Questo progetto è stato di supporto in parte dalla Johns Hopkins University, ufficio del preposto attraverso il Gateway Science Initiative.

Nota: Il DNA di metagenomica è purificato dal suolo (Contea di Baltimore, Maryland) utilizzando un isolamento genomic di terreno disponibili in commercio kit (Vedi Tabella materiali). Utilizzando uno spettrofotometro UV (Vedi Tabella materiali), il DNA genomico purificato dovrebbe avere un rapporto di 260/280 (nm) &#62; 1.8 e un rapporto di 260/230 tra 2.0-2.2 per assicurare che il campione è esente dagli agenti inquinanti. La quantità di DNA genomico richiesto per NS varia da 200 ng a 2 µ g.
1. metodo di preparazione rapida libreria (protocollo corto)
Nota: Si tratta di un protocollo corto. Vedi Tabella materiali per il kit di sequenziamento rapido.
<ol>
	<li>In un 0,2 mL tubo con pareti sottili (Vedi Tabella materiali) aggiungere 200 ng di alto peso molecolare del DNA in una finale del volume di 7,5 µ l di acqua distillata.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 µ l di miscela di frammentazione (FM) dal kit di preparazione rapida libreria e mescolare delicatamente per inversione. Centrifuga di impulsi per rotazione verso il basso (1.000 x g per 5 s).</li>
	<li>Il campione viene posto in un termociclatore (Vedi Tabella materiali) per un round a 30 ° C per 1 min seguita da 75 ° C per un minimo di 1 rimuovere la centrifuga tubo e impulso a girare giù il campione.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di adattatore rapido e 0,2 µ l di mix master ligasi di blunt/TA e quindi memorizzare la libreria adattata e legata sul ghiaccio. Nota: Se si utilizza il protocollo corto procedere al passaggio 8</li>
</ol>
2. legatura sequenziamento Protocol (protocollo lungo): Metagenomica frammentazione del DNA
Nota: Vedi Tabella materiali per il kit di sequenziamento di legatura.
<ol>
	<li>Diluire 1 µ g di DNA genomico purificato ad un volume finale di 46 µ l in acqua deionizzata.</li>
	<li>Trasferimento il campione da una frammentazione del DNA del tubo (Vedi Tabella materiali) e centrifugare per 1 min a temperatura ambiente a 8.000 x g usando un microcentrifuge (Vedi Tabella materiali) per produrre frammenti genomic ~ 8 kb. Assicurarsi che tutto il liquido è passato nel tubo di raccolta.</li>
	<li>Capovolgere la provetta di frammentazione, ritorna alla centrifuga e centrifugare per 1 min raccogliere il DNA genomic frammentato nella camera inferiore.</li>
	<li>Trasferire il DNA genomic frammentato in una provetta di 1,5 mL sterile basso-DNA binding e analizzare una porzione su gel di agarosio (0,6%) bassa percentuale di frammentazione di confermare a &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. frammentazione DNA Genomic fine-preparazione
<ol>
	<li>Utilizzando 800 ng di DNA genomico frammentato in 45 µ l di acqua deionizzata, aggiungere 7 reazione di fine-prep µ l tampone (Vedi Tabella materiali), mix di enzima 3 µ l (Vedi Tabella materiali) e 5 µ l di nucleasi acqua gratis.</li>
	<li>Mix di inversione e impulso centrifuga (1.000 x g per 5 s).</li>
	<li>Trasferire il campione in una provetta di sottili di 0,2 mL e incubare il campione per 5 min a 20 ° C, seguita da incubazione a 65 ° C per 5 min.</li>
	<li>Centrifuga di impulso per portare contenuti verso il basso del tubo.</li>
	<li>Esempio di trasferimento di un tubo del microcentrifuge basso-DNA binding di 1,5 mL.</li>
	<li>Preparare biglie magnetiche (Vedi tabella dei materiali). Aggiungere 60 µ l di sedimento perline per la reazione di preparazione di fine da passo 3.5 e mescolare pipettando.</li>
	<li>Incubare su un mixer di rotatore a 100 giri/min (Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Impulso di centrifugare il campione per le perle di pellet, quindi posizionare il campione accanto a magnete.</li>
	<li>Una volta che le perle siano rispettate il magnete, pipettare off surnatante e scartare.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dalle perline magnete e lavare con 200 µ l di etanolo al 70% preparata pipettando delicatamente il campione di alti e bassi.</li>
	<li>Centrifuga di impulso per pellet le perline e tornare al magnete.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere la fase di lavaggio utilizzando 200 µ l di etanolo al 70%.</li>
	<li>Impulso di centrifugare la provetta, ritorna al magnete e rimuovere tutto il lavaggio di etanolo 70%.</li>
	<li>Aprire il coperchio del tubo del microcentrifuge, asciugare le perline per aria per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dal magnete e sospendere il pellet in 31 µ l di acqua sterile, privo di nucleasi. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Restituire il tubo al magnete fino a quando tutte le perline hanno pellettato e l'eluato è chiaro.</li>
	<li>Trasferire l'eluato in una microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzando 1 µ l di campione, quantificare il DNA fine-preparata utilizzando uno spettrofotometro UV a 260 nm (Vedi Tabella materiali). Nota: Il recupero percentuale deve essere ~ 70% (700 ng) da una concentrazione iniziale di 1 µ g di DNA genomic.</li>
</ol>
4. adattatore e Tether aggiunta di frammenti di DNA Genomic fine-prepped
<ol>
	<li>Mescolare tutti la ligasi di blunt/TA mix master tubi di inversione, e quindi di impulso centrifuga per portare il contenuto verso il basso.</li>
	<li>Utilizzando 30 µ l di DNA fine-prepped, aggiungere 20 µ l di miscela di adattatore e 50 µ l di mix master di legatura di blunt/TA.</li>
	<li>Mescolare per inversione, centrifuga di impulso e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
</ol>
5. magnetico Bead preparazione
<ol>
	<li>Vortice le perline e poi trasferire 50 µ l di perle sospese a un microfuge 1,5 mL tubo.</li>
	<li>Posizionare il tubo sul magnete per appallottolare le perline fino a quando l'eluato Cancella.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e scartare.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di tallone (Vedi Tabella materiali per kit per microsfere) ai talloni, vortice per risospendere le perle, a pellet le perline sul magnete, rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere il lavaggio con 100 µ l di tampone di associazione.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di perlina ai branelli lavati. Vortice per risospendere le perline.</li>
</ol>
6. Biblioteca purificazione
<ol>
	<li>Utilizzando una micropipetta P200, aggiungere 40 µ l di perline dal passaggio precedente per il DNA di genomic adattato/tethered. Mescolare accuratamente il campione di pipettaggio.</li>
	<li>Incubare il campione su un mixer di rotatore a 100 giri/min per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il campione sul magnete e consentire le perline a stabilirsi. Pipettare il sovranatante e scartare.</li>
	<li>Risospendere le perline in 140 µ l di tampone di associazione di perlina di pipettaggio. Posizionare il campione contro il magnete, scartare il surnatante e lavare nuovamente con un altro 140 µ l di tampone di associazione di tallone.</li>
	<li>Impulso Centrifugare la provetta, posizionare il tubo sul magnete per 2 min, rimuovere il buffer di associazione perlina rimanenti dal pellet.</li>
</ol>
7. eluizione della biblioteca dal magnete perline
<ol>
	<li>Risospendere i branelli magnetici in 15 µ l di tampone di eluizione di pipettaggio. Incubare il campione per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il tubo contro il magnete per appallottolare le perline.</li></ol>Quando la soluzione consente di cancellare, rimuovere 15 µ l di eluato e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL e posizionare il campione sul ghiaccio.
	<li>Quantificare la libreria utilizzando uno spettrofotometro UV. Nota: Il recupero percentuale dovrebbe essere ~ 25% (250 ng) da una concentrazione iniziale di 1 µ g di DNA genomic.</li>

8. un controllo di qualità/Run a partire
<ol>
	<li>Rimuovere la cella di flusso dalla confezione e collegare la cella di flusso per il sequencer portatile, in tempo reale (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Collegare il sequencer in un computer tramite cavo USB e avviare il software di sequencing (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Fare clic su "Connetti" dispositivo attraverso il software di sequencing, selezionare "NC_Platform_QC.py" e cliccare su "Start".</li>
	<li>Il controllo qualità (QC) dura circa 6-7 min per completare; cercare un 'mare di verde' (ampie zone di uscita) sulla lettura QC per confermare che ci sono abbastanza attivi pori (&#62; 800) sequenziamento del DNA.</li>
</ol>
9. iniziare una corsa di sequenziamento
<ol>
	<li>Aprire il programma di sequenziamento; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Nella casella ID del campione, il nome del campione.</li>
	<li>Fare clic sulla casella "Flusso Cell ID" e inserire il codice trovato sull'adesivo sulla parte superiore della cella di flusso.</li>
	<li>Aprire il coperchio di cella di flusso e quindi far scorrere il coperchio della porta a destra (senso orario) affinché nel pozzetto del campione è visibile. Una volta che la porta è aperta, verifica per una piccola bolla. Rimuovere alcuni microlitri di buffer inclusa la bolla.</li>
	<li>Controllare per essere sicuri che c'è buffer in tutta la matrice del sensore. Fare il buffer di adescamento mescolando 480 µ l di tampone di corsa con mix di combustibili (RBF-1, vedere la Tabella materiali) (essere sicuri di mescolare accuratamente prima) con acqua priva di nucleasi di 520 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 800 µ l di buffer di adescamento per il porto di adescamento. Sollevare con cautela il coperchio "SpotOn" per renderlo accessibile.</li>
	<li>Dopo 5 minuti, aggiungere un ulteriore 200 µ l di tampone di adescamento per il porto di adescamento.</li>
</ol>
10. caricamento della libreria
<ol>
	<li>Prima di preparare il posto di biblioteca i seguenti reagenti sul ghiaccio: RBF-1 (dal kit di sequenziamento), adattato e tethered libreria e libreria di caricamento Perline (LLB; dal kit di sequenziamento).</li>
	<li>In una provetta da centrifuga 0,2 mL, aggiungere µ l 25,5 di RBF e 12 µ l di acqua priva di nucleasi conservato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Miscelare la LLB pipettando alti e bassi. Aggiungere 26,5 µ l di LLB al tubo 0.2 µ l. Mescolare i reagenti pipettando alti e bassi. Nota: La LLB tende a depositarsi fuori la miscela.</li>
	<li>Aggiungere 11 µ l della biblioteca adattata e legata al tubo 0.2 µ l. Mescolare per inversione e spin mediante centrifugazione di impulso.</li>
	<li>Aggiungere 75 µ l di campione dal passaggio 9.4 alla porta "SpotOn" goccia a goccia. Assicurarsi che ogni goccia scorre nella porta prima di aggiungere il successivo.</li>
	<li>Con attenzione sostituire il coperchio porta campione in modo che il tappo entra nel porto e sostituire il coperchio del dispositivo.</li>
</ol>
11. a partire uno Script di protocollo Software di Sequencing
<ol>
	<li>Aprire il menu a discesa sotto 'Selezionare Program' e selezionare "sequenziamento di 48 ore."</li>
	<li>Fare clic sul pulsante "Esegui" per avviare lo script.</li>
	<li>Controllare i risultati di scansione Mux segnalato nel flusso di notifica per il numero di pori attivi la scansione MUX. Nota: Questo numero può essere diverso dal numero di pori nel CQ e una grande differenza potrebbe indicare un problema.<ol>
		<li>Se c'è una significativa riduzione dei pori attivi dalla pista di QC, riavviare il software e se c'è ancora una differenza significativa, riavviare il computer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controllare che la temperatura del dissipatore è 34 ° C, come riportato dallo script di software di sequencing. Nota: Se la temperatura è non a 34 ° C quindi ci non sarà abbastanza attivi pori per la corsa.</li>
	<li>Controllare l'istogramma di lettura lunghezze per determinare se le lunghezze di sequenza sono attesi e appropriato per il disegno sperimentale.</li>
	<li>Chiudere l'agente desktop utilizzando 'Chiudi x.' Quit il software di sequencing chiudendo il web GUI. Scollegare il dispositivo dal computer.</li>
</ol>
12. analisi dell'esecuzione e i risultati
Nota: Durante l'esecuzione di sequenziamento, i dati possono essere monitorati utilizzando il programma di "Visualizza REPORT" utilizzando l'agente di desktop. Durante o dopo che viene completata l'esecuzione, i file sono disponibili in un formato di file di dati → legge → passare cartella (default) di FAST5. Se questa cartella è aperta mentre è attivo il sequenziamento, potrebbe bloccare il computer.
<ol>
	<li>Per visualizzare e manipolare sequenze, scaricare un "HDFViewer".</li>
	<li>Per visualizzare i file di sequenziamento, aprire direttamente l'HDF visualizzatore → Apri dati cartella → Seleziona che tutti i file tipi → selezionare c: auto (impostazione predefinita) → selezionare dati → selezionare letture → selezionare pass.</li>
	<li>Trovare e selezionare il file FASTQ nel menu a discesa di sinistra; file verranno aperto e possono essere salvati in formato FASTQ. Nota: Ai fini dell'esperimento di studente, sequenze di 350 nucleotidi o più sono stati selezionati per ulteriori analisi. Uscita dalla chiamata base permette all'utente di ordinare letture sequenza basate sulla dimensione. I file FASTQ possono essere analizzati tramite BLAST (NCBI) o altri programmi di bioinformatica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Molti metodi di sequenziamento di generazione successiva sono stati generati e ognuno dipende dal sequenziamento di sintesi ma le piattaforme di rilevamento per l'identificazione dei nucleotidi differiscono. NS, la più recente aggiunta al marketplace, utilizza un metodo diverso completamente, che non richiede una reazione di sequenziamento o etichettati nucleotidi. Questo metodo si avvale del differenziale di costo di nucleotidi già incorporati che passano attraverso un poro elettrificato. L'identificazione di ogni nucleotide si verifica da una modulazione della corrente elettrica dalle basi diverse che passano attraverso il nanoporo. Questo sistema multiplex consente all'utente di molti frammenti di sequenza in un momento. Sequenziando entrambi i filamenti del DNA, la precisione della sequenza è aumentata significativamente e il software di sequencing, che possa essere caricato su un computer portatile, elabora i segnali e fornisce le informazioni di sequenza che possono essere analizzate.
Nel pyrosequencing, una sequenza di metodo di sintesi (SBS), rilevamento della base specifica incorporata nel modello dipende l'analisi di luciferase e la generazione di segnali chemiluminescente8. Nel sequenziamento di semiconduttore di ioni, gli ioni di idrogeno liberato, che fa diminuire il pH viene rilevato da un sensore di ioni9. Sequenziamento in tempo reale di singola molecola dipende la zero modalità onda guida (ZWD)10, che si illumina per il rilevamento di una molecola fluorescente contrassegnata per il nucleotide incorporato. SBS utilizza un metodo unico per amplificare il DNA dell'obiettivo tale che sono aggregati di sequenze uniche generato13. Rilevamento del nucleotide aggiunto si ottiene quando viene registrata la fluorescenza del nucleotide taggato. NS ha d'altra parte il vantaggio unico rispetto ad altri metodi in quanto richiede risorse tecniche limitate, è portatile, produce lunghe letture di sequenziamento, non richiede nessuna previa amplificazione di DNA e può essere azionato a costi ridotti rispetto ad altri metodi. I nostri studenti hanno trovato il protocollo di preparazione più recente, rapido libreria per essere semplice e suscettibili di una classe di laboratorio di tre ore. Alcuni dei problemi che abbiamo incontrato erano bolle nella cella di flusso che erano difficili da rimuovere, ha richiesto la potenza del computer significativo (un terabyte di spazio di archiviazione), la corrente di uscita dei dati è in un file di FAST5 e la cella di flusso di sequenziamento ha una durata limitata prima di esso si deteriora. Inoltre, altri svantaggi del NS legatura sequenziamento protocollo (protocollo lungo) è che richiede diversi passaggi di preparazione di biblioteca, richiede competenze nelle tecniche di biologia molecolare e genera la fedeltà di sequenziamento ridotta rispetto ad alcuni metodologie di sequenziamento3. Tuttavia, recenti progressi con il nuovo kit di preparazione rapida libreria richiede solo 10 minuti per la preparazione di biblioteca e ha dimostrato un tasso di errore ridotto sequenziamento. Il nuovo metodo di preparazione di biblioteca era molto favorevole per l'uso in una classe di laboratorio.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, in particolare in QC di cella di flusso. Questo include l'esecuzione di un controllo di qualità iniziale entro cinque giorni dal ricevimento della cella di flusso e il loro utilizzo entro 8 settimane. Anche se abbiamo usato le cellule di flusso sono stati oltre 8 settimane, il numero di pori aperti/attivo è notevolmente ridotto. È importante che gli esperimenti sono programmati per un diario dove si ottiene il massimo utilizzo di celle di flusso. Abbiamo utilizzato il protocollo di pulizia e riutilizzato le cellule di flusso con successo.
Studiando la metagenomica del rappresentano terreno un serbatoio genetico non sfruttato della diversità microbica. Ad esempio, un grammo di suolo si stima che contenga tra 107 - 109 cellule procariotiche14. Inoltre, gli organismi del terreno sono la principale fonte di nuovi prodotti naturali, enzimi e antibiotici. Così, analisi di sequenza del DNA Metagenomica del suolo rappresenta un prezioso strumento didattico per studenti di ogni livello di istruzione. La tecnologia di NS facilità d'uso e basso costo rendono questo sistema uno strumento didattico molto efficace. Gli studenti possono campioni ambientali di sequenza e al completamento della sequenza di utilizzare strumenti di bioinformatica disponibili per identificare e caratterizzare i microbi e metagenomica sequenze in campioni di prova. Utilizzando la tecnologia di NS, gli studenti hanno vera esperienza hands-on, che ha fino ad ora stato di raggiungere per uso nei corsi di laboratorio a causa delle competenze tecniche avanzate e alti costi di reagente, attrezzature e manutenzione in altre piattaforme di sequenziamento. Recentemente, uno dei nostri studenti (J. Harrison, comunicazione personale) ha riferito l'uso di questa tecnologia in un progetto di monitoraggio ambientale dei suoli di fattoria. Ci aspettiamo che ci saranno molte altre applicazioni per questa tecnologia nello spazio di formazione.

L'obiettivo di questa procedura è per illustrare i passaggi necessari per la preparazione di una libreria di DNA ambientale per la sequenziazione, l'utilizzo di un dispositivo di sequenziamento nanopore flusso delle cellule e di eseguire analisi delle sequenze del DNA generate utilizzando il software di sistema e Centro nazionale per gli strumenti di bioinformatica Biotechnology Information (NCBI) per identificare la specie microbica nel suolo. Attualmente, la maggior parte delle piattaforme di sequenziamento del DNA richiedono un investimento importante nella formazione tecnica e strumentazione complessa, che non è fattibile in ambienti poveri di risorse o in applicazioni sul campo. La piattaforma di sequenziamento (NS) nanopore elimina questi problemi con un costo conveniente, semplice da utilizzare il protocollo di preparazione di biblioteca e un dispositivo portatile per sequenza e analizzare una varietà di diversi tipi di acidi nucleici1,3. Abbiamo incorporato la piattaforma di NS in diversi corsi di laboratorio per gli studenti di laurea magistrale.
NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha dimostrato ampie applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di patogeni batterici e virali1,2,6, biodiversità ambientale studi, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomic3,5e caratterizzazione di batteri antibiotico-resistenza4. NS è un metodo veloce e preciso per gli acidi nucleici di sequenza che si basa sul principio del "filo di sequenziamento" rilevando perturbazioni elettriche di basi nucleotidiche individuali quando DNA a singola elica passa attraverso una nanopore inserita electrified membrana polimerica sintetica. I passaggi coinvolti nella preparazione di DNA per NS includono frammentazione del genoma, fine riparazione e 3' dA-tailing di frammenti genomic, adattatore e ricottura di legare al DNA, DNA biblioteca purificazione e caricamento della libreria nel dispositivo di cella di flusso nanopore. Frammentazione del genoma in ~ 8 kb di dimensioni avviene mediante centrifugazione 1-2 µ g di DNA genomic attraverso un tubo di frammentazione del g-tubo. Le estremità genomiche frammentate sono poi riparate e dalla coda con dA poli utilizzando un kit disponibile in commercio. Sequenze di singolo adattatore non recuperabili, che sono compatibili con la proteina motore nanoporo, vengono aggiunti alle estremità del DNA che sono usate per guidare la sequenza di DNA attraverso il nanoporo (Figura 1). Le sequenze di tether sono necessari per purificazione del DNA e per localizzare le molecole di DNA alla membrana poro. Il tornante viene generato legando un adattatore tornante a un'estremità della coda dA biblioteca. Le strutture di tornante alle estremità del DNA permette la lettura dei filamenti senso e antisenso come il DNA passa attraverso il nanoporo (Figura 2). La libreria genomica preparata viene quindi purificata dalla reazione utilizzando streptavidina perline usando un campo magnetico, in seguito caricando il campione nella cella di flusso nanoporo per l'analisi.
Il DNA di sequenza è valutato per la qualità e letture di sequenziamento che sono accettabili per l'analisi sono quindi sottoposti a diversi strumenti di bioinformatica per identificare i microbi. Le sequenze sono "tradotti" in un FASTQ da un formato di FAST5. Nel formato FASTQ, le sequenze possono essere utilizzato quindi nell'analisi BLAST.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:625px;" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:124px;">LifeECO</td>
			<td style="width:119px;">BTC42096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Covaris g-TUBE</td>
			<td style="width:124px;">Covaris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">520079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">E7546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyOne C1 Strepavidin Beads</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Model 5420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop UV spectrophotometer</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td>Model 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power Soil DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:124px;">MO BIO</td>
			<td style="width:119px;">12888-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ligation Sequencing Kit 2D</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-LSK208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AmPure XP Magnetic Beads</td>
			<td style="width:124px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basic Starter Pack&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Includes MinION&#160; Sequencing Device and Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinKNOW software</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td style="width:167px;">Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

In questo articolo vengono descritti i passaggi per la costruzione di una libreria di DNA dal suolo, preparazione e utilizzo di cella di flusso nanoporo e l'analisi delle sequenze del DNA identificato utilizzando software per computer. Sequenziamento del DNA nanopore è una tecnica flessibile che permette il sequenziamento del genoma microbico rapido identificare le specie batteriche e virali, per la caratterizzazione di ceppi batterici e per rilevare le mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli antibiotici. I vantaggi di nanopore sequenziamento (NS) per le scienze biologiche includono la bassa complessità, costi ridotti e in tempo reale rapido sequenziamento del DNA genomico purificato, ampliconi PCR, campioni di cDNA o RNA. NS è un esempio di "sequenziamento strand", che coinvolge il sequenziamento DNA, guidando una singola molecola di DNA incagliata attraverso una nanopore che viene inserita in una membrana di polimero sintetico. La membrana ha una corrente elettrica applicata attraverso di esso, così come le basi individuali passano attraverso il nanoporo la corrente elettrica è interrotta a vari gradi di quattro basi nucleotidiche. L'identificazione di ogni nucleotide si verifica rilevando la caratteristica modulazione della corrente elettrica dalle basi differenti, che passano attraverso il nanoporo. Il NS sistema consiste di un palmare, alimentato via USB dispositivo portatile e una cella di flusso monouso che contiene una matrice di nanopore. Il dispositivo portatile si inserisce in un computer portatile standard che legge e registra la sequenza di DNA mediante software per computer.

La tecnologia di progettazione e nanopore sperimentale ha fornito un metodo veloce e poco costoso per studenti al suolo del DNA di sequenza. Il rappresentanza Esegui passati i parametri di controllo di qualità con più di 800 pori disponibili per il sequenziamento. La corsa ha provocato oltre 125.000 letture disponibili per lo studio con una lunghezza di sequenza mediano di 5,38 kb. Sequenze sono dato un punteggio di qualità e quindi sono stati analizzati solo quelle sequenze con punteggi accettabile. Come output il sequenziamento reazione è in formato FAST5, che non è accettato da programmi come BLAST (NCBI), le sequenze sono state visualizzate nel Visualizzatore di HDF che converte le sequenze FASTQ formato, che è compatibile per analisi BLAST. In futuro le iterazioni del software, i dati saranno disponibili come formato FASTQ, eliminando la necessità per il Visualizzatore HDF. Vedi supplementari figure 1, 2 e 3.
Cinquanta sequenze di oltre 350 nucleotidi di lunghezza sono stati oggetto di analisi da BLASTN (nucleotidi nel database del nucleotide) o BLASTX (nucleotidi tradotte in sequenza dell'amminoacido) (NCBI) per identificare gli organismi nel campione di terreno. Dato il tempo vincoli di classe e che l'obiettivo del corso è su metodi di laboratorio e non bioinformatica, abbiamo gli studenti analizzare sequenze all'interno di questi parametri. Le nostre lezioni di bioinformatica possono utilizzare i dati per lo sviluppo di strumenti di analisi della pipeline. Questo livello di analisi bioinformatica non rientra nella classe di tecniche di laboratorio. Tabella 1 è un elenco degli organismi che sono stati identificati con i valori e di meno di 4 e-04. In genere, e-valori inferiori a 4 e-04 indicano forte somiglianza tra la sequenza di input (query) e la sequenza corrispondente. Gli organismi identificati da BLASTN (contro il database non ridondante (nr)) sono da una grande varietà di specie e sono disponibili per ulteriori genomica e analisi di proteine. Questo campione di terreno, che è venuto da un giardino in Contea de Baltimora, MD non era mai stato testato, quindi non c'erano nessun precedente dato da cui partire per determinare che cosa potrebbero essere organismi nel suolo. BLASTN analisi (contro il database nr) analisi inoltre ha indicato c'erano sequenze con alcuna somiglianza nel database nr. Per determinare se questi sono veramente nuove sequenze, ulteriore studio è necessario. L'analisi delle numerose sequenze di BLASTX ha rivelato parecchie proteine da organismi non rappresentati nell'analisi BLASTN. La tabella 2 elenca parecchie proteine possibili compreso endopeptidasi e proteine ATPasi-like. Utilizzando questa libreria di sequenze, gli studenti hanno l'opportunità di utilizzare più sofisticati strumenti di bioinformatica per eseguire ulteriori analisi, se diretto dall'istruttore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparazione libreria genomica. Fasi per la preparazione della libreria di DNA genomico per la sequenza utilizzando la tecnologia nanopore. Questa figura è stata modificata con le necessarie autorizzazioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figura 2 . Schematica di sequenziamento del DNA usando una nanopore. DNA passando attraverso una membrana nanopore con identificazione di base e di generazione di segnale elettrico. Questa figura è stata modificata con le necessarie autorizzazioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismo</td>
			<td>valore e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00 E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00 E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00 E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00 E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novella</td>
			<td>1.00 E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00 E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00 E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0, 00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00 E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: risultati selezionati di analisi BLASTN. Sequenze di DNA di metagenomica del suolo sottoposte a ricerca per analogia BLASTN contro il database non ridondante del nucleotide NCBI. I dati riportati hanno e-valori di 4 x e-4 o meno.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteina</td>
			<td>Organismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteina ipotetica</td>
			<td>Acidobacter batterio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM dipendente metiltransferasi</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPasi</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidasi</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteina di lisi</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: risultati selezionati di analisi BLASTX. Sequenze di DNA di metagenomica del suolo sottoposte a ricerca per analogia BLASTX contro il database di proteine non ridondante di NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Supplementare figura 1: risultati delle piattaforma QC. Vengono presentati i risultati della piattaforma QC. In alto a destra sono i risultati di QC per pori attivi. Ogni quadrante della cella di flusso è testato per i pori attivi. La pagina principale è dinamica e cambia come ogni quadrante è testato. In questa esecuzione, 1.414 singoli pori sono stati rilevati.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Supplementare nella figura 2: conversione FAST5 in file FASTQ. Ecco l'output dei dati dalla pista di sequenziamento sul lato destro. Ogni riga rappresenta una sequenza individuale. Il lato sinistro della figura mostra la sequenza evidenziata dal lato destro, nel Visualizzatore di HDF che converte la sequenza in un file FASTQ che può essere utilizzato per ulteriori analisi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Supplementare nella figura 3: sequenza di esempio di FASTQ nel Visualizzatore HDF. Questa sequenza (leggi 803) è in un file FASTQ che converte i dati di FAST5 in nucleotidi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l'identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopore è dimostrata.

Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

30.1K Views.  Johns Hopkins University. NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l'identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopo...

Video: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

Progettazione e funzionamento di un continuo<sup&gt; 13</sup&gt; C e<sup&gt; 15</sup&gt; N Etichettatura Camera di Uniform o differenziale, metaboliche e strutturali, Flora Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Ricerca

Ambiente

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

Protocollo sperimentale per eterogeneità del terreno manipolazione Plant-indotta

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

Un protocollo per la raccolta e la costruzione del suolo lisimetri core

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Una tabella soffietto Thermogradient di controllo della temperatura del suolo per la valutazione di crescita delle piante e monitoraggio processi del suolo

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes onto humans. For this reason, transferable pesticide residue experiments are required for registration and re-registration by the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although such experiments are required, limited specificity is required pertaining to experimental approach. Experimental approaches used to assess pesticide transfer to humans including hand wiping with cotton gloves, modified California roller (moving a roller of known mass over cotton cloth) and soccer ball roll (ball wrapped with sorbent strip) over three treated turfgrass species (creeping bentgrass, hybrid bermudagrass and tall fescue maintained at 0.4, 5 and 9 cm, respectively) are presented. The modified California roller is the most extensively utilized approach to date, and is best suited for use at low mowing heights due to its reproducibility and large sampling area. The soccer ball roll is a less aggressive transfer approach; however, it mimics a very common occurrence in the most popular international sport, and has many implications for nondietary pesticide exposure from hand-to-mouth contact. Additionally, this approach may be adjusted for other athletic activities with limited modification. Hand wiping is the best approach to transfer pesticides at higher mowing heights, as roller-based approaches can lay blades over; however, it is more subjective due to more variable sampling pressure. Utility of these methods across turfgrass species is presented, and additional considerations to conduct transferable pesticide residue research in turfgrass systems are discussed.

Transferable pesticide residue experiments in turfgrass systems are integral components of human risk exposure assessments. Experimental approaches to measure transferable residues should be adjusted to the human interaction of interest and turfgrass system dynamics. Three transferable pesticide residue protocols are presented and the suitability across three turfgrass systems is discussed.

Protocolli per la quantificazione residui di antiparassitari Valori in Turfgrass Sistemi

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Misura e mappatura modelli di erosione e deposizione relazionati al suolo carbonato concentrazioni sotto gestione agricola

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several limitations that have resulted in the exclusion of many species. Advances in the field over the last two decades have led occupational health researchers to turn to molecular-based approaches for identifying fungal hazards. These methods have resulted in the detection of many species within indoor and occupational environments that have not been detected using traditional methods. This protocol details an approach for determining fungal diversity within air samples through genomic DNA extraction, amplification, sequencing, and taxonomic identification of fungal internal transcribed spacer (ITS) regions. ITS sequencing results in the detection of many fungal species that are either not detected or difficult to identify to species level using culture or microscopy. While these methods do not provide quantitative measures of fungal burden, they offer a new approach to hazard identification and can be used to determine overall species richness and diversity within an occupational environment.

Determining the fungal diversity within an environment is a method utilized in occupational health studies to identify health hazards. This protocol describes DNA extraction from occupational air samples for amplification and sequencing of fungal ITS regions. This approach detects many fungal species that can be overlooked by traditional assessment methods.

Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...