Name: organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
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Gli autori vorrei ringraziare Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) per il suo lavoro preliminare nello sviluppo del protocollo. Gli autori inoltre vorrei ringraziare Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) per la sua competenza tecnica e assistenza con le riprese e la produzione della parte audio/visivo del manoscritto. Daniel Andrews è stato sostenuto da finanziamenti da MSVU e scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) tramite un Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal è sostenuta da una sovvenzione di scoperta di NSERC.

Nota: Per le fasi di embrione, utilizzano l'Hamburger e Hamilton12 (HH) tabella di gestione temporanea.
1. embrione incubazione
<ol><li>Incubare uova di gallina fertilizzate in un'incubatrice sterile, termostatato a 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% di umidità.</li>
	<li>Girare le uova 1 x al giorno e consentire loro di incubare a HH34 (post-fecondazione 8 giorni).</li>
</ol>2. preparazione e sterilizzazione dei materiali
<ol><li>Per 12 embrioni, autoclave 2 L di acqua distillata, 1 L di soluzione salina allo 0,85% pulcino, 12 pipette in vetro, 1 scatola di carta velina, 24 2,5 x 2,5 cm quadrati di carta da filtro semi-porosa e piazze 24 2,5 x 2,5 cm di filo d'acciaio della maglia con i bordi curvi verso il basso. Per sterilizzare i materiali, autoclave a 121 ° C per almeno 15 min. Nota: La sterilizzazione in autoclave dei materiali può essere fatto in anticipo.</li>
	<li>Sterilizzare l'incubatrice con etanolo al 70% pulendo i fianchi, mensole e porta. Posto 2 contenitori di plastica contenenti in autoclave acqua distillata acqua all'interno dell'incubatrice per mantenere l'umidità. Preriscaldare l'incubatore di coltura a 37 ° C ± 1 ° C e circa il 40% di umidità. Garantire che l'incubatrice è completamente buia; Se la porta è trasparente, coprire con carta stagnola.</li>
	<li>Preriscaldare 100 mL di terreno nutritivo e 1 mL di penicillina inserendoli nell'incubatrice cultura.</li>
	<li>Coprire l'area di lavoro con un tovagliolo di carta e sterilizzare la panchina spruzzando con etanolo al 70%. Sterilizzare 2 paia di pinze, forbici di dissezione, una lama di rasoio e un cucchiaio di plastica con etanolo al 70% in un modo simile.</li>
	<li>Capsule di Petri sterili 100 mm posto 12 e 24 capsule di Petri sterile 35 mm sul banco per l'uso. Garantire che i piatti rimangono in un sacchetto sterile fino all'utilizzo.</li>
</ol>3. embrione preparazione
Nota: Da questo punto in poi, indossare una maschera protettiva polvere per evitare di contaminare le culture. Un'infezione batterica o fungina rovinerà la cultura e c'è il rischio che si sta diffondendo rapidamente a tutte le culture nell'incubatrice.
<ol><li>Crack aprire l'uovo e trasferimento dell'embrione in una capsula Petri 100 mm contenente soluzione fisiologica allo 0,85% pulcino. Fase dell'embrione secondo le caratteristiche anatomiche descritte in Hamburger e Hamilton stadiazione linee guida12 e confermare l'embrione è a HH34.</li>
	<li>Tagliare il collo e poi bisecare la testa dell'embrione al midline usando una lama di rasoio sterilizzata. Utilizzando pinze sterili, rimuovere il cervello. Lasciare intatto il becco.</li>
</ol>4. cultura Setup
<ol><li>Posto 2 dei piatti Petri 35 mm all'interno di una capsula di Petri di 100 mm.</li>
	<li>Collocare una rete metallica in acciaio all'interno di ogni scatola di Petri 35 mm.</li>
	<li>Usando il forcipe, trasferire 1 delle teste diviso in due per un pezzo di carta da filtro semi-porosa 2,5 x 2,5 cm con l'occhio rivolto verso l'alto. Garantire il tessuto è sicuro e non scivolare inclinando leggermente.</li>
	<li>Usando il forcipe, collocare attentamente tessuto oculare e il filtro di carta sopra la maglia di filo di acciaio in 1 il 35mm piastre Petri, creando un palcoscenico rialzato con il tessuto dell'occhio sulla parte superiore.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.3 e 4.4 con l'altra metà testa.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di vetro sterile, aggiungere cautamente mezzo nutritivo direttamente in ogni capsula di Petri 35 mm fino a quando non raggiunge il livello della carta da filtro. Non immergere la testa mezza in mezzo nutritivo.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di 10.000 U/mL penicillina-streptomicina per il terreno di coltura in ogni capsula di Petri.</li>
	<li>Piegare un pezzo di carta velina in una piccola piazza e posizionarlo all'interno il 100mm di Petri. Inumidire con acqua distillata in autoclave.</li>
	<li>Inserire la piastra di coltura sterile, scuro incubatore a 37 ° C ± 1 ° C e circa il 40% di umidità per fino a 4 giorni.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3 e 4 per ciascun embrione. Nota: Il numero di embrioni necessari dipenderà l'esperimento specifico; qui, descriviamo il protocollo per 12 embrioni.</li>
</ol>5. cultura manutenzione
<ol><li>Una volta al giorno, rabboccare i contenitori di plastica nell'incubatrice con acqua distillata in autoclave.</li>
	<li>Controllo quotidiano di tutte le culture per infezioni batteriche o fungine. Culture che hanno disintegrato o in cui il mezzo ha cambiato colore sono infettate. Scarta tutte le culture che si sono infettate.</li>
</ol>6. fissazione
<ol><li>Dopo coltura, rimuovere tutti i piatti dall'incubatrice.</li>
	<li>Utilizzando un paio di pinze, rimuovere delicatamente l'occhio dalla carta da filtro, facendo attenzione a non per strappare il tessuto.</li>
	<li>Difficoltà tessuto oculare in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino durante la notte a 4 ° C: 1x o in formalina neutra tamponata al 10% durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Conservare il tessuto a 4 ° C in 1x tampone fosfato salino.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+the+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos:+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments.">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li><li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development.">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li><li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo.">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).</li><li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes.">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).</li><li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora:+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization.">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation:+implications+for+periodic+patterning.">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li><li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds.">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li><li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+take+on+an+old+story:+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation.">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells &amp; Materials. 26, 91-106 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues.">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).</li><li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products.">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+feather+follicles.">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).</li><li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones:+the+scleral+ossicles.">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick.">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li><li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li><li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development.">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo si avvale del tessuto consolidato tecniche di coltura per ottenere la crescita di un occhio di pollo da embrionale giorno 8 (HH34) in vitro per 4 giorni. Questo metodo di coltura griglia fu originariamente descritto da Trowell15. Abbiamo ottimizzato un protocollo da Pinto e di Hall 1991 Studio16 utilizzando una membrana semi-porosa con griglia per studiare segnali induttivi tra strati di tessuto separati del pollo embrionale occhio<sup class="xref...

Il pollo embrionale (Gallus gallus) è un organismo di modello eccellente comunemente utilizzato nel campo della biologia. Il periodo di incubazione è di circa 21 giorni e molte uova possono essere incubate contemporaneamente, rendendo sperimentazione rapido ed efficiente. Forse la cosa più importante, l'embrione è anche facilmente manipolabili, consentendo il vasto studio chiavi dei processi di sviluppo e dei geni e proteine che guidano questi processi.
L'occhio di pollo embrionale è un organo complesso che si sviluppa attraverso l'interazione di un numero di diversi tessuti simili a molti altri sistemi del corpo. Questo metodo consente lo studio dello sviluppo di questi tessuti, specialmente nelle fasi avanzate di sviluppo. Ad esempio, la retina a più strati può essere di particolare interesse per coloro che studiano lo sviluppo del sistema nervoso. Metodi alternativi che permettono lo studio di altri tessuti dell'occhio come la cornea, il corpo vitreal, la lente, la sclera e le palpebre sono di beneficio ai ricercatori. L'occhio embrionali di pollo contiene anche una serie di ossa piatte, gli ossicini sclerali, che possono essere utilizzati come un modello per lo studio di induzione dell'osso intramembranous e ossificazione in vertebrati1.
Attualmente, ci sono una serie di metodi utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale. Microiniezioni di anticorpi inibitori o altre molecole inibitorie2,3, impiantato chirurgicamente microsfere imbevuto di inibitore4, e5 di elettroporazione sono tutti metodi che possono essere utilizzato per downregulate geni o le proteine di interesse in un embrione. Metodi simili vengono utilizzati per aumentare il proteine. Questi metodi non sono senza loro limitazioni. Ad esempio, quando si utilizza sostanze chimiche per alterare lo sviluppo embrionale, devono essere valutati gli effetti letali sull'embrione, e questo limita l'utilizzo di metodi di cui sopra per siti localizzati di applicazione a dosi sufficientemente basse per garantire la sopravvivenza della dell'embrione.
La coltura in vitro del tessuto è stata utilizzata in una vasta gamma di organismi nello studio dello sviluppo e può essere utilizzata per ignorare alcune delle limitazioni di cui sopra. Ad esempio, i femori6, piuma germogli7,8e membra9 del pollo sono tutti stati studiati usando il tessuto di coltura metodi, come hanno i testicoli dei mouse10 e le radici e gambi di piante11. Questi metodi concedono gli scienziati un alto grado di controllo sullo sviluppo dei tessuti, come la possibilità di variare la temperatura e alterare la disponibilità di nutrienti. L'isolamento del tessuto dall'embrione intero rende anche molto meno sensibili agli effetti letali di sostanze chimiche, consentendo in tal modo gli studi di manipolazione su scala globale a concentrazioni più elevate. Un altro notevole vantaggio di in vitro coltura è la conservazione dell'ambiente cellulare del tessuto; la disposizione dei tessuti rimane relativamente invariata, rendendo possibile lo studio delle interazioni tra tessuto differenti tipi9. Così, in vitro coltura apre le porte a ulteriori sperimentale si avvicina non è disponibile in modelli in vivo o in ovo .
Attualmente, studiare lo sviluppo dell'occhio embrionale pollo usando i prodotti chimici è particolarmente impegnativo. Una serie di Membrane Extraembrionali copertina l'embrione, che lo rende difficile applicare microsfere o prodotti chimici; l'embrione è anche molto attivo all'interno l'uovo come esso invecchia, complicando ulteriormente un metodo già difficile. Questo protocollo consente un facile accesso all'occhio e relativi tessuti circostanti, eliminando queste barriere, fornendo nel contempo nuove opportunità per esaminare i processi inerenti allo sviluppo all'interno dell'occhio. Questo protocollo è stato istituito per studiare l'induzione dei ossicles scleral all'interno dell'occhio embrionale.

<table><tbody><tr><td>35 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>100 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>paper tissue</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton</td></tr><tr><td>wire mesh</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)</td></tr><tr><td>disposable glass pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Borosilicate glass disposable 5 3/4&quot;</td></tr><tr><td>nutrient medium</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)</td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>semi-porous filter paper 90mm</td></tr><tr><td>fertilized chicken eggs</td><td>Dalhousie University Agricultural College</td><td>n/a</td><td>can be obtained from local farms</td></tr><tr><td>sodium chloride (NaCl)</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>sodium chloride crystals, reagent grade</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L pyrex autoclavable glass bottle</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% molecular biology grade</td></tr><tr><td>tupperware containers</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>disposable razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)</td></tr><tr><td>plastic spoons</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>dust mask</td><td>3M</td><td>n/a</td><td>3M 8500 Comfort Mask</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>paraformaldehyde, reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>neutral-buffered formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>72210</td><td>10% neutral buffered formalin</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.4mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>presterilized centrifuge tubes</td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>fine forceps</td></tr><tr><td>chick saline&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>n/a&amp;nbsp;</td><td>0.85% NaCl</td></tr><tr><td>tinfoil</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr><tr><td>paper towel</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr></tbody></table>

organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues

Il pollo embrionale è comunemente utilizzato come organismo modello affidabile per lo sviluppo dei vertebrati. L'accessibilità e l'incubazione breve periodo lo rende ideale per la sperimentazione. Attualmente, lo studio di queste vie inerenti allo sviluppo nell'embrione di pollo è condotto applicando inibitori e farmaci presso siti localizzati e alle concentrazioni basse utilizzando una varietà di metodi. La coltura in vitro del tessuto è una tecnica che consente lo studio dei tessuti separati dall'organismo ospite, evitando contemporaneamente molte delle limitazioni fisiche presenti quando si lavora con interi embrioni, come la suscettibilità degli embrioni per alte dosi di sostanze chimiche potenzialmente letale. Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per coltura l'embrionale pollo mezza testa in vitro, che presenta nuove opportunità per l'esame dei processi di sviluppo oltre i metodi attualmente stabiliti.

Utilizzando questo metodo, un occhio di pollo embrionali possa essere coltivato dal giorno 8 del suo sviluppo (HH34) in vitro per 4 giorni. Quattro giorni di sviluppo in ovo corrisponde a HH38.
Questo metodo di coltura supporta lo sviluppo di germogli di piuma che circondano l'occhio e sulle palpebre (Figura 1B). Questi germogli di piume non sono presenti in ovo a HH34 pri...

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Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell'ambiente di cultura.

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Views.  Mount Saint Vincent University. Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell'ambiente di cultura.

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Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Ottimizzato<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Neuroscienze

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Una revisione completa dei protocolli di coltura di espianti di pelle embrionale aviaria

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Autore in primo piano: Approfondimento sulle attuali metodologie sperimentali di espianti di pelle aviaria

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

Riepilogo

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Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti