Name: organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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Vorremmo ringraziare i membri del gruppo di oncologia ginecologica per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è in parte sostenuto da un finanziamento dal National Health and Medical Research Council, l&#39;Australian Research Council, e il Cancer Institute NSW (PST). MK è un destinatario della University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e etica animale dell&#39;Università di Newcastle e confermato alla legge New South Wales Animal Research, Galles regolamento sugli animali del Sud, e il codice australiano per la cura e uso di animali a fini scientifici. Tutte le procedure intraprese sui topi sono stati approvati dal Comitato Etico e Cura degli animali dell&#39;Università di Newcastle. 1. Il tempo di accoppiamento <ol><li> Pair 6 - 8 settimane di vita maschi e femmine di topo appena prima della fine del ciclo di luce diurna. </li><li> Controllare le femmine per la presenza di tappi vaginali mattina presto (entro il 08:00), tutti i giorni. Giorno della spina è considerato come 0,5 dpc. </li><li> Trasferire il femminile con la spina vaginale in una nuova gabbia (senza maschile) ed etichettare la data di presa. </li></ol> 2. Isolamento embrionali di topo gonadici Ridges <ol><li> Isolare embryon del mouseic creste genitali dal 15,5 DPC femmine gravide come descritto in 9, con alcune modifiche come descritto di seguito. </li><li> Effettuare dissezione prima di mezzogiorno come il tempo di femmine gravide sono considerati ad entrare nel giorno successivo di gravidanza pomeriggio. </li><li> Sacrificio 15.5 femmine gravide DPC utilizzando dislocazione cervicale (o secondo il protocollo approvato dal Comitato Etico degli animali istituzionale). </li><li> Mantenere il mouse sul dorso su carta velina assorbente e spruzzare il lato ventrale dell&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Sollevare la pelle addominale inferiore (lato ventrale) con una pinza e fare una incisione laterale con le forbici chirurgiche, che si estende dalla apertura urogenitale fino alla fine per gabbia toracica. Tirare la pelle verso la testa dell&#39;animale per esporre l&#39;addome. </li><li> Tagliare i muscoli addominali con le forbici chirurgiche per esporre cavità peritoneale. Afferra il dell&#39;utero gravido con una pinza appena sopra la cervice e fare un taglio. Ora sollevare l&#39;utero tenendo in to la vescica urinaria e tagliare il legamento largo uterina seguita da tagli giunzioni uterotubal staccare utero dall&#39;attaccamento peritoneale. </li><li> Trasferire l&#39;utero in un tubo da 50 ml contenente ghiacciata HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank). Lavare l&#39;utero gravido delicatamente con ghiacciata HBSS per rimuovere il sangue in eccesso. </li><li> Mantenere l&#39;utero in una capsula di Petri contenente ghiacciata HBSS e tenere in ghiaccio. Tagliare la parete uterina e togliere gli embrioni. Mantenere gli embrioni in un piatto fresco di Petri con HBSS sul ghiaccio. </li><li> Prendete una carta pulita velina sterile e metterlo su una nuova piastra di Petri. Spray 70% di etanolo sulla carta velina. Mantenere embrione su questa carta velina sulla parte laterale e tagliare dal basso addome con lama sterile nella direzione come mostrato dalla linea tratteggiata in figura 1. </li><li> Fissare l&#39;embrione su una base di una spugna sterile appuntando la colonna vertebrale. </li><li> Mettere sotto lo stereomicroscopio dissezione e con attenzione tagliare lungo la linea mediana ventrale. Rimuovere il fegato e l&#39;intestino. Il sistema del mouse urogenitale (rene, uretere, del testicolo, WD e deferenti) dovrebbe essere visibile. </li><li> Tagliare il testicolo e WD, e mantenere in un piatto fresco di Petri con HBSS, sul ghiaccio. Per estrarre il WD e testicoli, tagliare il dotto deferente vicino al suo attaccamento alla uretra e tagliare l&#39;attaccamento della parte inferiore di WD da gubernaculum. </li><li> Pool testicoli e WD dagli embrioni dello stesso gruppo (puo &#39;variare a seconda del piano sperimentale). </li></ol> 3. Cultura della embrionali gonadica creste (Figura 2) <ol><li> Preparare media per la coltura delle creste genitali embrionali, completandolo DMEM / F12 con il 10% FBS (siero fetale bovino), 1% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina. Riscaldare il supporto a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 300 ml di mezzi per pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. </li><li> Prendete un piatto Petri fresco e mettere una piccola goccia di sterile HBSS su di esso. Mettere una membrana di policarbonato pista di