This project was funded by ARC grant DP0986021 and NHMRC grant 585442. ABB is supported by an ARC Future Fellowship (FT140100452). JAP is supported by an iMQRES scholarship awarded by Macquarie University and by a DAAD-Doktorandenstipendium awarded by the German Academic Exchange Service. JMD is supported by CNRS and University Paul Sabatier.

1. Drug Administration per le api da tiro <ol><li> trattamento orale <ol><li> Preparare la soluzione 1,5 M di saccarosio mescolando 257 g di saccarosio con 500 ml di acqua (è più facile per sciogliere questa quantità di saccarosio in acqua bollente). Conservare soluzione di saccarosio a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. Nota: La soluzione saccarosio fornisce un ambiente molto ospitale per alcuni microrganismi, e quindi diventa facilmente contaminato e sgradevole per le api. soluzione di saccarosio Bulk può essere aliquotati e conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Stabilire una dose farmacologica appropriata (come realizzarla, è rivolta nella sezione discussione sotto), e preparare una soluzione tale che la dose farmaco preferito viene sciolto in 20 microlitri soluzione di saccarosio (ad esempio, per fornire 20 mg, diluire farmaco alla rapporto di 1 mg / ml). api cablaggio secondo il Felsenberg et al. (2011) 16. Fare questo passo, almeno 12 ore prima del trattamento farmacologico per garantire che le api sono stressati o non è piùUT da sfruttare quando la soluzione farmaco viene presentato. NOTA: per risultati più coerenti, è meglio morire di fame api (mettendo api sfruttata in un incubatore a 34 ° C e 70% di umidità) O / N. </li><li> Usando una micropipetta, toccare una goccia di 1,5 M saccarosio dell&#39;acqua all&#39;antenna di un ape sfruttato. Quando la proboscide è esteso, toccare una goccia 20 ml di 1,5 M di saccarosio contenente il farmaco direttamente alla proboscide delle api. Assicurarsi che l&#39;ape consuma tutto. Come utilizzare il controllo del veicolo da 1,5 M soluzione di saccarosio senza farmaci aggiunti. NOTA: potrebbe essere necessario un aggiustamento sulla base di piani sperimentali La quantità di soluzione di saccarosio. Se appetitive condizionata è destinato, alimentando le api appena prima della formazione possa interferire con la reattività api. </li><li> Eliminare o mettere da parte le api che non consumano tutto il saccarosio. NOTA: Se un gran numero di api non riescono a bere la soluzione di saccarosio, potrebbe essere necessario un aggiustamento del programma di alimentazione. </li></ol></li><li> Iniezione nel torace <ol><li> Preparare droga nel miele delle api Ringer 17 come segue: <ol><li> Mescolare e autoclave 7,45 g di NaCl, 0.448 g KCl, 0,812 g MgCl 2, 0,735 g CaCl 2, 54.72 g di saccarosio, 4,95 g D-glucosio e 2,48 g HEPES a 1.000 ml di acqua. Fare attenzione quando si ripone suoneria in quanto è facilmente contaminato. Aliquotare e conservare Ringer a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sciogliere il farmaco in soluzione di Ringer e poi diluire in modo che la quantità desiderata è presente in 5 microlitri. Ad esempio, se le api devono essere trattati con 5 mg di un farmaco, 1 g può inizialmente essere sciolto in 1 ml di Ringer, prima di essere diluito 1: 1000 in Ringer per una soluzione finale di 1 mg / mL. NOTA: In alternativa, disponibile in commercio PBS (Phosphate-buffered Salin) può essere usato al posto di soluzione di Ringer. </li></ol></li><li> Fare un microscalpel rompendo l&#39;angolo di una lama a doppio taglio rasoio con offun portalama. Fissare il frammento di lama per un porta lama in modo che si fa un bel lama con un punto finale tagliente. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, usare con cautela il microscalpel per tagliare un foro di 2 millimetri appena sopra il scutello, accanto al processo dell&#39;ala posteriore del torace di un ape. Evitare di tagliare troppo in profondità in quanto ciò potrebbe danneggiare muscoli del volo, e fare attenzione ad evitare le cerniere ala. Idealmente, tagliare solo tre lati, in modo che il lembo di cuticole può essere successivamente ripiegato per chiudere il sito di lesione. </li><li> Usando una micropipetta, deposito 5 μlL Ringer (o PBS) contenente il farmaco sulla parte superiore del foro nel torace. Monitorare attentamente al microscopio per assicurare l&#39;intera goccia è assorbito nel emolinfa. Utilizzare Ringer (o PBS) come un controllo del veicolo. </li><li> Se possibile, spostare il lembo cuticola posteriore sopra il foro. Dopo 5-10 ore, sarà ricollegare e sigillare. NOTA: In alternativa a questa tecnica, iniettare 1 ml direttamente nel torace usando una siringa di vetro, dopo aver aperto un smabuco ll nel mezzo del frenulo (linea trasversale nella regione posteriore della scutello) con una siringa (diametro: 0,6 mm G: 23). Questo aggira la necessità di tagliare prima il torace con un bisturi e il sito di iniezione è più piccolo, ma questo metodo lascerà il sito di iniezione esposto. </li></ol></li><li> iniezione ocellus NOTA: Questo è un metodo adatto per la distribuzione di molecole in tutta la capsula testa, nella emolinfa. <ol><li> Preparare farmaci come in 1.2.1, ma regolare concentrazioni di farmaco in modo tale che la dose desiderata sarà contenuto in 1 ml di Ringer o PBS (meno volume può essere assorbito attraverso il foro ocellus che attraverso il torace). </li><li> Preparare una microscalpel come in 1.2.2. Sotto uno stereomicroscopio, bloccare la testa di un ape sfruttato in posizione riempiendo la fessura collo con cera. Utilizzare fusione della cera a bassa temperatura (ad esempio, cera dentale) per evitare recettori olfattivi antennali danneggiare o altre cellule che possono essere importante per valutare il comportamento (ad esempio, l&#39;apprendimento olfattivo). Poi rimuovere con attenzione la lente della ocellus mediana inserendo la punta del microscalpel sotto la lente e rompere delicatamente la lente libera dalla capsula testa. NOTA: È anche possibile posizionare accuratamente cera sopra le antenne per impedire il movimento. </li><li> pipetta con cura droga sul foro ocellus. Attendere fino a quando tutto è preso nella capsula testa. Rimuovere impronte dentarie dalle antenne e consentire l&#39;ape a riposo per un po &#39;prima di continuare la procedura sperimentale. Utilizzare Ringer (o PBS) come un controllo del veicolo. </li></ol></li><li> Iniezione nel tratto ocellare NOTA: Il tratto ocellare contiene grandi fibre, che collega alla maggior parte delle regioni del cervello centrale 18. Questo metodo di trattamento abilita l&#39;applicazione composti solo il cervello, ma non mira sottoregioni specifiche del cervello. <ol><li> Preparare api come a 1.3.2. e rimuovere il cristallino ocellus mediana con il tip di un microscalpel come in 1.3.3. NOTA: Questo può essere fatto fino a 2 ore prima dell&#39;iniezione. Sulla base della nostra esperienza, le api Fed sono meglio in grado di far fronte a questo tipo di chirurgia dalle api Starved </li><li> Riempire una siringa di vetro 10 ml dotato di un piccolo calibro (ad esempio, 33, diametro: 210 micron) ago con soluzione di droga preparata come a 1.3.1. </li><li> Utilizzando un micromanipolatore manuale, inserire la punta della siringa attraverso la retina ocellare nella capsula testa ad una profondità di 50 micron e iniettare 250 nl di soluzione. </li><li> Dopo l&#39;uso, lavare la siringa 3 volte con acqua distillata, quindi 3 volte con etanolo al 75%. </li></ol></li><li> Microiniezione in particolari strutture cerebrali NOTA: Oltre ai trattamenti sistematici di cui sopra, è possibile eseguire microiniezioni in particolari strutture cerebrali. Questo permette la manipolazione farmacologica di una o più regioni cerebrali, lasciando inalterati gli altri. Questo funzionameglio con le regioni del cervello che sono facili da riconoscere dalla superficie del cervello anteriore (ad esempio, lobi antennali, calici di funghi corpo o lobi verticali, o lobi ottici), ma in altre regioni sono stati presi di mira. Si prega di notare che l&#39;orientamento (anteriore / posteriore, dorsale / ventrale) si riferisce alle all&#39;asse del corpo, piuttosto, che al nevrasse 19. <ol><li> Preparare il farmaco in Ringer o PBS nello stesso modo come in 1.2.1, aggiungendo un fluorescente (ad esempio, 0,5 mg / ml destrano, Alexa 546 o 568 fluoro) o colorante nonfluorescent (ad esempio, 1 mM blu di metilene). NOTA: L&#39;aggiunta di un colorante fluorescente consentirà la verifica della posizione di iniezione dopo l&#39;esperimento è finito (utilizzando la microscopia confocale, seguendo dissezione cerebrale), considerando coloranti nonfluorescent consentono il monitoraggio diretto durante l&#39;esperimento. </li><li> Per rendere pipette di vetro per l&#39;iniezione, inserire capillari di vetro del diametro corretto in morsetti titolare di un estrattore elettrodi (1,0 mm per la tenuta di serieER incluso per microinjector menzionata nella lista dei materiali). Regolare le impostazioni di trazione e di calore per la produzione di un lungo circa 0,5 cm punta (impostazioni sarà diverso per ogni estrattore, anche se lo stesso modello è utilizzato). NOTA: Idealmente, i due pipette tirato da un bicchiere dovrebbero avere la stessa lunghezza e forma, in modo che entrambi possono essere usati. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, rompere le punte avere un diametro esterno di circa 10-15 micron, basato sulla stima visiva utilizzando una scala su un reticolo inserito nel oculare. I livelli sulla scala sono definiti dal produttore e possono essere corrette per l&#39;ingrandimento utilizzato. </li><li> Poi, riempire le pipette di vetro con la soluzione da iniettare. Se si usano capillari di vetro con filamenti, riempire la pipetta mettendo la parte posteriore nella soluzione di droga, altrimenti riempire punta con punte microloader. </li><li> Inserire la pipetta di vetro riempito nel supporto capillare di un microinjector, che è controllato da un mi manuale o elettronicocromanipulator. </li><li> Calibrare il microinjector per iniettare il volume desiderato (0,5-2 nl, a seconda delle dimensioni della struttura cerebrale mirato). Per questo, iniettare direttamente in una piccola capsula di Petri contenenti olio minerale e misurare il diametro della goccia con il reticolo. Modificare le impostazioni fino a raggiungere il volume desiderato. </li><li> Fissare la testa di un ape sfruttato con cera dentale morbido come in 1.3.2, prima di tagliare un&#39;apertura nella parte anteriore della capsula testa, utilizzando un microscalpel, con tre tagli: uno appena sotto il ocellus mediana (ventrale), uno alla il bordo di destra o occhio sinistro e uno sopra l&#39;antenna steli (dorsale). Usare un pezzo di cera dentale per tenere il lembo aperto nel posto. </li><li> Spingere con cautela ghiandole e trachea si trova in cima del cervello da parte utilizzando una pinza sottile, poi fare una piccola rottura nella neurolemma (membrana molto sottile intorno al cervello) al di sopra della struttura del cervello mirati. NOTA: Se molti api sono da trattare in una sola volta, questa procedurapuò essere eseguito in precedenza; tuttavia, fare attenzione a non lasciare le api in questo stato troppo a lungo (non più di 30 minuti), in quanto il loro cervello potrebbero essiccare. </li><li> Inserire la punta nella regione del cervello desiderato e regolare la profondità perpendicolarmente alla superficie del cervello (ad esempio, 60 micron per calici corpo di funghi). Iniettare il volume preimpostato. Per le regioni del cervello laterali, iniettare bilaterale (cioè fare una iniezione per ogni emisfero). Se viene utilizzato un colorante nonfluorescent, garantire l&#39;iniezione avvenuta nella regione di destra sull&#39;osservazione durante l&#39;iniezione. Se viene utilizzato un colorante fluorescente fare lo stesso sotto luce fluorescente utilizzando uno stereomicroscopio con un sistema di visualizzazione a fluorescenza. </li><li> Successivamente, posizionare il lembo aperto indietro sopra la testa del ape. Sciogliere un cristallo di eicosano, che è di circa 1 mm di diametro, con un sottile filo avvolto attorno alla punta di un saldatore micro (temperatura di fusione è 35-37 ° C) e sigillare i tagli. Questo ridurrà di molto la mortalità. </li><li> Rilasciare ilape dal cablaggio per l&#39;analisi comportamentale (ma si veda la discussione), o tenere nel cablaggio per esperimenti sulle api trattenuti - per esempio, l&#39;estensione proboscide reflex (PER) test 20. </li><li> Se è stato utilizzato un colorante fluorescente, affinché l&#39;iniezione colpito la zona di interesse dopo l&#39;esperimento è finito utilizzando un confocale a scansione laser microscopio (fig. 1). NOTA: Questo è particolarmente utile quando si mira aree cerebrali profonde (in cui sarebbe difficile vedere colorante nonfluorescent durante la fase di iniezione). </li></ol></li></ol> 2. Metodi Drug Administration per le api in volo libero <ol><li> trattamento orale <ol><li> Preparare farmaco nello stesso modo come in passaggi 1.1.1-1.1.2. Aggiungere la soluzione farmaco per un alimentatore e posto in frigorifero per lo stoccaggio. NOTA: Ogni alimentatore farà, come un tappo di bottiglia capovolta o un vaso rovesciato su carta velina. </li><li> Addestrare le api ad un alimentatore gravità contenente 1 M o 0,5M soluzione di saccarosio, ponendo un alimentatore vicino al alveare. Una volta api iniziano foraggiamento al alimentatore, gradualmente allontanarlo finché è a una distanza confortevole per evitare essere punti (minimo 5 m). </li><li> api Paint-marchio al fine di tenere traccia delle singole api mellifere. Fate una lista di tutte le combinazioni di colori che verranno utilizzati. Quando un ape atterra l&#39;alimentatore, segnano con cura il suo addome con due colori, e fare una nota della lista che la combinazione è preso. </li><li> Scambiare l&#39;alimentatore a gravità per un alimentatore contenente la soluzione medicinale / saccarosio. Prendete nota delle api marcate che visitano l&#39;alimentatore. Cattura ogni ape non marcato visita l&#39;alimentatore come le api sono reclutatori prolifici, e il numero di api che visitano l&#39;alimentatore drogato può ottenere rapidamente fuori controllo. Questo è particolarmente problematico se lo stesso esperimento deve essere eseguita in giorni successivi, come api naive potrebbero non essere più naive. NOTA: In alternativa alla formazione singole api ad un alimentatore, autore precedentes hanno alimentato con successo l&#39;acqua saccarosio farmaco-cucita ad un intero alveare 21 - 23. </li></ol></li><li> Il trattamento topico NOTA: L&#39;obiettivo è di sciogliere il composto di interesse in un solvente che può penetrare l&#39;insetto cuticola cerosa. Diversi solventi possono essere utilizzati per questo scopo. Il più comunemente usato includono acetone, dimetilformammide (DMF) e dimetilsolfossido (DMSO). <ol><li> Valutare quale solvente funziona meglio per il composto a portata di mano. Se un forte fenotipo è prevista da un sovradosaggio (ad esempio, paralisi o morte), api ossequio (fase 2.2.2) con una dose elevata (ad esempio, 20 mg di cocaina 7) sciolti in ciascuno dei diversi solventi e monitorare attentamente tempo fino paralisi o la morte. </li><li> Utilizzando un microcapillare 1 ml (o una microsiringa, che può essere montato su un dispensatore a ripetizione appropriato) e porta microcapillari, disegnare 1 ml di soluzione di farmaco (ad esempio, 381; g / ml di cocaina) nel capillare. Espellere la goccia, e con attenzione dipingere sul torace di un&#39;ape marcata. Coprire più grande di una zona una possibile con la soluzione, piuttosto che lasciare un solido goccia, come l&#39;ape è quindi probabile sposo fuori. Fare attenzione a non permettere al prodotto di contattare l&#39;ala cerniere, o questo può trarre fuori il torace e lungo le ali dove evaporerà senza essere assorbiti nel emolinfa. NOTA: A seconda del obiettivo di ricerca, questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare farmaci per l&#39;addome dell&#39;ape. Tuttavia, i farmaci raggiungono il sistema nervoso centrale più veloce e in grandi quantità quando applicato al torace metodo di 24 .Questo funziona altrettanto bene con sfruttato come con le api volo libero. </li></ol></li><li> trattamento volatilizzato <ol><li> Sciogliere la droga (in precedenza questo metodo è stato utilizzato per fornire la cocaina alle api 10) su 100% di etanolo. Per garantire la solubilità, non utilizzare un cloridrato o altre forme di sale didi droga, se possibile. Quando si effettua una diluizione prepararlo in modo che l&#39;importo da erogare un ape è presente in 100 microlitri. Utilizzare etanolo puro come un controllo del veicolo. </li><li> Per creare un filamento, utilizzare la stessa procedura McClung e Hirsh 25. <ol><li> Brevemente ha spiegato: finire filo nichelcromo strettamente intorno un chiodo e collegare a due fili elettrici (uno per ogni estremità del filamento). Rimuovere il chiodo. La bobina nichelcromo rimanente viene indicato come il filamento. </li><li> Infilare i due fili attraverso fori praticati con attenzione nel coperchio di un 50 ml provetta da centrifuga, che dovrebbe essere resistente alla temperatura prescelta. Incollare i cavi in ​​posizione con silicone liquido. NOTA: Questo renderà la tenuta d&#39;aria tubo. Ciò è essenziale per evitare l&#39;esposizione secondaria allo sperimentatore ed assicurare che le api sono trattati con la dose appropriata. </li></ol></li><li> Collegare i fili che portano al filamento di una fonte di alimentazione. Utilizzo di una termocoppia per misurare la temperatura diil filamento, esperimento con tensione diversa / combinazioni correnti fino uno che si traduce in un profilo di temperatura appropriata per il farmaco in questione, idealmente, quella che consente per 10 sec di riscaldamento o meno. Questo è molto importante, fare riferimento alla letteratura rilevante (ad esempio, in modo che la cocaina volatilizzare deve essere riscaldato ad almeno 200 ° C, ma a temperature oltre 350 ° C viene suddiviso in composti secondari 26). </li><li> pipetta con cautela 100 ml di farmaco contenente soluzione di etanolo sul filamento. Distribuire il liquido sulla superficie del filamento per quanto possibile in quanto ciò aumenterà l&#39;efficienza evaporazione. Lasciare il filamento esposto a temperatura ambiente fino a quando tutto l&#39;etanolo evaporato. NOTA: Se l&#39;etanolo non è sufficientemente evaporato, api saranno trattati sia con il farmaco di scelta ed etanolo. Le api sono estremamente sensibili a etanolo, e alcuni farmaci avere interazioni sinergiche con l&#39;etanolo, che sarà pregiudizi exrisultati sperimentali. </li><li> Una volta che l&#39;etanolo sia completamente evaporata (farmaco precipitato di solito può essere visto sul filamento secca al microscopio), prendere un ape in volo libero in un tubo da 50 ml. chiudere con cautela il coperchio contenente il filamento. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione per 10 secondi, spegnere il dispositivo e attendere altri 50 secondi (per consentire il composto volatilizzato raffreddare e quindi condensare o un deposito). Rilasciare l&#39;ape. NOTA: Anche se questo metodo di trattamento funziona in modo eccellente per le api in volo libero, può essere utilizzato in modo altrettanto efficace con le api bardati. È sufficiente collegare l&#39;ape imbrigliato all&#39;interno di un tubo da 50 ml. Ricaricare il filamento come descritto in 2.3.4 tra le api. Per maggiore produttività, più filamenti possono essere utilizzati in parallelo. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juvenile+Hormone+and+Octopamine+in+the+Regulation+of+Division+of+Labor+in+Honey+Bee+Colonies.">Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies.</a> Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).</li><li>Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+amines+in+the+antennal+lobes+and+the+initiation+and+maintenance+of+foraging+behavior+in+honey+bees.">Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees.</a> J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).</li><li>Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+injection,+feeding+and+topical+application+methods+for+treatment+of+honeybees+with+octopamine.">Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine.</a> J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).</li><li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila.">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li><li>Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrolysis+and+volatilization+of+cocaine.">Pyrolysis and volatilization of cocaine.</a> J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).</li><li>Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -. C., Devaud, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+waves+of+transcription+are+required+for+long-term+memory+in+the+honeybee.">Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee.</a> Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).</li><li>Urlacher, E., Soustelle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+Bee+Allatostatins+Target+Galanin/Somatostatin-Like+Receptors+and+Modulate+Learning:+A+Conserved+Function?.">Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function?.</a> PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).</li><li>Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+recovery+from+extinction+depends+on+the+reconsolidation+of+the+acquisition+memory+in+an+appetitive+learning+paradigm+in+the+honeybee+(Apis+mellifera).">Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera).</a> J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).</li><li>Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cocaine+on+honey+bee+dance+behaviour.">Effects of cocaine on honey bee dance behaviour.</a> J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).</li><li>Devaud, J. -. M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -. C., Gr&#252;newald, B., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect:+Mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations.">Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).</li><li>Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -. C., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aversive+learning+in+honeybees+revealed+by+the+olfactory+conditioning+of+the+sting+extension+reflex.">Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex.</a> PLoS One. 2 (3), e288 (2007).</li><li>Henry, M., B&#233;guin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+pesticide+decreases+foraging+success+and+survival+in+honey+bees.">A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees.</a> Science. 336 (6079), 348-350 (2012).</li><li>S&#248;vik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+manganese+on+honeybee+foraging.">Negative impact of manganese on honeybee foraging.</a> Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).</li><li>Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+receptors+in+the+honeybee+(Apis+mellifera)+brain+and+their+disruption+by+RNA-mediated+interference.">Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference.</a> J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).</li><li>Guo, X., Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipe+for+a+Busy+Bee:+MicroRNAs+in+Honey+Bee+Caste+Determination.">Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination.</a> PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).</li><li>Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin-associated+microRNA-932+targets+actin+and+regulates+memory+in+the+honeybee.">Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee.</a> Nat. Commun. 5, 5529 (2014).</li><li>Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mianserin+hydrochloride:+Peripheral+and+central+effects+in+relation+to+antagonism+against+5-hydroxytryptamine+and+tryptamine.">Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine.</a> Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).</li><li>Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bee+dopamine+and+octopamine+receptors+linked+to+intracellular+calcium+signaling+have+a+close+phylogenetic+and+pharmacological+relationship.">Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -. C., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+olfactory+classical+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honey+bees:+a+step+toward+standardized+procedures.">Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures.</a> J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

I metodi di cui sopra consentono un trattamento semplice, efficace e robusto sia priva di volare o api mellifere bardati. Questi metodi sono compatibili con molti paradigmi sperimentali e questioni biologiche (Tabella 1). Tutti i metodi in volo libero può essere facilmente applicato per le api bardati. Il contrario è meno successo, tuttavia, dal momento moderazione temporanea e metodi di trattamento invasivo spesso possono compromettere la capacità volare api. I metodi so...

Dal momento che Karl von Frisch chiarito il loro linguaggio della danza 1, le api sono rimasti una specie di studio richiesti per i ricercatori in comportamento animale e neurobiologia. Negli ultimi anni una miriade di nuove discipline sono emerse nel punto di intersezione di questi due campi, e diverse altre discipline (ad esempio, la biologia molecolare, la genomica e informatica) sono sorti al loro fianco. Questo ha portato a un rapido sviluppo di nuove teorie e modelli per comprendere come il comportamento deriva da attività nei sistemi nervosi. A causa dello stile di vita unico, ricco repertorio comportamentale, e la facilità di manipolazione sperimentale e farmacologica, le api sono rimasti in prima linea in questa rivoluzione. Le api da miele sono stati utilizzati per studiare domande neurobiologici di base come quelli alla base dell&#39;apprendimento e della memoria 2,3, il processo decisionale 4, 5 olfattiva, o elaborazione visiva 6. Negli ultimi anni, la honey ape è stato anche utilizzato come modello per lo studio di argomenti generalmente riservati per la ricerca medica, come ad esempio gli effetti di sostanze stupefacenti 7 - 11, 12 sonno, invecchiamento 13, oppure i meccanismi alla base di anestesia 14. A differenza dei classici organismi modello genetico (per esempio, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), ci sono pochissimi strumenti genetici disponibili per la manipolazione di funzioni neurali di api mellifere, anche se questo è attualmente cambiando 15. Invece, gli studi api sono principalmente affidamento su manipolazioni farmacologiche. Questo è stato un grande successo; tuttavia, la diversità della ricerca ape è tale che sono necessari una serie di metodi per la somministrazione farmacologica. La ricerca con le api affronta questioni molto diverse, è studiata da ricercatori provenienti da diverse discipline e contesti, e utilizza una varietà di approcci sperimentali. molti RESEdomande arco richiedono api per essere o volo libero, liberamente interagire nella loro colonia, o entrambi. Questo può rendere difficile tenere traccia dei singoli animali da esperimento, e rende moderazione o incannulamento irrealizzabile. Per accogliere la diversità delle ricerche miele d&#39;api, sono necessari una varietà di metodi di somministrazione dei farmaci, consentendo per la somministrazione robusto e flessibile, garantendo nel contempo che i profili farmacocinetici e farmacodinamica, invasività del metodo, e la sua affidabilità, soddisfare il paradigma in questione. A causa di queste diverse esigenze, la maggior parte dei gruppi di ricerca hanno sviluppato i propri metodi di gestione della droga unici. Finora, questo è stato un punto di forza della comunità di ricerca delle api; ha portato allo sviluppo di array di metodi che consentono la somministrazione del farmaco stesso in circostanze diverse. Il nostro obiettivo non è quello di sviluppare un unico metodo standardizzato per manipolazioni farmacologiche di api, ma piuttosto mettere in evidenza i metodi chehanno dimostrato di essere particolarmente efficace, e aiutare i ricercatori adottano questi. Discutiamo i principi di base di come funzionano, così come i loro vantaggi e svantaggi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td>Any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protection Wax</td>
			<td>Dentaurum</td>
			<td>124-305-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G NanoFil needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NF33BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine forsceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0208-55-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>SRI</td>
			<td>2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247 000.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eicosane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual micromanipulator</td>
			<td>Brinkmann Instrumentenbau</td>
			<td>MM-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td>
			<td>Junior unit XYZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WESD51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10000 MW</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D-22911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10000 MW</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D-22912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Australian Entomological Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade holder and breaker</td>
			<td>Australian Entomological Supplies</td>
			<td>E130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather double edged razor blade</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-949-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nichrome wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical wires</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model paint</td>
			<td>Tamiya USA</td>
			<td>Depends on colour</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeating dispenser</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>PB-600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flourescence viewing system</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>SFR-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graticule</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>S8014-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcapillary with holder</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Digitech</td>
			<td>QM-1324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neuropharmacological manipulation of restrained and free-flying honey bees, apis mellifera

Le api da miele dimostrano capacità di apprendimento sorprendenti e il comportamento sociale avanzata e la comunicazione. Inoltre, il loro cervello è piccolo, facile da visualizzare e studiare. Pertanto, le api sono stati a lungo un modello preferito tra i neurobiologi e neuroethologists per studiare le basi neurali del comportamento sociale e naturale. È importante, tuttavia, che le tecniche sperimentali utilizzate per studiare le api non interferiscono con i comportamenti oggetto di studio. Per questo motivo, è stato necessario sviluppare una gamma di tecniche per la manipolazione farmacologica di api. In questo lavoro abbiamo dimostrato metodi per il trattamento api mellifere trattenuto o volo libero con una vasta gamma di agenti farmacologici. Questi includono entrambi i metodi non invasivi come trattamenti per via orale e topica, nonché metodi più invasivi che consentono precisa somministrazione di farmaci sia in modo sistemico o localizzato. Infine, si discute i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo e descriviamoostacoli comuni e come superare meglio di loro. Concludiamo con una discussione sull&#39;importanza di adattare il metodo sperimentale per le questioni biologiche, piuttosto che il contrario.

Una selezione di risultati rappresentativi per i metodi di cui sopra sono riportati, in primo luogo per dimostrare che i metodi consentono agenti farmacologici per raggiungere il cervello e influenzano il comportamento delle api il miele. Effetti specifici sui processi cerebrali possono essere facilmente ottenuti dopo l&#39;iniezione del torace. Poiché gli agenti farm...

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Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

9.8K Views.  Volda University College.  Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti. 

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

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Neuroscienze

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell'ipotalamo attraverso

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (