Questo metodo può essere utilizzato per rilevare salmonella da campioni di alimenti e identificare l'agente patogeno a livello di ceppo attraverso il rilevamento genetico delle impronte digitali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina il rilevamento e la sottotipizzazione della Salmonella in un unico flusso di lavoro e riduce sostanzialmente i tempi di consegna dal campione alimentare contaminato da Salmonella all'impronta digitale dell'agente patogeno. Per iniziare, posizionare aseticamente un campione di cibo da 25 grammi all'interno di un sacchetto di frullatore da laboratorio sterile con un filtro incorporato o, facoltativamente, preparare un tampone ambientale inumidindo aseticamente una spugna con brodo di arricchimento, trascinandolo su una superficie predeterminata e posizionandolo all'interno di un sacchetto del frullatore.
Utilizzando un frullatore da laboratorio, mescolare accuratamente ogni campione con 225 millilitri di brodo di arricchimento del camper. Quindi incubare la miscela a 42 gradi Celsius per quattro o 21 ore. Successivamente, raccogliere un sottocampione da 50 millilitri di brodo di arricchimento dal lato filtrato del sacchetto.
Quindi centrifugare il sottocampione a 100 volte g per 10 minuti. Trasferire con cura il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare a 3.000-6.000 volte g per 10 minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet in cinque millilitri di BPW.
Rimostrare il pellet in cinque millilitri di BPW. In primo luogo, scongelare il tampone del campione e il buffer di reazione dal kit MDA sul ghiaccio. Posizionare un millilitro di cellule rimescolate in BPW e 20 microlitri di perline anti-Salmonella in un tubo di microcentrifugo.
Posizionare il tubo di microcentrifugo su un miscelatore rotante per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare il tubo su un supporto magnetico per tre minuti. Invertire più volte il rack magnetico per concentrare le perline in un pellet.
Mantenere il tubo sul rack magnetico, aspirare e scartare il supernatante. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al tubo. Rimuovere il supporto del tubo dal rack e invertire più volte il supporto del tubo per rimuovere eventuali batteri non specificamente leganti dal complesso.
Dopo il terzo lavaggio, aspirare il supernatante dal tubo e scartarlo. Quindi rimuovere il tubo dal rack magnetico e centrifugarlo per un secondo. Quindi posizionare il tubo sul rack magnetico per tre minuti prima di rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo.
Rimescolare i complessi di Salmonella di perline in nove microlitri di tampone del campione e incubare il tubo a 95 gradi Celsius per tre minuti. Dopo aver raffreddato i complessi sul ghiaccio, aggiungere nove microlitri di tampone di reazione e un microlitro di miscela enzimatica. Incubare il tubo in un ciclore termico secondo il protocollo di testo e raffreddare il tubo sul ghiaccio.
Successivamente, utilizzare uno strumento fluorospettrometrico per misurare la concentrazione e la purezza del DNA del campione. Conservare i prodotti finali a -20 gradi Celsius per esperimenti futuri. Preparare 18 microlitri di miscela PCR per campione secondo il protocollo di testo.
Quindi mescolare il prodotto MDA tubazionando delicatamente su e giù. Aggiungere due microlitri della sospensione del prodotto MDA alla miscela PCR. Utilizzando un protocollo PCR ottimizzato in tempo reale, eseguire la PCR in tempo reale in base al protocollo di testo.
Aggiungere soluzioni tampone e reagenti al prodotto MDA come specificato nel protocollo di testo e trasferire i 40 microlitri risultanti del prodotto MDA predisposto per il sequenziamento su una nuova piastra e aggiungere 20 microlitri di perline di purificazione PCR a ciascun pozzo. Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare le perline con l'80% di etanolo e asciugarle per 12 minuti.
Riprendono le perline essiccate in 53 microlitri di tampone di sospensione e incubano le perline per due minuti a temperatura ambiente. Infine, diluire e raggruppare le librerie secondo le istruzioni del produttore. In questo protocollo, la valutazione mirata della quantità di DNA di Salmonella è stata eseguita dalla PCR in tempo reale.
I risultati rappresentativi di due marche di petto di pollo contaminato da Salmonella variavano da 701,54 a 945,86 nanogrammi per microlitro, indicando che il DNA del campione è stato effettivamente amplificato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavare e maneggiare con cura le perline IMS, mantenere i reagenti MDA e i prodotti liberi da contaminanti e mantenere una cappa pulita. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della sicurezza alimentare e della salute pubblica per esplorare il monitoraggio rapido e ad alta risoluzione dei contaminanti della Salmonella nei campioni alimentari, negli ambienti dei prodotti e nelle catene di approvvigionamento.
Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni di origine alimentare può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale e seguire buone pratiche di laboratorio dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
