We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

Animali: tipo selvaggio C57Bl / 6J topi allevati presso l&#39;Università della California a Los Angeles (UCLA). Tutti gli animali erano tra 11-17 settimane di vita, e compresi i topi maschi e femmine. Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo, mantenuto in un ciclo 12:12 chiaro / scuro con cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della UCLA e l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology Dichiarazione per l&#39;uso di animali in oftalmica e Vision Research. NOTA: Tutti i farmaci e gli agenti iniettabili sono United States Pharmacopeia (USP) di grado. 1. Preparazione chirurgica <ol><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg ketamina e 8 mg / kg xylazina in un mix salina. Somministrare anestesia per una profondità tale che il mouse non ha pinch punta o riflessi tattili corneali. </li><li> Mantenere la temperatura corporea a 37,0 ° C con un pad acqua circolante. </li><li> Dilatare gli alunni con 2,5% fenilefrina occhio dROPS e tagliare le basette per facilitare la visualizzazione. Whiskers forniscono significativi input sensoriale al mouse, quindi, basette rifilatura dovrebbe rimuovere solo la parte che blocca l&#39;accesso chiaro ad occhio, e non alla base del baffo. Nella nostra esperienza, i topi mostrano normale recupero dopo questa procedura. Applicare occhio metilcellulosa scende a prevenire la secchezza e ridurre al minimo anestetici indotte cataratta transitorie 13. </li><li> Sterilizzare gli strumenti prima dell&#39;intervento chirurgico (cioè, betadine ed etanolo o perline caldi). </li><li> Preparare fluoresceina diluita (0,01% con soluzione fisiologica 0,9%), in un ambiente sterile (cioè, armadio biosicurezza) se verrà eseguita la visualizzazione (vedere la sezione 3). </li></ol> 2. Preparazione del sito di iniezione <ol><li> Preparare una siringa (ad esempio, 5 microlitri siringa) con il volume appropriato di iniezione (ad esempio 0,3 fino 1.0 mL). </li><li> Posizionare il mouse così l&#39;occhio è rivolto verso l&#39;alto e chiaramente visibile nella dissecting microscopio. </li><li> pizzicare delicatamente la congiuntiva temporale con pinza sottile a punta. Effettuare una incisione circonferenziale di circa 90 gradi con le forbici Vännäs curve. </li><li> Ripetere il passaggio 2.3 con la capsula sottostante del Tenon. </li><li> Resecare il tessuto connettivo circostante con pinza sottile a punta durante la rotazione del globo per via nasale. Lavorare per il sito di iniezione di circa 0,5 millimetri temporale al nervo ottico. Usare molta attenzione per evitare di interrompere il seno retro-orbitale. </li></ol> 3. sclerotomie e sottoretinico Iniezione NOTA: Si raccomanda che l&#39;iniezione di 0,01% fluoresceina nel 0,9% Saline essere usato per aiutare con la visualizzazione, mentre l&#39;apprendimento di questa procedura. La distribuzione topografica della fluoresceina può essere efficacemente documentato con immagini fundus (vedi sezione 4). <ol><li> Fai una piccola incisione sclerale al sito di iniezione graffiando leggermente l&#39;oculare con una lama oftalmica 22,5 gradi. Questo shou incisioneLd essere abbastanza grande da permettere alla punta dell&#39;ago di passare attraverso la sclera soltanto. </li><li> Inserire il smussato 33 ago G (angolato. 5 - 10 ° nel sclerotomie con lo smusso rivolto e angolata parallela alla retina Iniettare volume desiderato (ad esempio, da 0,3 a 1,0 ml di 0,01% fluoresceina a fini di apprendimento). NOTA: Mantenere sterilità della siringa accuratamente pulizia con lavaggi successivi di un adatto solvente e acqua deionizzata prima di ciascuna iniezione. </li><li> Premere il pistone lentamente (oltre ~ 3 sec) senza spostare l&#39;ago e con una pressione uniforme. NOTA: quando l&#39;ago è nello spazio sottoretinico, una leggera resistenza verrà sentito mentre si preme lo stantuffo. Non ci sarà per una resistenza minima se l&#39;ago perfora la retina, ed elevata resistenza se l&#39;ago non penetra la sclera o RPE. </li><li> Attendere alcuni secondi prima di estrarre l&#39;ago per ridurre al minimo il riflusso. </li><li> Lavare l&#39;occhio con soluzione salina tamponata sterile e garantire l&#39;occhio hcome ruotato nella sua posizione normale. </li></ol> 4. Valutazione di distacco retinico da Office e Retinografia <ol><li> Eseguire l&#39;imaging ottobre immediatamente dopo l&#39;iniezione per valutare la qualità della iniezione e al momento opportuno punti post-iniezione come necessario per valutare la struttura della retina. NOTA: Esempi di utilizzo dei PTOM studi simili è stata precedentemente descritta 7,14. <ol><li> Regolare e allineare l&#39;immagine di Office per indirizzare il sito di iniezione. Il sito di iniezione deve essere linea mediana e 0,5 millimetri temporale alla testa del nervo ottico. Ripetere se necessario se il distacco è fuori della cornice o meno ottimale centrata. </li></ol></li><li> Visualizza distacco della retina e tingere zona di iniezione con bagno en-face immagini fundus 7,14. NOTA: Se un sistema di imaging il PTOM non è disponibile, l&#39;iniezione di una piccola quantità di fluoresceina con un vettore per la pratica consentirà visualizzazione con qualsiasi telecamera fundus che esegue fluoresceina angiografia utilizzando le stesse lunghezze d&#39;onda di eccitazione e blocco filtri. aree localizzate di iper-fluorescenza appariranno sotto il sistema vascolare e il sistema vascolare avranno confini netti e distinti se lo spazio sottoretinico si rivolge in modo corretto. Il bordo della bozza dalla iniezione sarà delimitata dalla transizione da iper a fluorescenza ipo. Diversi strumenti forniscono questa funzionalità per il mouse; la strumentazione usata qui è descritto altrove 14. </li></ol> Cura 5. post-operatoria <ol><li> Applicare uno spesso strato di crema tripla oftalmica antibiotica alla superficie della cornea dell&#39;occhio iniettato. </li><li> Mettere i topi in gabbie pulite solitarie per il recupero. Non combinare i topi che hanno subito un intervento chirurgico fino a quando non sono completamente recuperati. </li><li> Monitorare la respirazione e la temperatura durante il recupero l&#39;anestesia. Monitorare gli animali fino a che non possono mantenere la decubito sternale. </li><li> Eseguire ulteriore monitoraggio post-operatorio adeguatoe il trattamento, compresa una iniezione sottocutanea di carprofen (5 mg / kg) per la gestione del dolore post-operatorio. </li></ol> 6. Valutazione della funzione della retina da Elettroretinografia (ERG) <ol><li> Eseguire l&#39;analisi ERG pre-iniezione e al momento opportuno dopo l&#39;iniezione come necessario per valutare la funzionalità della retina. Se l&#39;iniezione è stata fatta nello spazio sottoretinico, il distacco di retina dovrebbe risolvere entro 72 ore. <ol><li> Utilizzare le tecniche standard ERG per valutare la funzione della retina, prima e dopo l&#39;iniezione come descritto in precedenza 14,15. </li></ol></li></ol> 7. La ricostruzione 3D e quantificazione Bleb Volume NOTA: OCT scansioni con alto contrasto che comprende l&#39;intero distaccamento all&#39;interno della cornice di vista sono ottimali per l&#39;uso. ImageJ / Fiji 17,18 e Imaris sono stati utilizzati, ma altri software possono essere utilizzati. <ol><li> Esportare il B-scan di interesse, l&#39;importazione di ImageJ / Fiji e delle colture (Immagine&gt; Ritaglia) la porzione di sc ottobreuna a modellare utilizzando lo strumento di selezione rettangolare. <ol><li> Regolare il contrasto (Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto) e delineare eventuali limiti mancanti collegando due sezioni con una linea. </li><li> Tracciare una linea retta con il (spostamento di mantenimento) strumento linea che attraversa il RPE allo strato dei fotorecettori. Misura (Analizza&gt; Measure) la lunghezza della linea per ottenere le dimensioni di massima distacco per la fase 7.8. </li></ol></li><li> Importa fotogrammi al software 3D-ricostruzione rifilate (Vedi tabella dei materiali) utilizzando il &quot;RGB a grigio&quot; plugin e MATLAB Compiler Runtime. </li><li> Impostare la dimensione voxel (sotto Proprietà immagine) utilizzando i parametri di calibrazione dalla scansione OCT (x, y, z). </li><li> Eseguire il plugin &quot;RGB a Gray&quot; (sotto Proprietà immagine), con uguale ponderazione di ogni canale, di creare un quarto canale. Eliminare i canali rosso-verde-blu originali. </li><li> Invertire il canale di grigio utilizzando cambiamento contrasto. Image Store. </li><li> Fare clic su &quot;aggiungi unsuperficie ew &quot;pulsante nella scheda 3D-View, e iniziare il processo guidato 4 fase di creazione della superficie. <ol><li> Impostare il livello di dettaglio della superficie (passaggio 1 di 4). NOTA: Nella nostra esperienza 8,0-12,0 era la gamma più efficace. </li><li> Impostare la dimensione della sfera massimo (in Selezione Background) leggermente inferiore alla dimensione massima di distacco misurata in 7.1.2. Creare la superficie e annullare l&#39;inversione del canale grigio (fase 2 di 4). </li><li> Impostare la soglia al valore massimo per cui la superficie degli spazi negativi esterni della retina e il distacco non venga a contatto (passaggio 3 di 4). </li><li> Impostare il tipo di filtro per il numero di voxel e isolare lo spazio negativo nel sito distaccata dimensioni. Finire la superficie (fase 4 di 4). NOTA: Il volume della superficie di distacco si trova sotto il volume nella scheda statistiche. </li></ol></li></ol>

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A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

iniezioni sottoretiniche sono il metodo di scelta per la fornitura di vettori virali e terapia con cellule staminali di derivazione per manipolare fotorecettori e RPE sia nella ricerca di base e trattamento clinico. Nei pazienti, le iniezioni sottoretiniche sono in genere fatto con un sclerotomie anteriore alla pars plana, una vitrectomia nucleo posteriore e la penetrazione della retina per l&#39;ago con visualizzazione diretta. Come con la maggior parte delle procedure vitrectomia, è comune per la formazione di catara...

Iniezioni sottoretinico sono il mezzo principale di diffondere agenti cellulari e virali per le retine di topi per studiare i loro effetti sui fotorecettori e RPE sottostante 1,2. La maggior parte dei protocolli di iniezione subretiniche nei topi utilizzano un transcorneal o di un sito di iniezione anteriore transcleral all&#39;equatore (Figura 1). Questo approccio può causare danni collaterali intrinseca che comprende intaccare e opacità risultante della lente, rottura dell&#39;integrità del vitreo, la penetrazione della retina neurosensoriale e iris, emorragia retinica, consistenti distacchi di retina e duratura edema sottoretinico 3-9. Manipolazioni sperimentali devono superare questi effetti al fine di valutare gli effetti degli interventi terapeutici 3,7,10,11. Questo studio fornisce una descrizione dettagliata e la validazione di un metodo di iniezione transcleral posteriore che evita queste complicazioni, riduce al minimo il trauma e ha un alto tasso di successo di mira il subspazio della retina. Le iniezioni di targeting spazio sottoretinico nei topi sono spesso molto difficili da eseguire e la maggior parte ricercatori incontrano una alta frequenza di tentativi falliti in cui il vettore è consegnato in una posizione non corretta o non vi è significativo danni alla retina, per esempio in un distacco della retina completa 6. Il numero di occhi esclusi dall&#39;analisi a causa di complicazioni di iniezione non è di solito indicata in studi sui topi, ma nella nostra esperienza e nella discussione con altri ricercatori, il numero di iniezioni falliti può essere alto come il 50% e variare a seconda del esperienza e capacità del ricercatore che sta eseguendo le iniezioni. Il successo della iniezione è di solito valutata mediante imaging fundus diretta e / o tomografia a coerenza ottica (OCT) 7,9. Un metodo facilmente masterizzato con alte percentuali di successo per le iniezioni sottoretiniche nei topi può accelerare la sperimentazione e ridurre il costo di studi preclinici di treatments per le malattie della retina che sono le principali cause di cecità negli Stati Uniti. Il posteriore, transcleral tecnica di iniezione sottoretinico qui descritto è un adattamento da protocolli clinici e preclinici 9,12. Le valutazioni diagnostiche non invasive effettuate in topi iniettati dimostrano i danni lievi e altamente localizzato e non hanno l&#39;obiettivo ulteriori garanzie, lesioni della retina e RPE. Inoltre, con relativamente poco pratica, sperimentatore può conseguire questi risultati con un alto tasso di successo (80 - 90% o superiore), riducendo così i costi associati a tali studi. Questa procedura può essere utilizzata per fornire interventi terapeutici cellulari, virali o farmacologici a fotorecettori e / o RPE in studi preclinici e valutare facilmente interventi sperimentali.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Syringe x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0&quot;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Needles x 6</td></tr><tr><td>Vannas Curved Scissors</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blade</td></tr><tr><td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>Water Circulating Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercial</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Version 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Eye Drops (Rinse)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>Saline Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

iniezioni sottoretinico sono stati utilizzati con successo in entrambi gli esseri umani e roditori per fornire interventi terapeutici di proteine, agenti virali, e le cellule al interphotoreceptor / vano sottoretinico che ha l&#39;esposizione diretta ai fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE). iniezioni sottoretinico di plasminogeno così come recenti studi preclinici e clinici hanno dimostrato la sicurezza e / o efficacia di erogare vettori virali e di cellule staminali per le persone con malattie della retina avanzata. modelli murini di malattie della retina, in particolare ereditaria distrofie retiniche, sono essenziali per testare queste terapie. La procedura di iniezione più comune nei roditori è utilizzare piccola transcorneal o incisioni transcleral con un approccio anteriore alla retina. Con questo approccio, l&#39;ago per l&#39;iniezione penetra la retina neurosensoriale interrompere il RPE sottostante e l&#39;inserimento può facilmente nick la lente, causando opacizzazione della lente e compromissione della imagi non invasivang. Accedere allo spazio sottoretinico attraverso un transcleral, approccio posteriore evita questi problemi: l&#39;ago attraversa la sclera circa 0,5 mm dal nervo ottico, senza penetrazione della retina ed evita interrompere il vitreo. danni collaterali è limitata a quella associata alla sclerotomie focale e gli effetti di un transitorio, sierosa distacco di retina. La semplicità del metodo minimizza lesioni oculari, assicura un rapido riattacco e recupero della retina, e ha un basso tasso di fallimento. Il minimo danno alla retina e RPE consente la chiara valutazione dell&#39;efficacia e degli effetti diretti degli stessi agenti terapeutici. Questo manoscritto descrive una tecnica di iniezione sottoretinico romanzo che può essere utilizzato per indirizzare vettori virali, gli agenti farmacologici, le cellule staminali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) allo spazio sottoretinico nei topi con elevata efficacia, danni minimi, e il recupero veloce.

Posteriori approccio iniezioni sottoretiniche transcleral sono state effettuate su 31 occhi sani da 16 topi wild type con iniezioni di 0,3 ml (n = 18), 0,5 ml (n = 8) e 1,0 ml (n = 5) di 0,01% fluoresceina. Un occhio è stato escluso dalla iniezione a causa di una opacità corneale pre-esistente che ha impedito l&#39;analisi strutturale e funzionale. Tutti gli occhi iniettati è incluso in questo rapporto. Nessun distacco della retina non intenzionali, punture della retina neurosensorial...

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An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Views.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Video: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Medicina

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Neuroscienze

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Vista rivitalizzante: terapia con cellule staminali per la degenerazione retinica

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

Autore in primo piano: Miglioramento del ripristino della vista - Terapia basata su cellule staminali per le malattie della retina 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Un metodo alternativo e validate iniezione per l'accesso ai sottoretinico Spazio

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10