Questo lavoro è stato sostenuto dal sostegno da Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e dalla borsa DFG KH 376 / 1-1 assegnata a HK

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell&#39;Università di Cambridge. 1. Manutenzione degli animali <ol><li> Embrioni di rana NOTA: Gli embrioni possono essere sollevati e mantenuti secondo l&#39;impianto di animale e di laboratorio. Qui viene descritto un esempio della manutenzione animale. <ol><li> Preparare la soluzione soluzione modificata di Barth (MBS): 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHCO 3 , 100 μM HEPES, 8,2 μM MgSO 4 , 3,3 μM Ca (NO 3 ) 2 e 4.1 μM CaCl2, pH 7,6 . </li><li> Ottenere embrioni di Xenopus laevis dalla fecondazione in vitro . <ol><li> Indurre l&#39;ovulazione nelle rane africane africane adulte ( Xenopus laevis) mediante iniezione con gonadotropina sierica di mare incinta una settimana (60 UI) e 12 h (500 UI) prima della posa dell&#39;uovo. </li><li> Raccogliere oociti e fertilizzarli in vitro con testicoli maschi omogeneizzati. </li><li> RaiSe embrioni in 0,1x MBS a 16 - 18 ° C. Stabilire gli embrioni secondo la tabella Normale di Xenopus laevis 14 . Prestate attenzione nella scelta di embrioni interi e vivi per l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol></li><li> Zebrafish embrioni NOTA: Gli embrioni possono essere sollevati e mantenuti secondo l&#39;impianto di animale e di laboratorio. Qui viene descritto un esempio della manutenzione animale. <ol><li> Preparare il medium embrionale: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4 e 0,00001% blu metilene. </li><li> Mantenere e generare il ceppo WT AB Danio rerio a 26,5 ° C. </li><li> Raccogliere gli embrioni alla mattina della fecondazione, sollevare fino a 4 giorni dalla fecondazione (dpf) a 28 ° C in mezzo ad embrione preparato come sopra descritto, selezionare e mettere come descritto in precedenza 15 . </li></ol></li></ol> 2. Induzione dell&#39;ipossia in vivo </p&gt; <ol><li> Costruzione della camera di incubazione del gas <ol><li> Utilizzare un serbatoio acquatico riproduttore ( Figura 1A ) che normalmente è utilizzato nella struttura dei pesci per la costruzione di camere ipossiche. Questo serbatoio dovrebbe montare una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Preparare una piastra a 24 pozzetti in mesh, come illustrato nella figura 1 . Rimuovere il fondo in plastica della piastra a 24 pozzetti ( figura 1B ), ad es ., Utilizzando una macchina di fresatura a tale scopo. </li><li> Riempire lo spazio tra la plastica dei pozzetti e le pareti della lastra con resina epossidica. Fissare il filtro in nylon ( Figura 1C ) con un diametro della maglia di 0,1-0,2 mm sulla plastica rivestita in resina e lasciare che la piastra sia completamente asciutta. </li><li> Una volta asciutta, trapano tre o quattro gallerie ( Figura 1D ) di lunghezza 10 mm e diametro 5 mm nelle pareti di piastre rivestite in resina e in rete. Collegare barre di plastica o teflon( Figura 1E ) di diametro appropriato e lunghezza 30 mm alle gallerie e posizionare la piastra nel serbatoio di scelta. </li><li> Posizionare la piastra a 24 pozzetti in fondo alla rete nel serbatoio acquatico di scelta. Utilizzando tubi in silicone ( Figura 1F ), collegare un serbatoio a gas ( Figura 1G ) con la miscela O 2 / N 2 desiderata o un&#39;altra miscela di gas scelta a una valvola di distribuzione ( Figura 1H ) utilizzando un appropriato regolatore del gas (I) (BOC 200 bar). Qui si utilizzano serbatoi a gas contenenti una miscela di ossigeno al 5% e 95% N 2 negli esperimenti di ipossia qui presentati. </li><li> Regolare la portata dell&#39;ossigeno nel mezzo della camera a 0,0017-0,0019 metri cubi al secondo. In questa portata di gas, non si deve vedere alcun disturbo del mezzo nei pozzetti della piastra. <ol><li> A tale scopo utilizzare il regolatore a gas a due stadi ad alta purezza. Impostare il regolatore per ridurre la pressione interna di th(1000 - 2500 PSI) ad una pressione di consegna di 10 PSI durante l&#39;esperimento. Pertanto, in conformità alle specifiche di questo regolatore di gas, è stata raggiunta una portata pari a 0,00189 metri cubi al secondo durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Collegare il tubo in silicone e la valvola di distribuzione a un diffusore a disco in ceramica ( figura 1J ) all&#39;interno del serbatoio acquatico. Chiudere il serbatoio acquatico e sigillare con cura il coperchio, rivestendolo con grasso in silicone ( Figura 1K ) (confronta con la Figura 1 ). Se è necessaria una particolare temperatura non-ambiente, posizionare la camera ipossica in un incubatore di laboratorio di temperatura desiderata. </li><li> A seconda del tipo di embrioni utilizzati nell&#39;esperimento, riempire il serbatoio della camera ipossica con l&#39;apposito mezzo embrionale e iniziare a diffondere la miscela di gas attraverso il diffusore a disco in ceramica. Equilibrare per 10-15 min. </li><li> Dopo l&#39;equilibratura con la thE la miscela di ossigeno desiderata, misurare la concentrazione di ossigeno nell&#39;acqua usando una sonda ossimetrica o ossigeno. A questo scopo, utilizzare un ossimetro con l&#39;ossigeno disciolto e il sensore di temperatura in fibra ottica. </li></ol></li><li> Induzione di ipossia negli embrioni <ol><li> Selezionare con cura gli embrioni per l&#39;esperimento, utilizzare embrioni interi e vivi per l&#39;incubazione dell&#39;ipossia. Qui, noi embrioni di rana dello stadio 38 o zebrafish embrioni 4 dpf negli esperimenti presentati qui. </li><li> Posizionare i piatti di embrione nell&#39;incubatrice ( Figura 1K ) contenente la camera di incubazione del gas e lasciarli equilibrare alla temperatura dell&#39;incubatore. </li><li> Trasferire con cura gli embrioni nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti ( fig. 1B ) della camera di incubazione del gas, utilizzando una pipetta di plastica. Utilizzare sempre una pipetta di plastica per il trasferimento di embrioni durante tutto il protocollo. NOTA: ogni pozzetto di questa piastra può contenere in suA 5 embrioni di rana dello stadio 38 o fino a 7 embrioni di zebrafish di 4 dpf. Etichettare con attenzione i pozzetti se usi genotipi diversi. </li><li> Mantenere la camera di incubazione del gas sotto un&#39;infusione costante con la miscela di gas di scelta per 5 ore o per un tempo più lungo che si adatta all&#39;esperimento. Utilizzare una miscela di 5% O 2 e 95% N 2 qui. </li><li> Trasferire con cura gli embrioni dalla camera di incubazione del gas nel mezzo normossico corrispondente al tipo di embrione e procedere immediatamente con i passaggi 3 o 4. </li><li> Se è necessario un ulteriore trattamento normossico, trasferire con cura gli embrioni nel mezzo normoxico corrispondente al tipo di embrione. </li></ol></li></ol> 3. Controllo dell&#39;insufficienza di ipossia attraverso monitoraggio dei livelli HIF-1α <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare la soluzione 0,4 mg / mL di MS222 in 0,1 x MBS. </li><li> Preparare il tampone di omogeneizzazione: Acquistare il buffer di analisi della radioimmunoprecipitazione (RIPA bUffer) per l&#39;omogeneizzazione del tessuto e integrare la quantità di tampone necessaria per l&#39;esperimento con l&#39;inibitore della proteasi ad una concentrazione finale di 1: 100 v / v. </li><li> Preparare soluzioni per Western blot. <ol><li> Preparare il tampone di carico del gel di Laemmli 4x: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glicerolo, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-mercaptoetanolo, 0,5% w / v Bromofenolo blu, 10 ml volume totale ddH2 O. </li><li> Preparare il tampone di esercizio 5x: 15 g di base Trizma, 72 g di Glicina, 5 g di SDS, 1 L di volume totale ddH 2 O. </li><li> Preparare il tampone di trasferimento: 2,66 g di base Trizma, 14,4 g di glicina, 200 ml di metanolo al 100%, volume totale di 1 L ddH 2 O. </li><li> Preparare 10 volte TBST: 5 mL di 1 M Tris pH 8,0, 30 mL di 5M NaCl, 2,5 mL Tween 20, 1 L volume totale H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione di blocco: 4% in peso di latte scremato in polvere in 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Raccolta di tessuti <ol><li> Anestetizzare gli embrioni bagnando in soluzione 0,4 mg / mL MS22216 , 17 e trasferirli in un tubo di reazione di plastica riempito con tampone di omogeneizzazione usando una pipetta di plastica. Usare 20 μL di tampone per embrione. Si noti che almeno 5 embrioni di rana dello stadio 38 o 7 embrioni zebrafish di 4 dpf sono necessari per determinare una significativa modifica dei livelli di proteine ​​HIF1α. </li><li> Omogeneizzare il tessuto utilizzando un appropriato omogeneizzatore di tessuti o un sonicatore. Rimuovere i detriti per centrifugazione (15 min; 13.000 xg; 4 ° C). <ol><li> In alternativa, dissectare le retine dagli embrioni rana anestetizzati 17 e omogeneizzare come sopra. Utilizzare 20 μl di tampone di omogeneizzazione per 10 retine. </li></ol></li><li> Portare il surnatante usando una pipetta denaturandola a 85 ° C per 5 min e completare il tampone di carico del gel di Laemmli fino a una concentrazione finale di 1x v / v ( ad esempio aggiungere 5 μl di tampone Laemmli 4x a 15 μl di homogenato). Usa questo supernatante per la WesO bloccare i campioni a -20 ° C. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Caricare i campioni preparati come descritto nella fase 3.2 su un gel prefabbricato del 12% in un sistema di elettroforesi usando un tampone di rotazione di 1x v / v. Utilizzare una scala proteica per determinare la dimensione delle proteine. Trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa (membrana da 0,45 μm) nel tampone di trasferimento per 1 ora imballata su ghiaccio a 4 ° C, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Bloccare siti di associazione non specifici che incubicano la membrana nel buffer di blocco per 60 min. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST. </li><li> Incubare la membrana in soluzione di anticorpi anti-HIF-1α coniglio e anti-α-tubulina del mouse, diluiti rispettivamente 1: 100 v / v e 1: 5000 v / v nella soluzione di blocco, per 2,5 h alla RT. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST. </li><li> Per il rilevamento, incubare negli anticorpi coniugati HRP con anti-coniglio e capra anti-topo diluiti 1: 1000 v / v nella soluzione di blocco per 1 h.Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST e visualizzare la colorazione HRP usando un kit commerciale e una macchina sviluppatrice di scelta. </li><li> Quantificare la quantità di proteina HIF1α usando la quantificazione digitale. </li></ol></li></ol> 4. Monitoraggio della proliferazione cellulare in ipossia <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare una soluzione di 5 mM EdU nel mezzo di embrione di scelta. La soluzione può essere utilizzata immediatamente o in aliquota e conservata a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. </li><li> Preparare la salina fosfata-bufferizzata (PBS) o acquistare PBS da risorse commerciali. Autoclave per 10 minuti a 115 ° C. </li><li> Preparare soluzioni per la rilevazione dell&#39;incoronazione di EdU. <ol><li> Preparare la soluzione di fissazione: 4% v / v del 16% Soluzione di formaldeide in PBS. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio: 30% in peso di saccarosio in PBS. </li><li> Preparare PBST: 0,1% v / v Triton X-100 in PBS. </li><li> Preparare la soluzione di blocco: 10% v / v Serum di capra inattivato termicamente (HIGS) in PBST. </li><li> Preparare la soluzione DAPI: 1: 1000 v / v 4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Incubazione di embrioni in ipossia per l&#39;incorporazione di EdU <ol><li> Riempire la camera di incubazione del gas con 400-500 ml di soluzione di 5 mM EdU integrata con 1% v / v DMSO. Pre-equilibrare la soluzione con la stessa miscela di gas utilizzata nell&#39;esperimento per 15 minuti prima dell&#39;esperimento. Si noti che il volume della soluzione di incubazione può essere minimizzato mediante l&#39;aggiunta di aste più corte ( figura 1E ) alla piastra inferiore della rete. </li><li> Collegare il tubo del gas al cilindro di gas contenente una miscela di gas di 5% O 2 e 95% N 2 . Incubare la soluzione per 15 minuti. </li><li> Trasferire gli embrioni nella camera ipossica, distribuendole uniformemente tra i pozzetti e incubare per 2 ore. Ogni pozzetto può ospitare fino a 5 embrioni di rana dello stadio 38 o fino a 7 embrioni zebrafish 4 dpf. </li><li> Analizzare l&#39;embrioneS per l&#39;incorporazione di EdU. </li></ol></li><li> Corso di tempo dell&#39;incubazione embrionale in ipossia e incorporazione di EdU <ol><li> Riempire la camera di incubazione del gas con 500 ml di mezzo di embrione di scelta. Collegare la tubazione del gas al cilindro del gas contenente una miscela di gas del 5% O 2 e 95% N 2 e bilanciare il mezzo con la miscela di gas per 15 minuti. </li><li> Trasferire gli embrioni nella camera ipossica, distribuendole uniformemente tra i pozzetti e incubare per il periodo di tempo desiderato fino a 48 h. Negli ultimi 1 h, sostituire il mezzo embrionale con 5 mM EdU soluzione integrata con 1% v / v DMSO. </li><li> Trasferisci gli embrioni al piatto normoxico e analizza per l&#39;incorporazione di EdU. </li></ol></li><li> Rilevamento ed analisi di incorporazione di EdU <ol><li> Anestetizzare gli embrioni bagnando in soluzione 0,4 mg / mL MS222. </li><li> Trasferire gli embrioni in un appropriato flaconcino di vetro e fissarlo incubando in soluzione di Fissaggio per 2 haT RT o O / N a 4 ° C. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in PBS. Trasferire con cura gli embrioni alla soluzione di saccarosio per la criocorrosione dei tessuti. Incubare per 4 ore o fino a che gli embrioni non si affondano sul fondo della fiala di vetro. </li><li> Incorporare gli embrioni nel mezzo incorporante (composto ottimale della temperatura di taglio). Bloccare i blocchi con embrioni immediatamente o conservare fino a 14 giorni a -80 ° C. </li><li> Cryosection i blocchi contenenti embrioni usando un cryostat. Raccogli le sezioni di 12 μm (embrioni di zebrafish) o 16 μm (embrioni di rana) sulle vetrini del microscopio e lasciar asciugare. Crioconduttori di processo immediatamente o conservare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. </li><li> Rileva l&#39;incorporazione di EdU mediante la colorazione immunofluorescenti usando un kit di chimica commerciale. Preparare la quantità di EdU Reaction Mix necessaria per il numero di criose nell&#39;esperimento, come descritto dal produttore. <ol><li> Per 500 μL di EdU Reaction Mix, utilizzare 430 μl di 1X EdU buffer di reazione, 20 μl di CuSO 4 , 1,2 μL di Alexa Fluor azide, 50 μl di additivo 1 X EdU tampone. </li></ol></li><li> Lavare le criose una volta con PBS per rimuovere il mezzo di incorporazione e 3 x 5 min con PBST per permeabilizzare il tessuto. Incubare le criose nella soluzione di blocco per 30 min. </li><li> Incubare le criose con la EdU Reaction Mix per 1 h e seguire 3 volte 10 minuti di lavaggio in PBST. Conservare le criose con soluzione DAPI per 15 minuti, seguite da 3 x 10 min di lavaggio in PBST. Montare le diapositive con criose colorate in un supporto di montaggio, coprire con coperchio e lasciare asciugare prima di analizzare sotto un microscopio fluorescente o conservare a 4 ° C per un periodo di 1 anno. </li><li> Analizzare le criose con la colorazione anti-EdU sotto un microscopio di scansione confocale invertito e determinare il numero di cellule EdU-positive utilizzando la quantificazione digitale. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui abbiamo presentato un nuovo metodo semplice ma robusto per indurre l&#39;ipossia che è regolato per l&#39;uso con embrioni di rana e zebrafish, ma può anche essere adatto ad altri organismi acquatici. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella semplicità e nell&#39;efficienza dei costi. Tuttavia, i risultati ottenuti con questo metodo sono molto robusti. Abbiamo dimostrato che l&#39;ipossia può essere efficacemente indotta nella camera sia in embrioni interi che in tessuti specifici - qui, retinas. ...

La ricerca di ipossia ha numerose applicazioni. Questi includono indagare la patogenesi e sviluppare trattamenti per le condizioni mediche caratterizzate da ipossia 1 e malattia acuta di alta altitudine 2 . Lo stress ipossico provoca importanti cambiamenti metabolici in tutti gli organismi che richiedono ossigeno. Lo stress ipossico influenza anche la crescita fetale e lo sviluppo e la patogenesi di diverse malattie umane, inclusa la restrizione intrauterina della crescita 3 . Lo stress ipossico non può solo portare a ridurre il peso alla nascita, la mortalità fetale e neonatale, ma può anche provocare molte complicazioni nella vita adulta, come la malattia cardiovascolare, il diabete di tipo 2, l&#39;obesità e l&#39;ipertensione 4 . Lo stress ipossico è spesso osservato durante lo sviluppo del tumore solido, quando il tessuto tumorale supera la sua offerta di sangue. È quindi fondamentale poter studiare gli effetti dell&#39;ipossia in vivo e direttamente durante l&#39;embr<html> Lo sviluppo yonic. Tra i metodi più noti che sono stati utilizzati per studiare gli effetti dell&#39;ipossia durante lo sviluppo è l&#39;impiego di cloruro di cobalto nel mezzo di crescita o l&#39;incubazione dell&#39;organismo in una camera ipossica. La cloruro di cobalto induce artificialmente una reazione ipossidica alla normale concentrazione di ossigeno, a causa del suo ruolo nella stabilizzazione di alfa (HIF-1α) di fattore-1 indotta da ipossia, impedendo il degrado proteosomico 5 , 6 , 7 . Tuttavia, essendo un metodo conveniente 8 , l&#39;uso di cloruro di cobalto e altri simili mimetici di ipossia chimica possono avere effetti deleteri non specifici sulle cellule e sui tessuti, ad esempio l&#39; apoptosi 9 . Di conseguenza, le camere ipossiche sono un metodo migliore per l&#39;induzione di &quot;ipossia naturale&quot; negli organismi viventi attraverso il corso di uno sviluppo normale. Ntent &quot;&gt; Ci siamo concentrati sullo sviluppo di un sistema per l&#39;induzione di ipossia negli embrioni animali acquatici, sia le rane che gli zebrafish che sono diventati degli organismi modello vertebrati informativi per studi di numerosi processi biologici, nonché modelli per varie malattie umane. Sviluppare ulteriormente, eliminando la complicazione della compensazione materna Inoltre, un rapido sviluppo dello sviluppo consente di manipolare i fattori ambientali e di osservare i cambiamenti fenotipici nella formazione degli organi in tempo reale. Inoltre, molti componenti dei principali percorsi di trasduzione del segnale sono altamente conservati Questi organismi di modello sono stati caratterizzati in dettaglio da un ampio volume di letteratura. Il principale vantaggio nell&#39;uso delle rane e degli embrioni di zebrafish per studiare gli effetti dell&#39;ipossia sullo sviluppo del vertebrato è che tutti i processi possono essere monitorati direttamente, in quanto l&#39;ossigeno penetra rapidamente negli embrioni. Così, in rane e zebrafish, come in contrasto con altri organismi di modello comeEmbrioni di topi, l&#39;influenza di una specifica concentrazione di ossigeno può essere studiata nel tessuto di interesse, senza prendere in considerazione la presenza o la mancanza di vascolarizzazione funzionale. La maggior parte delle configurazioni commercialmente disponibili per l&#39;incubazione ipossica presenta lo svantaggio di essere comparabilmente grandi e avendo così elevati costi di funzionamento. Oltre al loro elevato costo iniziale e al consumo di gas, l&#39;equilibratura e la manutenzione di camere comuni di ipossia richiedono l&#39;assunzione di un&#39;atmosfera ipossica costante contro il gradiente del gas che si verifica naturalmente in queste camere a causa della loro dimensione e / o respiratorio dell&#39;organismo. Ciò richiede l&#39;impiego di ventilatori a gas e di un sistema di raffreddamento, che aumenta la quantità di apparecchiature necessarie aggiuntive, ostacola la destrezza del ricercatore e in generale diminuisce la semplicità della procedura sperimentale. Al contrario, l&#39;installazione che presentiamo qui è comparabilmente robusta ma molto conveniente, piccola, facile da stabilire e permette fL&#39;equilibratura del gas, l&#39;atmosfera ipossica stabile e lo scambio semplice di materiali e soluzioni all&#39;interno della camera. Il nostro sistema può essere utilizzato per l&#39;utilizzo con qualsiasi organismo di interesse acquatico. Abbiamo costruito una camera ipossica che è convenientemente piccola e quindi può essere collocata all&#39;interno di un incubatore di laboratorio comune, che consente facilmente le procedure sperimentali a qualsiasi temperatura specifica. Fornire un comodo controllo della temperatura e la concentrazione di ossigeno nel mezzo, il vantaggio del nostro sistema contro gli incubatori di ipossia commercialmente disponibili risiede nella sua ridotta dimensione e nell&#39;efficienza dei costi. Quindi, la nostra configurazione può essere creata usando le forniture di laboratorio disponibili per la maggior parte dei laboratori di ricerca e non richiedono materiali costosi. Inoltre, la nostra configurazione non genera calore, a differenza degli incubatori di ipossia commercialmente disponibili e consente l&#39;utilizzo a temperature inferiori alla temperatura ambiente in un incubatore. La laSt è particolarmente importante per il lavoro con organismi sangue freddi come rane e pesci dove i tassi di sviluppo e metabolismo sono fortemente dipendenti dalla temperatura. Essendo molto conveniente e facilmente costruito, la nostra camera di incubazione del gas è tuttavia molto versatile nella determinazione di diverse condizioni ipossiche o iperossiche, oltre a consentire una gestione rapida e facile di diversi supporti e soluzioni per un vasto numero di condizioni sperimentali. Inoltre, impiegando una piastra a 24 pozzetti invece di piatti comunemente usati o serbatoi di laboratorio 10 , 11 , 12 , il nostro sistema consente di osservare e sperimentare contemporaneamente diverse condizioni mutanti. Per controllare la corretta induzione dell&#39;ipossia, abbiamo monitorato i livelli della proteina HIF-1α mediante la rilevazione Western blot. Inoltre, il numero di cellule proliferanti prima e dopo l&#39;incubazioneN nella camera ipossica può essere utilizzato per determinare se l&#39;ipossia è stata indotta nel tessuto. Questo metodo si basa sui nostri risultati pubblicati in precedenza 13 , mostrando che la proliferazione nella nicchia delle cellule staminali del retino embrionale diminuisce dopo l&#39;induzione dell&#39;ipossia. Così abbiamo monitorato il livello della proliferazione delle cellule staminali retiniche aggiungendo l&#39;5-etinil-2&#39;-deoxyuridine (EdU) al mezzo embrionale e misurando la sua incorporazione nel DNA delle cellule appena proliferanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;">NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:167px;">KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td style="width:167px;">NaHCO3 / 0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;">0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td style="width:167px;">MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Calcium nitrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">202967</td>
			<td style="width:167px;">Ca (NO3)2 / 0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:167px;">CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9140</td>
			<td style="width:167px;">Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Pregnant mare serum gonadotropin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10</td>
			<td style="width:167px;">frog fertilization</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Zebrafish breeding tank</td>
			<td style="width:71px;">Carolina</td>
			<td style="width:119px;">161937</td>
			<td style="width:167px;">gas chamber construction</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">142475</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epoxy resin</td>
			<td style="width:71px;">RS Components UK</td>
			<td style="width:119px;">Kit 199-1468</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gas distributor valve</td>
			<td style="width:71px;">WPI Luer Valves</td>
			<td style="width:119px;">Kit 14011</td>
			<td style="width:167px;">aquatic tank attachment (Schema 1, H)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">High precision gas valve</td>
			<td style="width:71px;">BOC&#160;</td>
			<td style="width:119px;">200 bar HiQ C106X/2B</td>
			<td style="width:167px;">gas tank attachment (Schema 1, I)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">5% oxygen and 95% N2 gas tank</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;">226686-L</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic gas mixture</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">ceramic disc diffuser</td>
			<td style="width:71px;">CO2 Art&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td>
			<td style="width:167px;">Schema 1, J</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">silicone grease</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">VAC1100</td>
			<td style="width:167px;">Schema 1, K</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">oxymeter</td>
			<td style="width:71px;">Oxford Optronix&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Oxylite, CP/022/001</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic chamber setup</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">fibre-optic dissolved oxygen sensor</td>
			<td style="width:71px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:119px;">HL_BF/OT/E</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic chamber setup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">plastic pasteur pipette</td>
			<td style="width:71px;">Sterilin</td>
			<td>STS3855604D</td>
			<td style="width:167px;">for embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MS222&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:167px;">embryo anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RIPA buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278-50ML</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Protease inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer, 10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;">SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">beta-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td style="width:167px;">5X Running buffer, Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:167px;">5X Running buffer, Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860</td>
			<td style="width:167px;">Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2287-500ML</td>
			<td style="width:167px;">10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">skim milk powder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td style="width:167px;">Blocking Solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T9661</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">tissue homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">Pellet Pestle Motor Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">pellet pestles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">precast 12% gel</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Biorad</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Mini-ProteinTGX, 456-1043</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">protein ladder</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Amersham</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">nitrocellulose membrane (0.45 &#181;m)</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">anti-HIF-1&#945; antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab2185</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6074</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6789</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97080</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Pierce ECL 2 reagent&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">ECL films Hyperfilm</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Amersham</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine &#160;</td>
			<td style="width:71px;">santa cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS&#160;61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;">EdU, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">BR0014G</td>
			<td style="width:167px;">1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:167px;">Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">S/8600/60</td>
			<td style="width:167px;">Solution solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284-500ML</td>
			<td style="width:167px;">PBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Heat-inactivated Goat Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6767-100ml</td>
			<td style="width:167px;">HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;">DAPI, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C10338</td>
			<td style="width:167px;">DMSO, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass vial</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">98178853</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4563</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium, EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">cryostat Jung Fridgocut 2800E</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3035S</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">J1800AMNZ</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">EdU Click-iT chemistry kit</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C10338</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FluorSave</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">D00170200</td>
			<td style="width:167px;">mounting medium, EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">coverslips</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">fluorescent microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse 80i</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">confocal scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Volocity software</td>
			<td style="width:71px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">Volocity 6.3</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Qui introduciamo un nuovo sistema per l&#39;induzione di ipossia, che abbiamo sviluppato per studiare gli effetti dell&#39;ipossia negli organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema comprende una camera con una semplice configurazione che è tuttavia robusta per indurre e mantenere una specifica concentrazione e temperatura di ossigeno in qualsiasi soluzione sperimentale di scelta. Il sistema presentato è molto efficace in termini di costi, ma altamente funzionale, permette l&#39;induzione e il sostegno di ipossia per esperimenti diretti in vivo e per vari periodi di tempo fino a 48 ore. Per monitorare e studiare gli effetti dell&#39;ipossia, abbiamo impiegato due metodi: la misura dei livelli di fattore 1alpha (HIF-1α) inducibile all&#39;ipossia in embrioni interi o nei tessuti specifici e la determinazione della proliferazione delle cellule staminali retiniche mediante 5-etinil-2&#39;- Deoxyuridine (EdU) nel DNA. I livelli HIF-1α possono servire da indicatore di ipossia generale in tutto l&#39;embrione o il tessutoDi scelta, qui retina embrionale. L&#39;incorporazione di EdU nelle cellule proliferanti della retina embrionale è un&#39;uscita specifica dell&#39;induzione di ipossia. Così abbiamo dimostrato che i progenitori ematici retinici ipossici diminuiscono la proliferazione entro 1 ora di incubazione sotto il 5% di ossigeno di entrambi gli embrioni di rana e zebrafish. Una volta acquisita, la nostra configurazione può essere impiegata per l&#39;utilizzo con piccoli organismi del modello acquatico, per esperimenti diretti in vivo , in un determinato periodo di tempo e in concentrazione normale o ipossidica o iperossica o sotto qualsiasi altra miscela di gas.

L&#39;impiego del sistema ipossidico a camera che presentiamo consente di studiare gli effetti dell&#39;ipossia individualmente e in vivo in tutti gli animali vivi. L&#39;ipossia può essere indotta mettendo interi rana o zebrafish nella camera ipossica ( Figura 1 ) e intraprendere diverse combinazioni di condizioni. Un&#39;immagine della nostra configurazione camera a gas completata è mostrata in Figura 2 . Abbiamo mo...

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Introduciamo un nuovo sistema di camera ipossia per uso con organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema è semplice, robusto, conveniente e consente l&#39;induzione e la suscettibilità di ipossia in vivo e fino a 48 ore. Presentiamo 2 metodi riproducibili per monitorare l&#39;efficacia dell&#39;ipossia.

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Views.  University of Cambridge.  Introduciamo un nuovo sistema di camera ipossia per uso con organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema è semplice, robusto, conveniente e consente l'induzione e la suscettibilità di ipossia in vivo e fino a 48 ore. Presentiamo 2 metodi riproducibili per monitorare l'efficacia dell'ipossia. 

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...