Name: measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay
Uploaded: 2016-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
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This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Tutti i virus reassortant dal vivo con i componenti aviarie devono essere maneggiati con livello di biosicurezza 2 (BSL2) pratiche -Enhanced in un laboratorio approvato per l&#39;uso da parte del Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e il comitato di biosicurezza istituzionale. 1. Preparazione dei reagenti e materiale di partenza Nota: fare riferimento alla tabella materiali per ottenere la fonte di tutti i reagenti. <ol><li> Piastre Fetuina rivestite <ol><li> Preparare tampone di rivestimento mescolando 10 ml 10x tampone di rivestimento con 90 ml di H 2 O. deionizzata </li><li> Preparare una soluzione stock di Fetuina a 25 mg / ml in tampone di rivestimento 1x e conservare in 500 microlitri aliquote a -20 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di fetuina (25 mg / ml) immediatamente prima di lastre di verniciatura diluendo la soluzione madre 1.000 volte in 1x tampone di rivestimento. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 ml di soluzione di lavoro di fetuina in all pozzetti di una piastra a 96 pozzetti che ha alta capacità di legame con le proteine. </li><li> Coprire ogni piatto con un sigillante piatto poi impilare le piastre in gruppi di 10 e avvolgerli in carta stagnola. </li><li> Posizionare le piastre in frigorifero (2-8 ° C) per almeno 18 ore prima di eseguire un test. Nota: Le piastre possono essere rivestite in anticipo e memorizzati con la soluzione di rivestimento a 2-8 ° C per 2 mesi. </li></ol></li><li> diluenti <ol><li> Per preparare il diluente per fare dei virus e dei campioni diluizioni (2- (N -morpholino) di acido etansolfonico (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl 2, 1% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,5% Tween 20), mescolare 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 con 2 ml di CaCl 2 (10 mg / ml), 3,3 ml di 30% di BSA e 0,5 ml di Tween 20. </li><li> Per preparare il diluente per PNA-HRPO (MES, pH 6,5 con 20 mM CaCl 2 e 1% BSA), miscela 94.7 ml 1x MES, pH 6,5 con 2 ml di CaCl 2 (10 mg / ml) e 3,3 ml di 30% BSA . </li></ol></li><li> Neuraminidasi (NA) Nota: H6Nx reass virusortants (questi hanno HA di H6 sottotipo e la NA di interesse), sono generati seguenti metodi pubblicati 5,10. Richiedi fiale di virus reassortant inattivato da un collaboratore se non sono disponibili in-house. Quando si utilizza il virus inattivato, confermare che la preparazione è adatto per l&#39;uso in ELLA attraverso la dimostrazione che il processo di inattivazione non ha avuto un impatto significativo sull&#39;attività NA. <ol><li> Culture uno stock di virus H6Nx in uova di gallina embrionate 11 e memorizzare 0,5 ml aliquote di liquido allantoico ordinata a -80 ° C. </li><li> Utilizzare una nuova aliquota di virus per ogni test. Non congelare e scongelare le aliquote. </li></ol></li><li> I campioni di siero e Controlli <ol><li> Calore inattivare tutti i sieri (campioni di prova ad esempio, sieri pre e post-vaccinazione, così come i comandi, ad esempio, campioni con nota NI titolo) in un bagno di acqua a 56 ° C per 45-60 min. Conservare i sieri da -20 a -70 ° C prima o dopo il trattamento termico. Se la SAMPles devono essere testati più volte, fare diverse aliquote prima del congelamento in modo che il campione non è più volte congelati e scongelati. </li><li> Utilizzare il ELLA per misurare i titoli NI di sieri umani che sono disponibili in quantità sufficiente (&gt; 5 ml) per identificare almeno uno con basso titolo e un altro con un alto titolo. Conservare aliquote di 100 microlitri come ≤-20 ° C in modo che lo stesso campione può essere utilizzato come controllo in molti saggi per monitorare le prestazioni del dosaggio. </li></ol></li><li> Peanut Agglutinina (PNA) -Horseradish perossidasi (HRPO) <ol><li> Preparare il diluente PNA-HRPO (MES, pH 6,5 con CaCl 2 e 1% BSA). </li><li> Preparare una soluzione stock PNA-HRPO sciogliendo 1 mg di PNA-HRPO in 1 ml di diluente. Conservare 20-200 aliquote microlitri a -20 ° C. </li><li> Prima di utilizzare un nuovo lotto PNA-HRPO, test 1: 500, 1: 750, 1: 1.000 e 1: 2000 diluizioni di questo reagente per identificare la quantità che determina OD massima con il controllo positivo (solo virus) e uno sfondo ( nessun virus) tcappello è &lt;10% del segnale positivo. <ol><li> Fare diluizioni virus quadruplicato come descritto nel paragrafo 2.1. </li><li> Trasferire le diluizioni ad una piastra Fetuina rivestita come descritto nella sezione 2.2 e incubare la piastra a 37 ° C. </li><li> Lavare la piastra 16-18 hr tardi e aggiungere 1: 500, 1: 750, 1: 1.000 e 1: 2.000 diluizioni di PNA-HRPO (100 microlitri / pozzetto) per duplicare le righe della piastra. </li><li> Completare il test come descritto nei punti 2.3.4 a 2.3.9. </li><li> Esamina i dati per selezionare la diluizione che ha provocato un segnale massimo che è&gt; 10 volte precedenti. </li></ol></li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare la diluizione ottimale del PNA-HRPO identificate in 1.5.3. </li></ol></li><li> Preparare un grande volume di tampone di lavaggio (0,01 M tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare il substrato perossidasi (o-Fenilendiammina dicloridrato (OPD)): Nota: substrati perossidasi alternative come 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB), può essere utilizzato <ol><li> Preparare tampone fosfato-citrato sciogliendo 1 capsula in 100 ml dH 2 O del giorno di dosaggio. </li><li> Sciogliere 1 OPD compresse (10 mg) in 20 ml di tampone fosfato-citrato immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di arresto (1 NH 2 SO 4): aggiungere 27,2 ml di 98% H 2 SO 4-973 ml dH 2 O. Mescolare e poi conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Determinazione dell&#39;importo di NA da utilizzare in ELLA <ol><li> Preparare diluizioni virus in un 96-pozzetti <ol><li> Dispensare 120 microlitri del campione diluente (punto 1.2) in colonne 1-11 della piastra di diluizione. </li><li> Per la colonna 1, aggiungere un ulteriore 96 ml diluente campioni. </li><li> Scongelare e poi vortice la fiala di virus prima di aggiungere 24 ml nei pozzetti duplicati nella colonna 1. Questo dà una diluizione 1:10 di virus. </li><li> Effettuare diluizioni seriali 2-fold di virus nel diluente campioni, trasferendo120 ml da un bene per i prossimi utilizzando puntali puliti per ogni diluizione. </li></ol></li><li> Trasferimento diluizioni Virus ad una piastra Fetuina rivestite <ol><li> Lavare le Fetuina rivestite piastra 3 volte con PBS-T (sezione 1.6) e poi cancellare ogni piatto sul tovagliolo di carta assorbente per eliminare qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluente per campioni (punto 1.2.1) per ciascun bene nelle colonne da 1 a 11 della piastra Fetuina rivestita. </li><li> Aggiungere 100 ml di diluente campioni di colonna 12 (questi pozzi sono il controllo negativo). </li><li> Trasferimento 50 ml di virus diluito da colonne 1-11 della piastra di diluizione ai corrispondenti pozzetti della piastra Fetuina rivestita. </li><li> Coprire la piastra con un sigillante piatto e poi metterlo in un incubatore umidificato a 37 ° C. </li><li> Prendere nota del momento in cui verranno eseguiti passaggi rimanenti (16-18 ore più tardi). </li></ol></li><li> Completa la Determinazione NA <ol><li> Quando l&#39;incubazione è completa (16-18 ore), trasferire ilpiatto al banco e rimuovere la pellicola sigillante. </li><li> Lavare la piastra 6 volte con PBS-T (sezione 1.7) e poi invertito e pacca sulla carta assorbente per garantire tutto il liquido è stato rimosso dai pozzetti. </li><li> Aggiungere 100 ml / pozzetto soluzione PNA-HRPO (alla diluizione determinato 1.5.3) a tutti i pozzetti e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Meno di 15 minuti prima dell&#39;incubazione alla fine, preparare la soluzione OPD come descritto nella sezione 1.7. </li><li> Lavare le piastre di prova per 3 volte per rimuovere il PNA-HRPO e asciugare prima di aggiungere 100 ml di substrato OPD in ogni pozzetto. </li><li> Incubare la piastra per esattamente 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 100 ml / pozzetto di acido solforico 1N. </li><li> Utilizzare un lettore di piastre per misurare la densità ottica (OD) a 490 nm per 0,1 sec. </li><li> Salvare ed esportare tutti i file di dati. </li></ol></li><li> Selezionare la diluizione Virus che verrà utilizzato per gli esami sierologici <ol><li> Disegnare un grafico che traccia OD 490nm </sub&gt; valori ad ogni diluizione virus. Controllare la curva di titolazione per identificare il segnale massimo (questo è solitamente il segnale che corrisponde ad un plateau all&#39;inizio della curva di titolazione), il segnale minimo (pozzetti che contengono nessun virus nella colonna 12 della piastra di fornire il controllo di sfondo), e le diluizioni del virus che provocano OD proporzionale alla diluizione di ingresso (cioè, nella regione lineare della curva). </li><li> Selezionare la diluizione virus che dà circa il 90% del segnale massimo ed è all&#39;interno del range lineare. Verificare che la densità ottica a diluizione selezionato è almeno 10 volte maggiore del segnale di fondo. Utilizzare la diluizione virus selezionato per tutte le analisi che impiegano questo particolare virus magazzino. Nota: In alternativa, misurare l&#39;attività NA del virus e utilizzare ~ 15-20 μU NA attività / ml nel ELLA. </li></ol></li></ol> 3. Enzyme-linked lectina Assay Nota: Figura 2 shoWS l&#39;installazione delle piastre di diluizione e dosaggio. <ol><li> Fare diluizioni del campione <ol><li> Posizionare i campioni inattivati ​​al calore sul ghiaccio. Nota: 8 sieri diluibile in ciascuna piastra. </li><li> Per un set up utilizzando diluizioni a partire da 01:10 tutta la piastra, aggiungere 120 ml di diluente del campione a tutti i pozzetti nelle colonne 3-11. </li><li> Per colonna 2, aggiungere 216 ml di diluente del campione e 24 ml di ogni campione. Mescolare il campione nel pozzetto pipettando su e giù 3 volte e poi trasferire 120 microlitri nella colonna successiva. </li><li> Dopo aver cambiato le punte delle pipette, mescolare il contenuto del pozzo pipettando su e giù e poi trasferire 120 ml alla colonna successiva. </li><li> Ripetere il punto 3.1.4 fino a quando il campione è stato trasferito alla colonna 11 e le restanti 120 ml scartato. </li></ol></li><li> Aggiungere Campioni e Virus alla Piastra Fetuina rivestite <ol><li> Scongelare una fiala di virus, vortice e risospendere il virus nel diluente (punto 1.2) alla diluizione che è stato selezionato al passaggio 2.4.2. Preparare almeno 5 ml di virus per ogni piastra test. Mantenere il virus diluito in ghiaccio fino le piastre vengono lavate e campioni di siero sono stati aggiunti alla piastra. </li><li> Decidere il numero di lastre Fetuina rivestite che sono necessarie per il saggio (applicata in via generale 4 sieri per piastra). Lavare le Fetuina rivestite piastra 3 volte con PBS-T e poi capovolgere ogni piatto e asciugare su carta assorbente per eliminare l&#39;eccesso di tampone di lavaggio. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 50 ml di ogni controllo siero o diluizione del campione dalla piastra di diluizione in pozzetti duplicati nelle colonne 2-11. </li><li> Aggiungere 50 ml di virus diluito a tutti i pozzetti tranne per il controllo negativo (colonna 12). </li><li> Aggiungere 50 ml di diluente per campioni di pozzi nella colonna 1 e aggiungere 100 ml di diluente per campioni di colonna 12. </li><li> Coprire i pozzetti con un sigillante piatto e poi mescolare picchiettando delicatamente i lati del piatto o posizionare su un agitatore a velocità moderata per 10 sec. </li><li> Porre la piastra in una Humidifincubatore IED a 37 ° C per 16-18 ore. </li></ol></li><li> Aggiungere PNA-HRPO e completare il test come descritto nella sezione 2.3 </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Determinare la validità dei risultati del test <ol><li> Verificare che i valori di fondo (senza virus) sono meno del 10% del controllo positivo (virus e senza siero). </li><li> Verificare che i titoli del controllo corsa sieri a diversi dosaggi utilizzando le stesse condizioni si trovano a 2 volte del titolo mediana. </li><li> Verificare che le misure di densità ottica di pozzetti di controllo sono coerenti (≤20% diversi) e che le misurazioni OD di pozzetti del campione duplicato sono coerenti (≤10% diverso). </li><li> Determinare la causa principale dei risultati non validi e ripetere il test se i criteri di cui al 4.1.1, 4.1.2 o 4.1.3, non sono soddisfatte. Considerare i fattori presentati nella tabella 1 quando si cerca di risolvere i problemi. </li></ol></li><li> Assegnare un end-point Titer 50% <ol><li> Per ogni piatto saggio, subtract sfondo media (nessun antigene aggiunti ai pozzetti) da tutte le letture. </li><li> Calcolare la percentuale di inibizione ad ogni diluizione di siero con la formula: 100 x (virus OD solo controllo - campione di prova OD) / virus OD solo il controllo. </li><li> Identificare la diluizione più elevata che ha provocato almeno il 50% di inibizione del segnale massimo. </li><li> Relazione il reciproco di questa diluizione come end-point titolo 50%. Nota: Se il 50% di inibizione non è stato raggiunto in qualsiasi diluizione, il titolo è inferiore alla prima diluizione testata, ad esempio, &lt;10 quando 1:10 è la prima diluizione testata. </li></ol></li><li> Calcolare la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) <ol><li> Utilizzare quattro regressioni logistiche parametro per determinare la IC50 titolo come segue: sottrarre il fondo media da tutte le letture e poi trasferire i risultati di un programma che esegue l&#39;analisi di regressione. </li><li> Utilizzare regressione non lineare, con la massima impostataal virus controllano e il minimo impostato a zero, per determinare la diluizione che corrisponde esattamente il 50% di inibizione. </li><li> Segnala il reciproco di questa diluizione come IC50 titolo. </li></ol></li></ol>

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The authors have no conflicts of interest.

Il saggio lectina enzimatico è un metodo pratico per misurare NI titoli anticorpali nel siero. Sebbene ELLA stato descritto da Lambre et al., Nel 1990, la sua accettazione come un test sierologico standard è stato più recente, con numerosi laboratori che effettuano test per misurare NI titoli anticorpali di campioni clinici 12-16. Alcune modifiche possono essere apportate passi protocollo senza un grande impatto ai titoli NI che vengono misurati. Ad esempio, PBS può essere utilizzato come diluente, tuttavia, è molto utile per confrontare le curve virus titolazione nel buffer consigliata (MES, pH 6,5) e PBS prima che una decisione è presa, come alcuni sottotipi di NA hanno significativamente ridotta attività enzimatica a pH&gt; 7,0. Quando il pH ottimale non viene utilizzato, il segnale massimo di virus può essere ridotta, con conseguente utilizzo di una quantità eccessiva di antigene (ad esempio, virus) nel saggio; in queste condizioni, il campione potrebbe avere sensibilità ridotta. alcuni noinibizione specifica-n si osserva quando i sieri non trattata sono testati nel ELLA. Questo viene rimosso mediante trattamento termico (56 ° C per 45 min), indicando la presenza di termolabili beta-inibitori. Altri inibitori non specifici (α e γ-classe) di influenza HA sono stati descritti, in particolare in relazione alle H3N2 emoagglutinazione virus e infettività. Infatti, l&#39;inibizione non specifico si osserva anche in ELLA quando H3N2 sono utilizzati come fonte di NA; questa inibizione viene rimosso mediante trattamento dei campioni di siero con una piccola quantità di sialidasi 9. Per quanto riguarda altri test sierologici, controlli negativi e positivi devono essere inclusi in ogni test di fornire un mezzo per valutare le prestazioni del dosaggio. Quando il test non ha soddisfatto i criteri di accettazione, il motivo dovrebbe essere identificato. Tabella 1 fornisce un elenco di potenziali punti nel test che possono essere affrontate per risolvere i problemi. Il prov protocollo ELLAided in questo rapporto utilizza il virus reassortant che contengono HA proveniente da un virus aviario, come fonte di NA. Questo presenta una limitazione di eseguire il test, perché il permesso è richiesto per lavorare con bassi virus aviari patogeni. H6Nx virus reassortant possono essere condivisi tra i laboratori dopo che sono stati inattivati. Pertanto il saggio può essere condotto attraverso collaborazioni volta laboratorio generare virus reassortant ha dimostrato che l&#39;inattivazione è completa e la preparazione ha conservato la propria attività NA. Il vincolo di utilizzare H6Nx virus reassortant può essere superato utilizzando fonti non infettive di NA. Ad esempio, alcuni laboratori hanno utilizzato purificata ricombinante NA 17, mentre altri hanno usato particelle virus-simili (VLP) 15. Tuttavia, né ricombinante NA né VLP sono facilmente disponibili e pertanto si continuano ad usare virus influenzali con una HA aviaria antigenicamente-non corrispondenti. Il tradizionaleMetodo per misurare NI titoli anticorpali non è pratico per diversi motivi; di maggiore preoccupazione sono le sostanze chimiche nocive che sono necessari per produrre una reazione di colore. Inoltre, sono necessari grandi volumi di campione e il test è ingombrante da eseguire. Al contrario, il ELLA è facile da eseguire ed è in un formato che consente la titolazione di un numero ragionevole di campioni. I dati provenienti da studi che ha esaminato ELLA variabilità mostrano che i risultati del test i rendimenti riproducibili 7,8. Il ELLA ha di conseguenza reso la misurazione di routine di titoli anticorpali NI possibili, e si prevede che sarà usato più frequentemente dai laboratori che conducono studi sierologici. Ci sono diversi passaggi critici che devono essere considerati quando si esegue il ELLA. Innanzitutto, inibitori non specifici di attività NA devono essere rimossi. Questi inibitori sono generalmente termolabili e vengono distrutti dal trattamento termico a 56 ° C per 45 min. Il trattamento termico è sufficiente rimuovere non specific inibitori di campioni quando H6 virus reassortant sono utilizzati come fonte di NA, tuttavia, quando H3N2 sono utilizzati nella ELLA, fattori di siero che si legano a emoagglutinina interferiscono anche con la ELLA e devono essere rimossi per trattamento con una piccola quantità di sialidasi prima del trattamento termico 9. In secondo luogo, una quantità eccessiva di antigene, cioè, virus H6Nx reassortant, non deve essere utilizzato come questo riduce la sensibilità del test. titolazione attenta del virus è quindi un passo essenziale; la quantità di antigene usato in ciascun saggio deve fornire un segnale che è ben al di sopra del fondo, e deve essere compresa nell&#39;intervallo lineare della curva di titolazione, cioè, il segnale (densità ottica) deve essere proporzionale alla diluizione virus. Oltre alla sierologia di routine, il ELLA può essere utilizzato per valutare le differenze antigeniche tra AN di virus influenzali stagionali. Queste informazioni possono essere molto utile quando si seleziona i ceppi di virus per l&#39;inclusione di uns candidati vaccini e faciliterà una maggiore comprensione delle pressioni immunitarie che provocano deriva antigenica di NA. Inoltre, l&#39;analisi antigenica dei NAS da virus dell&#39;influenza suina o aviaria può fornire informazioni critiche nel determinare la potenziale pandemia di ceppi emergenti.

Neuraminidasi (NA) è una glicoproteina espressa sulla superficie di virioni dell&#39;influenza. L&#39;attività enzimatica è essenziale per il rilascio di particelle virali neoformate da cellule infette 1,2. Gli anticorpi che inibiscono l&#39;attività NA riducono titoli di virus e sintomi della malattia in modelli animali 3 e correlazione con la resistenza contro la malattia negli esseri umani 4. Un aumento di inibizione NA (NI) titoli a seguito della vaccinazione può quindi servire un indicatore di efficacia del vaccino, tuttavia molti studi di immunogenicità passato influenza non hanno incluso questo punto finale, perché il test tradizionale per misurare NI titoli anticorpali è impraticabile per gli esami sierologici di routine. Il metodo tradizionale per misurare titoli NI è basato sulla quantificazione della quantità di acido sialico che viene scisso dalla glicoconiugati da NA 1. Questo metodo, spesso indicato come metodo tiobarbiturico acid (TBA), utilizza sostanze chimiche pericolose per convertire ac sialicoid per un cromoforo che può essere quantificata mediante spettrometria. Il test non è adatto per verificare un gran numero di campioni in quanto vengono utilizzati tubi di vetro individuali, rendendo il dosaggio ingombrante. La miniaturizzazione del test di un 96 pozzetti fornisce un formato più pratico 5, tuttavia questo test richiede ancora l&#39;uso di sostanze chimiche tossiche e quindi non è ideale. Un test alternativo per misurare NI titoli anticorpali è stato sviluppato da Lambre et al. 6. Questo test quantifica attività enzimatica misurando la quantità di zucchero penultimo glicoproteine, galattosio, che diventa esposto quando l&#39;acido sialico è rilasciato da NA. Poiché arachidi agglutinina (PNA) si lega specificamente al galattosio, una perossidasi di rafano-PNA (HRPO) coniugato può essere usata per ottenere un colorimetrico visualizzazione. La densità ottica che viene misurato è quindi proporzionale all&#39;attività NA nel campione. titoli NI sono misurate determinando la più alta diluizionedi siero che inibisce almeno il 50% dell&#39;attività NA. Questo test lectina enzimatico (ELLA) viene effettuata in piastre da 96 pozzetti rivestiti con fetuina, una proteina del siero altamente glicosilata, come substrato per la NA. Una considerazione importante per i saggi che misurano titoli NI, è la fonte di NA. Questo perché sieri di soggetti vaccinati o infetti contengono anticorpi contro emoagglutinina (HA), così come gli anticorpi per NA. Gli anticorpi che si legano a HA possono interferire con l&#39;attività NA e quindi, per evitare l&#39;inibizione non specifica da anticorpi HA-specifici, purificato NA o virus intero contenente un HA antigenicamente-mismatched deve essere utilizzato nel saggio. Questi virus possono essere generati da riassortimento classica o dalla genetica inversa; l&#39;obiettivo è quello di salvare un virus che contiene HA di un sottotipo che non è legato al ceppo di destinazione, e NA del virus che viene studiato. Il test descritto in questo articolo utilizza i virus dell&#39;influenza A, che vengono generati dal revERSE genetica per contenere HA del sottotipo H6 e mirato NA dal virus dell&#39;influenza A, sottotipo H1N1 e H3N2 5. I risultati generati da Ella e saggi TBA miniaturizzati mostrano questi metodi sono paragonabili, con simile specificità e sensibilità sottotipo 7. ELLA non richiede l&#39;uso di sostanze chimiche pericolose e quindi è il metodo preferito per misurare titoli NI. E &#39;facile da eseguire, con pochi passi (Figura 1): campioni vengono diluiti e trasferiti ad una piastra rivestita Fetuina cui virus (la fonte di NA) è aggiunto. La piastra viene incubata O / N e lavato prima di aggiungere PNA-HRPO. Dopo una incubazione di 2 ore, la piastra viene lavata e viene aggiunto substrato della perossidasi; la reazione colorimetrica si arresta e infine la densità ottica è misurata e il reciproco della diluizione del campione che ha provocato almeno il 50% di inibizione dell&#39;attività NA è riportata come end-point titolo 50%. Uno studio intra-laboratorio per valutare reproducibility del ELLA, ha dimostrato che la variabilità piastra-to-plate è minima e l&#39;operatore a operatore di ripetibilità portato a differenze più di 2 volte del titolo 7. Un successivo studio inter-laboratorio di ELLA variabilità ha mostrato che il test ha una buona riproducibilità quando eseguite in laboratori diversi e che l&#39;inclusione di uno standard in grado di ridurre ulteriormente la variabilità nei risultati 8. Il ELLA è adatto per misurare NI titoli anticorpali in pannelli di siero di studi vaccino influenzale preclinici e clinici 7 e può essere utilizzato anche per valutare le differenze antigeniche tra le AN di virus influenzali 9.

<table><tbody><tr><td>Coating buffer&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-84-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>5x MES, pH 6.5&amp;nbsp;</td><td>KD-Medical</td><td>PBS-0134</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>30% BSA</td><td>Sigma</td><td>A8327</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lectin PNA-HRPO</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;L7759</td><td></td></tr><tr><td>PBS-T</td><td>Sigma</td><td>P3563-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>o-Phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>96-well&amp;nbsp; Maxisorp plates</td><td>NUNC</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom well plates</td><td>NUNC</td><td>267245</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-192B</td><td></td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Charles River Laboratories</td><td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Variety of suppliers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Rainin, Eppendorf</td><td>8 or 12 channel manual pipette 50-250 &amp;micro;l volume</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Depends on pipettor brand</td><td>Depends on pipettor brand</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader, with 490 nm filter</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor V</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 56 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator set to 4 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

Gli anticorpi anti-neuraminidasi (NA), la seconda più abbondante proteina di superficie sul virus dell&#39;influenza, contribuiscono verso la protezione contro l&#39;influenza. I metodi tradizionali per misurare NA inibizione (NI) titoli anticorpali non sono pratici per gli esami sierologici di routine. Questo protocollo descrive il dosaggio enzimatico lectina (ELLA), un metodo alternativo pratico per misurare i titoli NI che viene eseguita in 96 pozzetti rivestiti con un ampio substrato glicoproteina, fetuina. unirà NA acidi terminali sialico da Fetuina, esponendo lo zucchero penultima, galattosio. Arachidi agglutinina (PNA) è una lectina con specificità per galattosio e quindi la portata della desialylation può essere quantificato utilizzando un coniugato perossidasi di rafano-PNA, seguita da aggiunta di un substrato cromogenico perossidasi. La densità ottica che viene misurato è proporzionale all&#39;attività NA. Per misurare NI titoli anticorpali, diluizioni seriali di sieri vengono incubate a 37 ° CO / N su piastre Fetuina rivestite con un importo fisso of NA. Il reciproco della diluizione più alta del siero che si traduce in ≥50% inibizione dell&#39;attività NA è designato come il titolo anticorpale NI. Il ELLA fornisce un formato pratico per la valutazione di routine delle risposte anticorpali umani a seguito di infezione influenzale o la vaccinazione.

Il saggio presentato in questo manoscritto è illustrato schematicamente in Figura 1. La Figura 2 mostra il layout di piastra da 96 pozzetti, e indica che diluizioni seriali dei campioni di siero sono preparati in una piastra di diluizione prima di trasferirli alla piastra Fetuina rivestita. Un parametro critico del test è la quantità di neuraminidasi che viene utilizzato nel saggio; questo è determinato attraverso la titolazione del virus reassortant. Esempi di H6N1 e H6N2 titolazioni virali sono mostrati in figura 3. In 1:10, 1:20 e 1:40 diluizioni H6N1, la densità ottica era simile, indicando che le condizioni erano tali che una lettura massima è stata ottenuta. Ad una diluizione 1:80, la lettura-out era circa il 90% del massimo e quindi questa diluizione del virus è stato utilizzato in saggi successivi. Esempi di titolazioni siero sono mostrati in Figura 4. La figura mostra un campione di siero umano che era titrati contro H6N1 e virus H6N2. Ciascun punto dati mostra la percentuale di inibizione di attività NA che è stato raggiunto da diluizioni seriali di siero; la prima diluizione del siero nel test H6N1 era 1:80; la prima diluizione del siero nel dosaggio H6N2 era 5. Poiché la diluizione più elevata che provoca ≥50% di inibizione è il titolo anticorpale NI, il titolo del siero mostrato in questo esempio è 640 contro la NA NC / 99 (N1) e 160 contro il NA di WI / 05 (N2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> . Figura 1. Uno schema del protocollo ELLA (A) Determinazione della diluizione di antigene (virus) da utilizzare nel test (fase 2 del protocollo): diluizioni di virus sono aggiunti ad una piastra rivestita fetuina e l&#39;attività NA misurata dal quantificare i residui di galattosio terminale attraverso il legame di PNA-HRPO come descritto al punto 2.3 del protocollo; (B </stron<html> g&gt;) Determinazione dei titoli anticorpali NI siero (punto 3 del protocollo). I campioni vengono diluiti e quindi trasferiti ad una piastra Fetuina rivestita in cui viene aggiunto virus. La piastra è incubata O / N prima di aggiungere PNA-HRPO e completando i passi necessari per generare una reazione di colore. Infine, la reazione del colore viene bloccato e la densità ottica è misurata. Il reciproco della diluizione del campione che si traduce in almeno il 50% di inibizione dell&#39;attività di NA viene segnalato come end-point titolo del 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma che mostra la piastra ELLA impostato. Diluizioni seriali dei campioni di siero sono realizzati in una piastra di diluizione e quindi trasferiti ad una piastra Fetuina rivestita.<html> 3fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di H6N1 e H6N2 titolazioni virus. Diluizioni seriali di H6N1 BR / 07 (NA di A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) mostrato in simboli blu) e H6N2 UR / 07 (NA di A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) mostrato in simboli rossi) sono state incubate per 18 ore in piastre fetuina rivestite e la reattività con PNA-HRPO determinato come descritto. Media OD 490nm di 2 pozzi è tracciata contro il reciproco della diluizione virus. La diluizione di H6N1 selezionato per l&#39;uso nel ELLA era 1:80 e della diluizione H6N2 selezionato era 01:40 perché queste diluizioni portato a circa il 90% della densità ottica massima e sono rimasti nel range lineare.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> Figura 4. La titolazione del siero contro NA di N1 (simboli rossi) e N2 (simboli blu) sottotipi. NA titoli di inibizione sono stati misurati contro i virus H6N1 reassortant NC / 99 (contiene il NA di A / Nuova Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) e H6N2 WI / 05 (contiene il NA di A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). inibizione dell&#39;enzima per cento per diluizioni seriali del siero viene mostrata con la linea orizzontale tratteggiata che indica il 50% di inibizione. L&#39;inibizione titoli NA contro l&#39;AN di A / Nuova Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) e A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) erano 2 9.3 (640) e 2 7.3 ( 160), rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">cliccate qui per visualizzare un grande ve</a>rsion di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Cause possibili) </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td> Segnale debole o assente plateau raggiunto nel titolazione del virus </td><td> i) l&#39;attività enzimatica bassa NA ii) del virus Stock non conservato in condizioni ottimali </td><td> i) confermano che il diluente ha pH che è ottimale per l&#39;attività NA; se il pH è ottimale, preparare un nuovo virus magazzino o concentrato virus ii) ricrescere e un&#39;aliquota magazzino; fiale snap-freeze in ghiaccio asciutto prima di riporlo a -80 ° C </td></tr><tr><td> colore debole o assente in pozzetti di controllo delle cellule positive </td><td> i) la diluizione Virus assegnato in modo non corretto ii) Vial-to-vial variabilità in aliquote congelate dei virus iii) PNA- HRPO denaturato o diluito troppo iv) OPD preparati in modo non corretto </td><td> io); titolazione del virus Ripetere ii) Titolare diverse fiale dello stesso lotto per garantire che non vi è alcuna variabilità. Se significativa variabilità, preparare aliquote freschi iii) la diluizione usare virus ottimale retitrate PNA- HRPO iv) Ripetere con la preparazione fresca di OPD </td></tr><tr><td> Debole o assente inibizione da parte di sieri di controllo positivo </td><td> i) Troppo virus impiegato per test ii) Siero deteriorata </td><td> i) la titolazione Ripetere virus ii) Ottenere nuove condizioni di conservazione antisieri Controlla </td></tr><tr><td> L&#39;inibizione da sieri di controllo negativo </td><td> i) inadeguato trattamento termico del siero ii) Troppo poco virus impiegato per test </td><td> i) Ripetere calore inattivazione del siero ii) la titolazione Ripetere virus </td></tr><tr><td> alta sfondo </td><td> i) possibile contaminazione di piastre ii) la concentrazione PNA- HRPO troppo alta / troppo bassa </td><td> i) Ripetere con piastre rivestite di fresco ii) Titolare PNA-HRPO per identificare corretta diluizione da utilizzare </td></tr><tr><td> Virus titolazione mostra apparente inibizione dell&#39;attività NA a basse diluizioni </td><td> i) liquido allantoico può contenere substrato per NA </td><td> ii) uso di virus che è stato in granuli attraverso un cuscino di saccarosio </td></tr></tbody></table> Tabella 1. l&#39;analisi delle cause di test che non soddisfano i criteri di prestazione. Questa tabella fornisce le possibili cause e soluzioni per i problemi che possono verificarsi durante l&#39;esecuzione del ELLA.

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Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

measuring-influenza-neuraminidase-inhibition-antibody-titers-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.5K Views.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

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Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Medicina

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is frequently used to measure the presence and/or concentration of an antigen, antibody, peptide, protein, hormone, or other biomolecule in a biological sample. It is extremely sensitive, capable of detecting low antigen concentrations. The sensitivity of ELISA is attributed to its ability to detect the interactions between a single antigen-antibody complex (1). Moreover, the inclusion of an enzyme-conjugated antigen-specific antibody permits the conversion of a colorless substrate into a chromogenic or fluorescent product that can be detected and easily quantitated by a plate reader. When compared to the values generated by titrated amounts of a known antigen of interest, the concentration of the same antigen in the experimental samples can be determined. Different ELISA protocols have been adapted to measure antigen concentrations in a variety of experimental samples, but they all have the same basic concept (2). Choosing the type of ELISA to perform, indirect, sandwich, or competitive, depends on a number of factors, including the complexity of the samples to be tested and the antigen-specific antibodies available to use. The indirect ELISA is frequently used to determine the outcome of an immunological response, such as measuring the concentration of an antibody in a sample. The sandwich ELISA is best suited for analyzing complex samples, such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the analyte, or antigen of interest, is part of a mixed sample. Finally, the competitive ELISA is most often used when there is only one antibody available to detect the antigen of interest. Competitive ELISAs are also useful for detecting a small antigen with only a single antibody epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hinderance. The protocol will describe the basic procedures for the indirect, sandwich, and competitive ELISA assays.
The indirect ELISA assay is commonly used to measure the amount of antibodies in serum or in the supernatant of a hybridoma culture. The general procedure for the indirect ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigens</li>
	<li>Add serum or hybridoma culture supernatant containing antibody (primary or 1&#176; antibody)</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add secondary (or 2&#176;) enzyme-conjugated antibody</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The sandwich ELISA assay differs from the indirect ELISA assay in that the method does not involve coating the plates with a purified antigen. Instead, a &#34;capture&#34; antibody is used to coat the wells of the plate. The antigen is &#34;sandwiched&#34; between the capture antibody and a second &#34;detection&#34; enzyme-conjugated antibody - where both antibodies are specific for the same antigen, but at different epitopes (3). By binding to the capture antibody/antigen complex, the detection antibody remains in the plate. Either monoclonal antibodies or polyclonal antisera can be used as the capture and detection antibodies. The main advantage of the sandwich ELISA is that the sample does not have to be purified before analysis. Moreover, the assay can be quite sensitive (4). Many commercially available ELISA kits are of the sandwich variety and use tested, matched pairs of antibodies. The general procedure for the sandwich ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with capture antibody</li>
	<li>Add test samples containing antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add enzyme-conjugated detection antibody.</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
Most commercially available sandwich ELISA kits come with enzyme-conjugated detection antibodies. In cases where an enzyme-conjugated detection antibody is not available, a secondary enzyme-conjugated antibody specific for the detection antibody can be used. The enzyme on the secondary antibody performs the same role, which is to convert the colorless substrate to a chromogenic or fluorescent product. The above-mentioned secondary enzyme-conjugated antibody would more like to be used in a &#34;homemade&#34; sandwich ELISA developed by an investigator who has generated their own monoclonal antibodies, for example. One drawback to using a secondary enzyme-conjugated antibody is to be sure it only binds to the detection antibody, and not the capture antibody bound to the plate. This would result in a measurable product in all wells, regardless of the presence or absence of antigen or detection antibody.
Finally, the competitive ELISA assay is used to detect soluble antigens. It is simple to perform, but it is only suitable when the purified antigen is available in a relatively large amount. The general procedure for the competitive ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Preincubate test sample with enzyme-conjugated primary antibodies</li>
	<li>Add mixture to well</li>
	<li>Incubate and wash away any unbound enzyme-conjugated primary antibody</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The &#34;competition&#34; in this assay comes from the fact that more antigen in the test sample used in step 3 will result in less antibody available to bind to the antigen coating the well. Thus, the intensity of the chromogenic/fluorogenic product in the well at the end of the assay is inversely related to the amount of antigen present in the test sample.
A key component in any type of ELISA is the titrated standards of known concentrations that will allow the user to determine the antigen concentration present in the test samples. Typically, a series of wells are designated for creating a standard curve, where known amounts of a purified recombinant protein are added to the wells in decreasing amounts. When these wells are processed at the same time as the test samples, the user can then have a reference set of absorbance values obtained from a microplate reader for known protein concentrations to go along with the absorbance values for the test samples. The user can then calculate a standard curve to which the test samples can be compared for determining the amount of protein of interest present. The standard curve can also determine the degree of precision of the user&#39;s dilution making.
Finally, the last step in each of the ELISA types listed above calls for the addition of a substrate. The degree of conversion of the substrate to product is directly related to the amount of enzyme present in the well. Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes found conjugated to antibodies. As expected, there are a number of substrates available specific for either enzyme that produce a chromogenic or fluorescent product. Moreover, substrates are available in a range of sensitivities that can increase the overall sensitivity of the assay. The user must also take into consideration the type of instrumentation available for reading the plate at the end of the experiment when picking the type of substrate to use, along with its corresponding enzyme-conjugated antibody.
Commonly used chromogenic substrates for HRP include 2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) and 3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), whereas p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) is used for AP. ABTS and TMB produce water-soluble green and blue colored reaction products, respectively. The green ABTS product has two major absorbance peaks, 410 and 650 nm, while the blue TMB product is best detected at 370 and 652 nm. The colors of ABTS and TMB change to yellow upon the addition of an acidic stop solution, which is best read at 450 nm. Color development for ABTS is slow, while it is fast for TMB. TMB is more sensitive than ABTS, and may produce a higher background signal if the enzymatic reaction proceeds too long. PNPP produces a yellow water-soluble product after AP conversion that absorbs light at 405 nm.

Saggi ELISA: indiretti, sandwich e competitivi

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
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Didattica

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Immunologia

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

Source: Kaufmann, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55833">An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare gli anticorpi sierici contro un antigene bersaglio

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

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Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

Un test per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

Source: Gross, F. L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56448">Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing &#945;2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human serology

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

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