La linea cellulare P19 è nota per differenziarsi in neuroni. Tuttavia, il protocollo per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 è talvolta complicato. Questo metodo ci consente di eseguire l'esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere la possibilità di utilizzare la linea cellulare P19 per il futuro.
Per iniziare, mantenere le cellule P19 nel mezzo di manutenzione, composto da DMEM, con 4,5 grammi per litro di glucosio, integrato con siero bovino fetale al 10%, 100 unità per penicillina millilitro e 100 unità per streptomicina millilitro. Incubare la coltura cellulare in un ambiente di 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule non sono circa l'80% confluenti. Rimuovere il mezzo trascorso dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con due millilitri di calcio e PBS privo di magnesio.
Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside-EDTA per coprire completamente il monostrato delle cellule e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due o tre minuti. Al microscopio, verificare se tutte le cellule sono staccate. Rimorsiva le cellule in nove millilitri di mezzo di manutenzione per neutralizzare la tripina.
Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti per pellettare le cellule. Quindi, aspirare il supernatante senza disturbare il pellet. Resuspend il pellet in 10 millilitri di mezzo di manutenzione fresco e utilizzare un contatore di celle per determinare il numero di cella secondo le istruzioni del produttore.
Seme 20.000 cellule per centimetro quadrato in un nuovo pallone T-25 e aggiungere fino a 10 millilitri di mezzo di manutenzione. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due o tre giorni. Per iniziare la digestione della tripsina, prima aspira lentamente il supernatante e lava le cellule con due millilitri di PBS privo di calcio e magnesio.
Quindi, aggiungere un millilitro dello 0,25% di EDTA di tripside alle cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o tre minuti. Dopo l'incubazione, per neutralizzare la tripparina, rimescolare le cellule in nove millilitri di mezzo di differenziazione, composto da DMEM ad alto livello di glucosio e integrato con il 5% di siero bovino fetale, 100 unità per millilitro penicillina e 100 unità per millilitro streptomicina. Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti per pellettare le cellule.
Quindi, aspirare lentamente il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di mezzo di differenziazione fresco senza RA. Utilizzare un contatore di celle per determinare il numero di cella in base alle istruzioni del produttore. Per la generazione aggregata, iniziare aggiungendo 10 millilitri di mezzo di differenziazione, integrati con cinque microlitri di RA a un piatto di coltura non trattato da 100 millilitri. Semina un milione di cellule nel piatto di coltura e incuba a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per due giorni al fine di promuovere la formazione aggregata.
Dopo l'incubazione, con una pipetta da 10 millilitri, aspirare il mezzo contenente gli aggregati e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri a temperatura ambiente. Attendere 1,5 minuti affinché gli aggregati si sistemino sul fondo e poi scartano il supernatante. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di differenziazione fresco integrato con RA micromolare 0,5. Seminare delicatamente gli aggregati in un nuovo piatto da coltura non trattato da 100 millimetri e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due giorni.
Per iniziare, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire gli aggregati cellulari in un tubo da 15 millilitri. Attendere 1,5 minuti a temperatura ambiente affinché gli aggregati si sistemino sul fondo e quindi scartare il supernatante. Lavare gli aggregati con siero e DMEM privo di antibiotici.
Attendere che gli aggregati cellulari si sistemino nella parte inferiore, scartare il supernatante e aggiungere due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti, toccando ogni due minuti per mantenere le cellule in sospensione. Quindi, aggiungere quattro millilitri di mezzo di manutenzione per interrompere l'attività della tripina e pipettare su e giù 20 volte utilizzando una pipetta da un millilitro.
Infine, centrifugare le cellule a 200 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di manutenzione. Utilizzare un contatore di cella per determinare il numero di cella e procedere con la placcatura delle celle.
Per piastrere le celle, aggiungere prima tre millilitri per pozzo di mezzo di manutenzione a una piastra di coltura a sei pozzi. Quindi, seminare le cellule ad una densità di 500.000 per pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Seminare le cellule su bicchieri di copertura in un piatto di coltura a sei pozzi. Quando raggiungono il 20% di confluenza, procedere all'immunostaining con anticorpo Anti-MAP2. Quindi, isolare l'RNA ed eseguire la trascrizione inversa PCR per MAP2, NueN, OCT4, NANOG e gapdh.
In questo studio viene introdotto un metodo semplificato per la differenziazione neuronale. La linea cellulare P19 è coltivata in un piatto di coltura non trattato con RA 5%FBS e 0,5 micromolare. Dopo quattro giorni, gli aggregati cellulari vengono dissociati con tripina e seminati su una piastra di coltura cellulare aderente per i prossimi quattro giorni. L'efficienza di questo metodo viene valutata dal confronto tra l'analisi RTPCR della linea cellulare P19 in uno stato indifferenziato e durante la neurogenesi.
I risultati mostrano una rapida diminuzione dell'espressione di geni a pluripotenza, come Oct4 e NANOG, e l'upregolazione di geni marcatori neurnomi, come MAP2 e NeuN. Crediamo che il metodo sviluppato in questo studio sia semplice e svolgerà un ruolo nello chiarire i meccanismi molecolari della neurogenesi, così come le malattie neurodegenerative.