incisione (0.881; m) in questa goccia di HBSS con la sua superficie splendente di fronte al HBSS. </li><li> Uso di pinze pulite messo due WD e gonadi sulla membrana (sulla sua superficie ruvida, rivolta verso l&#39;alto) e rimuovere la quantità massima di HBSS con salviette sterili / di carta assorbente. Non toccare il tessuto con carta assorbente; In caso contrario, potrebbe danneggiare il tessuto. </li><li> Assicurarsi che né i WD né le gonadi si toccano. In caso contrario, essi stare insieme durante la successiva incubazione. </li><li> Trasferire la membrana con i tessuti nel pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenente 300 microlitri di media e coltura cultura all&#39;interfaccia aria-media. terreno di coltura troppo su membrane si traduce in una crescita cistica di WD. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C incubatore, in presenza del 5% di CO 2. </li><li> Modificare il terreno di coltura ogni giorno. Per cambiare il mezzo con la pipetta, rimuovere il terreno dal pozzo e poi aggiungere 300 ml di mezzo fresco preriscaldata. Nota:Per studiare l&#39;effetto di diverse vie di segnalazione alla WD morfogenesi, attivatori chimici e / o inibitori alle concentrazioni richieste possono essere aggiunti al mezzo di coltura. </li><li> Cultura i tessuti per 3 d. All&#39;interno di 3 d, WD srotolò raccolti da un DPC embrione 15,5 trasformano in tubi estremamente contorto (figura 3b). L&#39;aggiunta dell&#39;inibitore Wnt, IWR1, provoca l&#39;inibizione di WD avvolgimento (Figura 3C). </li><li> Per la raccolta di questi tessuti hanno una capsula di Petri con PBS ghiacciato. Trasferire la membrana con gonade colta e WD nella piastra di Petri. La membrana galleggerà sulla PBS. Premere la membrana ad affondare in PBS ed estrarre la gonade e WD. </li><li> Fissare i tessuti con% paraformaldeide (PFA) O / N 4 a 4 ° C o per 1 ora a RT. Se necessario, prendere immagini in campo chiaro del WDS prima di fissazione. </li></ol> 4. immunofluorescenza Mount intero <ol><li> Lavare i tessuti fissati 3x con PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) con lento dondolio, 10 minuti ciascuna, a RT. </li><li> Disidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min ciascuna, a 4 ° C, con lenta oscillazione (~ 30 rpm). A questo punto, i tessuti possono essere conservati a 4 ° C in 75% di etanolo. <ol><li> Per cambiare l&#39;etanolo, mantenere i tessuti indisturbati per 2 minuti e lasciare che i tessuti stabilirsi. Estrarre il più surnatante possibile e quindi aggiungere il successivo maggiore concentrazione di etanolo. Per evitare danni ai tessuti, la punta della pipetta non deve toccare i tessuti in qualsiasi momento. </li></ol></li><li> Dopo la disidratazione, reidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min ciascuna, a 4 ° C, con lento dondolio. </li><li> Lavare i tessuti con PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 minuti ciascuna, a RT, con dolce dondolo (~ 30 rpm). </li><li> Bloccare i tessuti per 1 ora a RT con tampone di bloccaggio (PBS + 1% BSA + 0,2% di latte secco non grasso in polvere + 0,3% Triton X-100). </li><li> afteR blocco, trasferire i tessuti a soluzione anticorpo primario (diluito in tampone di bloccaggio) e incubare O / N a 4 ° C con dolce dondolio (~ 30 rpm). Le diluizioni degli anticorpi primari utilizzati sono descritti nella tabella materiali. </li><li> Il giorno dopo, lavare i tessuti con PBS-MT (PBS + 2% senza grassi del latte in polvere secca + 0,5% Tween-20), 4x, 30 minuti ciascuno, a temperatura ambiente, con dolce dondolio (~ 30 rpm). </li><li> Dopo questa fase di lavaggio, aggiungere anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 250 (ciò deve ottimizzazione per anticorpi individuali) in tampone bloccante e incubare per 1 ora a RT, con dolce dondolio. </li><li> Da ora in poi mantenere i tessuti coperti con un foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce come anticorpi secondari sono etichettati con fluorofori sensibili alla luce. </li><li> Lavare i tessuti 3x con PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 minuti ciascuno, con dolce dondolio. </li><li> Preparare vetrini per il montaggio dei tessuti macchiati. <ol><li> Per questo, tagliare i scivola copertura in vetroin strisce sottili con una penna diamante e attaccare due strisce uno sopra l&#39;altro sul vetrino utilizzando smalto. Fare due confini e luogo tessuti tra questi due confini. </li><li> Aggiungere DAPI contenente mezzo di montaggio e mettere su un vetrino. Applicare smalto agli angoli della polizza di copertura per risolvere il problema alla diapositiva. Nota: I tessuti sono ora pronti per l&#39;imaging. Conservare queste diapositive a -20 ° C. </li></ol></li></ol>

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	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sistema di coltura organo ha molti vantaggi rispetto al tradizionale sistema di coltura cellulare. Questo sistema mantiene le relazioni strutturali originali e le interazioni tra i diversi tipi cellulari. Imita sistemi in vivo e fornisce informazioni più accurate di studi su colture cellulari in cui il fattore di nicchia è assente. L&#39;utilizzo di sistemi di coltura di organi nemmeno vantaggi rispetto utilizzando l&#39;intero animale. Questi includono il costo più elevato di utilizzare l&#39;intero anim...

Il sistema riproduttivo maschile costituita principalmente testicolo, il sito per lo sviluppo di cellule germinali e differenziazione, e un sistema duttale complesso che è necessario per la maturazione, trasporto e stoccaggio di sperma. Epididimo è un organo tubolare che collega testicolo con dotti deferenti e occupa principalmente di sviluppo post-testicolare e la maturazione delle cellule germinali 1. I altamente arrotolati epididimo topo adulto si sviluppa da una semplice e diretto tubo precursore, condotto Wolffian (WD) 1. La struttura complessa e la spirale di dell&#39;epididimo è essenziale per lo sperma di acquisire la capacità di fecondare cellule germinali femminili 2. Come un organo così essenziale per la fertilità maschile si sviluppa e prende in forma non è ben compreso. Diverse vie di segnalazione hanno dimostrato di essere coinvolto nello sviluppo di WD come ad esempio la segnalazione via di Wnt 3,4 e la via di segnalazione degli androgeni 5. Il nostro recente lavoro ha stabilito l&#39;obbligo di balequili- Wnt segnalazione per WD avvolgimento durante lo sviluppo prenatale 4. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per comprendere i meccanismi coinvolti nella postnatale avvolgimento dell&#39;epididimo, la differenziazione cellulare, e la comunicazione cellula-cellula all&#39;interno dell&#39;epitelio dell&#39;epididimo e con le cellule interstiziali. Modelli murini geneticamente modificati hanno dimostrato di essere un potente strumento per l&#39;identificazione / validazione dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della malattia di vari apparati 6. Nonostante il suo ampio uso, ci sono delle limitazioni significative di modelli murini geneticamente modificati, tra cui il fenotipo imprevisto dei mutanti di topo mirati per quanto riguarda la funzione del gene presunta, e nessun fenotipo in mutanti nulli in alcuni modelli, l&#39;influenza di fattori genetici e ambientali, lavoro intensivo e lungo processo di sviluppo di modelli murini. Pertanto, l&#39;interpretazione del significato dei risultati solo da geneticamente modimodelli nismi mouse non è sempre semplice 6. Queste limitazioni possono essere superate usando nel sistema di coltura in vitro di organi che ci dà la possibilità di manipolare più vie di segnalazione in tempo reale, in condizioni di coltura controllate. Sistema di coltura di organi è fondamentale per comprendere la fisiologia e la patologia di interi organi 7. Inoltre, immagini di organi interi colorate con anticorpi fluoroforo etichettati ci permette di visualizzare i marcatori di interesse in un contesto tridimensionale, come esiste in vivo, fornendo così una migliore comprensione della forma dell&#39;organo, la struttura e la funzione 8. Qui, abbiamo descritto i metodi per l&#39;isolamento embrionali di topo creste genitali, coltura in vitro e tutta l&#39;imaging immunofluorescenza monte di WD, che possono essere applicate a rispondere a una serie di domande riguardanti la morfogenesi di organi tubolari, come WDS. In questo protocollo, abbiamoisolati embrionali di topo creste urogenitali dal 15,5 giorni dopo coitum (DPC) dighe in gravidanza e in coltura per 3 d seguita da immunocolorazione per un marcatore di cellule epiteliali (citocheratina 8, CK8), un marker di proliferazione cellulare (fosfo-istone 3, PH3) e attiva βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

morfogenesi Tubal è un requisito fondamentale per lo sviluppo della maggior parte degli organi di mammiferi, compreso il sistema riproduttivo maschile. L&#39;epididimo, parte integrante del tratto riproduttivo maschile, è responsabile per la conservazione dello sperma, la maturazione, e il trasporto. L&#39;epididimo adulto è un tubo altamente spirale che si sviluppa da un semplice e diretto precursore embrionale noto come condotto Wolffian (WD). La corretta avvolgimento dell&#39;epididimo è essenziale per la fertilità maschile, come spermatozoi nel testicolo non sono in grado di fecondare un ovocita. Tuttavia, il meccanismo responsabile dello sviluppo epididymal e spiralatura è chiaro, in parte a causa della mancanza di metodi di coltura interi organo e di imaging. In questo studio, descriviamo un sistema di coltura in vitro e l&#39;intero protocollo di immunofluorescenza monte per visualizzare meglio il processo di WD avvolgimento e di sviluppo, che può essere applicato anche per studiare altri organi tubolari.

Durante lo sviluppo, la WD subisce cambiamenti significativi in ​​cui un tubo semplice e lineare si trasforma in un condotto molto complesso e arrotolato. Utilizzando metodi sopra descritti, WD subiscono una trasformazione simile in condizioni di coltura. Qui abbiamo dimostrato i risultati WDs coltivate per 3 d (Figura 3). Per analizzare i meccanismi molecolari coinvolti nella morfogenesi WD, il terreno di coltura può essere integrato con gli inibitori e attivatori di targeting diverse vie di segna...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  University of Newcastle.  Vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione. 

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

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Ricerca sul cancro

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetica

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscienze

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biologia

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Riepilogo

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Utilizzando

Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola