of nutrients, and distribution of the ionic species of the carbonate system in the respective depths of the euphotic zone. It is a complex system that is very difficult to simulate in the laboratory. This cheap, transportable, and easy-to-build floating barge allows measuring the primary productivity accurately-directly under the actual natural conditions. The methodology is based on measuring the primary productivity in real time using noninvasive oxygen sensors integrated into tightly sealed glass jars, enabling online oxygen flux monitoring and providing new insights into metabolic activities. Detailed seasonal in situ measurements of gross primary productivity of microbial mats (or other benthic organisms) can improve current knowledge of the processes controlling primary productivity dynamics in lentic waters.

A Low-Cost Method of Measuring the In Situ Primary Productivity of Periphyton Communities of Lentic Waters

Presented here is a cost-effective and transportable method/facility for measuring the primary productivity of microbial mats under actual in situ environmental temperature and light conditions. The experimental setup is based on widely available materials and can be used under various conditions while offering the advantages of laboratory-based models.

Un metodo a basso costo per misurare la produttività primaria in situ delle comunità periphyton delle acque leniche

Measuring the in situ primary productivity of periphyton during the growing season gradient can elucidate the quantitative effect of environmental drivers ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell&#39;ipossia sulla<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Biologia

Adattamento della microrespirometria per la Drosophila - Approfondimenti sul metabolismo dei mutanti CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autore in primo piano: Influenza della temperatura su Drosophila melanogaster e coleotteri adattati al deserto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Un approccio semplice per manipolare ossigeno disciolto per Osservazioni Comportamento animale

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

La Borsa bentonici di O

Simulazione Laboratorio di ferro (II) ricchi di Precambriano Marine Upwelling sistema per esplorare la crescita di batteri fotosintetici

Un Monitor di Strain Gauge (SGM) per misurazioni continue di Gape valvola nei molluschi bivalvi in risposta all'ipossia laboratorio indotto Diel-ciclismo e pH

Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Un metodo a basso costo per misurare la produttività primaria in situ delle comunità periphyton delle acque leniche

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla

Misurazione del consumo di O₂ in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica