Vorremmo ringraziare i membri del gruppo di oncologia ginecologica per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è in parte sostenuto da un finanziamento dal National Health and Medical Research Council, l&#39;Australian Research Council, e il Cancer Institute NSW (PST). MK è un destinatario della University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e etica animale dell&#39;Università di Newcastle e confermato alla legge New South Wales Animal Research, Galles regolamento sugli animali del Sud, e il codice australiano per la cura e uso di animali a fini scientifici. Tutte le procedure intraprese sui topi sono stati approvati dal Comitato Etico e Cura degli animali dell&#39;Università di Newcastle. 1. Il tempo di accoppiamento <ol><li> Pair 6 - 8 settimane di vita maschi e femmine di topo appena prima della fine del ciclo di luce diurna. </li><li> Controllare le femmine per la presenza di tappi vaginali mattina presto (entro il 08:00), tutti i giorni. Giorno della spina è considerato come 0,5 dpc. </li><li> Trasferire il femminile con la spina vaginale in una nuova gabbia (senza maschile) ed etichettare la data di presa. </li></ol> 2. Isolamento embrionali di topo gonadici Ridges <ol><li> Isolare embryon del mouseic creste genitali dal 15,5 DPC femmine gravide come descritto in 9, con alcune modifiche come descritto di seguito. </li><li> Effettuare dissezione prima di mezzogiorno come il tempo di femmine gravide sono considerati ad entrare nel giorno successivo di gravidanza pomeriggio. </li><li> Sacrificio 15.5 femmine gravide DPC utilizzando dislocazione cervicale (o secondo il protocollo approvato dal Comitato Etico degli animali istituzionale). </li><li> Mantenere il mouse sul dorso su carta velina assorbente e spruzzare il lato ventrale dell&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Sollevare la pelle addominale inferiore (lato ventrale) con una pinza e fare una incisione laterale con le forbici chirurgiche, che si estende dalla apertura urogenitale fino alla fine per gabbia toracica. Tirare la pelle verso la testa dell&#39;animale per esporre l&#39;addome. </li><li> Tagliare i muscoli addominali con le forbici chirurgiche per esporre cavità peritoneale. Afferra il dell&#39;utero gravido con una pinza appena sopra la cervice e fare un taglio. Ora sollevare l&#39;utero tenendo in to la vescica urinaria e tagliare il legamento largo uterina seguita da tagli giunzioni uterotubal staccare utero dall&#39;attaccamento peritoneale. </li><li> Trasferire l&#39;utero in un tubo da 50 ml contenente ghiacciata HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank). Lavare l&#39;utero gravido delicatamente con ghiacciata HBSS per rimuovere il sangue in eccesso. </li><li> Mantenere l&#39;utero in una capsula di Petri contenente ghiacciata HBSS e tenere in ghiaccio. Tagliare la parete uterina e togliere gli embrioni. Mantenere gli embrioni in un piatto fresco di Petri con HBSS sul ghiaccio. </li><li> Prendete una carta pulita velina sterile e metterlo su una nuova piastra di Petri. Spray 70% di etanolo sulla carta velina. Mantenere embrione su questa carta velina sulla parte laterale e tagliare dal basso addome con lama sterile nella direzione come mostrato dalla linea tratteggiata in figura 1. </li><li> Fissare l&#39;embrione su una base di una spugna sterile appuntando la colonna vertebrale. </li><li> Mettere sotto lo stereomicroscopio dissezione e con attenzione tagliare lungo la linea mediana ventrale. Rimuovere il fegato e l&#39;intestino. Il sistema del mouse urogenitale (rene, uretere, del testicolo, WD e deferenti) dovrebbe essere visibile. </li><li> Tagliare il testicolo e WD, e mantenere in un piatto fresco di Petri con HBSS, sul ghiaccio. Per estrarre il WD e testicoli, tagliare il dotto deferente vicino al suo attaccamento alla uretra e tagliare l&#39;attaccamento della parte inferiore di WD da gubernaculum. </li><li> Pool testicoli e WD dagli embrioni dello stesso gruppo (puo &#39;variare a seconda del piano sperimentale). </li></ol> 3. Cultura della embrionali gonadica creste (Figura 2) <ol><li> Preparare media per la coltura delle creste genitali embrionali, completandolo DMEM / F12 con il 10% FBS (siero fetale bovino), 1% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina. Riscaldare il supporto a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 300 ml di mezzi per pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. </li><li> Prendete un piatto Petri fresco e mettere una piccola goccia di sterile HBSS su di esso. Mettere una membrana di policarbonato pista di incisione (0.881; m) in questa goccia di HBSS con la sua superficie splendente di fronte al HBSS. </li><li> Uso di pinze pulite messo due WD e gonadi sulla membrana (sulla sua superficie ruvida, rivolta verso l&#39;alto) e rimuovere la quantità massima di HBSS con salviette sterili / di carta assorbente. Non toccare il tessuto con carta assorbente; In caso contrario, potrebbe danneggiare il tessuto. </li><li> Assicurarsi che né i WD né le gonadi si toccano. In caso contrario, essi stare insieme durante la successiva incubazione. </li><li> Trasferire la membrana con i tessuti nel pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenente 300 microlitri di media e coltura cultura all&#39;interfaccia aria-media. terreno di coltura troppo su membrane si traduce in una crescita cistica di WD. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C incubatore, in presenza del 5% di CO 2. </li><li> Modificare il terreno di coltura ogni giorno. Per cambiare il mezzo con la pipetta, rimuovere il terreno dal pozzo e poi aggiungere 300 ml di mezzo fresco preriscaldata. Nota:Per studiare l&#39;effetto di diverse vie di segnalazione alla WD morfogenesi, attivatori chimici e / o inibitori alle concentrazioni richieste possono essere aggiunti al mezzo di coltura. </li><li> Cultura i tessuti per 3 d. All&#39;interno di 3 d, WD srotolò raccolti da un DPC embrione 15,5 trasformano in tubi estremamente contorto (figura 3b). L&#39;aggiunta dell&#39;inibitore Wnt, IWR1, provoca l&#39;inibizione di WD avvolgimento (Figura 3C). </li><li> Per la raccolta di questi tessuti hanno una capsula di Petri con PBS ghiacciato. Trasferire la membrana con gonade colta e WD nella piastra di Petri. La membrana galleggerà sulla PBS. Premere la membrana ad affondare in PBS ed estrarre la gonade e WD. </li><li> Fissare i tessuti con% paraformaldeide (PFA) O / N 4 a 4 ° C o per 1 ora a RT. Se necessario, prendere immagini in campo chiaro del WDS prima di fissazione. </li></ol> 4. immunofluorescenza Mount intero <ol><li> Lavare i tessuti fissati 3x con PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) con lento dondolio, 10 minuti ciascuna, a RT. </li><li> Disidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min ciascuna, a 4 ° C, con lenta oscillazione (~ 30 rpm). A questo punto, i tessuti possono essere conservati a 4 ° C in 75% di etanolo. <ol><li> Per cambiare l&#39;etanolo, mantenere i tessuti indisturbati per 2 minuti e lasciare che i tessuti stabilirsi. Estrarre il più surnatante possibile e quindi aggiungere il successivo maggiore concentrazione di etanolo. Per evitare danni ai tessuti, la punta della pipetta non deve toccare i tessuti in qualsiasi momento. </li></ol></li><li> Dopo la disidratazione, reidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min ciascuna, a 4 ° C, con lento dondolio. </li><li> Lavare i tessuti con PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 minuti ciascuna, a RT, con dolce dondolo (~ 30 rpm). </li><li> Bloccare i tessuti per 1 ora a RT con tampone di bloccaggio (PBS + 1% BSA + 0,2% di latte secco non grasso in polvere + 0,3% Triton X-100). </li><li> afteR blocco, trasferire i tessuti a soluzione anticorpo primario (diluito in tampone di bloccaggio) e incubare O / N a 4 ° C con dolce dondolio (~ 30 rpm). Le diluizioni degli anticorpi primari utilizzati sono descritti nella tabella materiali. </li><li> Il giorno dopo, lavare i tessuti con PBS-MT (PBS + 2% senza grassi del latte in polvere secca + 0,5% Tween-20), 4x, 30 minuti ciascuno, a temperatura ambiente, con dolce dondolio (~ 30 rpm). </li><li> Dopo questa fase di lavaggio, aggiungere anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 250 (ciò deve ottimizzazione per anticorpi individuali) in tampone bloccante e incubare per 1 ora a RT, con dolce dondolio. </li><li> Da ora in poi mantenere i tessuti coperti con un foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce come anticorpi secondari sono etichettati con fluorofori sensibili alla luce. </li><li> Lavare i tessuti 3x con PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 minuti ciascuno, con dolce dondolio. </li><li> Preparare vetrini per il montaggio dei tessuti macchiati. <ol><li> Per questo, tagliare i scivola copertura in vetroin strisce sottili con una penna diamante e attaccare due strisce uno sopra l&#39;altro sul vetrino utilizzando smalto. Fare due confini e luogo tessuti tra questi due confini. </li><li> Aggiungere DAPI contenente mezzo di montaggio e mettere su un vetrino. Applicare smalto agli angoli della polizza di copertura per risolvere il problema alla diapositiva. Nota: I tessuti sono ora pronti per l&#39;imaging. Conservare queste diapositive a -20 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sistema di coltura organo ha molti vantaggi rispetto al tradizionale sistema di coltura cellulare. Questo sistema mantiene le relazioni strutturali originali e le interazioni tra i diversi tipi cellulari. Imita sistemi in vivo e fornisce informazioni più accurate di studi su colture cellulari in cui il fattore di nicchia è assente. L&#39;utilizzo di sistemi di coltura di organi nemmeno vantaggi rispetto utilizzando l&#39;intero animale. Questi includono il costo più elevato di utilizzare l&#39;intero anim...

Il sistema riproduttivo maschile costituita principalmente testicolo, il sito per lo sviluppo di cellule germinali e differenziazione, e un sistema duttale complesso che è necessario per la maturazione, trasporto e stoccaggio di sperma. Epididimo è un organo tubolare che collega testicolo con dotti deferenti e occupa principalmente di sviluppo post-testicolare e la maturazione delle cellule germinali 1. I altamente arrotolati epididimo topo adulto si sviluppa da una semplice e diretto tubo precursore, condotto Wolffian (WD) 1. La struttura complessa e la spirale di dell&#39;epididimo è essenziale per lo sperma di acquisire la capacità di fecondare cellule germinali femminili 2. Come un organo così essenziale per la fertilità maschile si sviluppa e prende in forma non è ben compreso. Diverse vie di segnalazione hanno dimostrato di essere coinvolto nello sviluppo di WD come ad esempio la segnalazione via di Wnt 3,4 e la via di segnalazione degli androgeni 5. Il nostro recente lavoro ha stabilito l&#39;obbligo di balequili- Wnt segnalazione per WD avvolgimento durante lo sviluppo prenatale 4. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per comprendere i meccanismi coinvolti nella postnatale avvolgimento dell&#39;epididimo, la differenziazione cellulare, e la comunicazione cellula-cellula all&#39;interno dell&#39;epitelio dell&#39;epididimo e con le cellule interstiziali. Modelli murini geneticamente modificati hanno dimostrato di essere un potente strumento per l&#39;identificazione / validazione dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della malattia di vari apparati 6. Nonostante il suo ampio uso, ci sono delle limitazioni significative di modelli murini geneticamente modificati, tra cui il fenotipo imprevisto dei mutanti di topo mirati per quanto riguarda la funzione del gene presunta, e nessun fenotipo in mutanti nulli in alcuni modelli, l&#39;influenza di fattori genetici e ambientali, lavoro intensivo e lungo processo di sviluppo di modelli murini. Pertanto, l&#39;interpretazione del significato dei risultati solo da geneticamente modimodelli nismi mouse non è sempre semplice 6. Queste limitazioni possono essere superate usando nel sistema di coltura in vitro di organi che ci dà la possibilità di manipolare più vie di segnalazione in tempo reale, in condizioni di coltura controllate. Sistema di coltura di organi è fondamentale per comprendere la fisiologia e la patologia di interi organi 7. Inoltre, immagini di organi interi colorate con anticorpi fluoroforo etichettati ci permette di visualizzare i marcatori di interesse in un contesto tridimensionale, come esiste in vivo, fornendo così una migliore comprensione della forma dell&#39;organo, la struttura e la funzione 8. Qui, abbiamo descritto i metodi per l&#39;isolamento embrionali di topo creste genitali, coltura in vitro e tutta l&#39;imaging immunofluorescenza monte di WD, che possono essere applicate a rispondere a una serie di domande riguardanti la morfogenesi di organi tubolari, come WDS. In questo protocollo, abbiamoisolati embrionali di topo creste urogenitali dal 15,5 giorni dopo coitum (DPC) dighe in gravidanza e in coltura per 3 d seguita da immunocolorazione per un marcatore di cellule epiteliali (citocheratina 8, CK8), un marker di proliferazione cellulare (fosfo-istone 3, PH3) e attiva βcatenin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">24 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:136px;">3524</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30031.02</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D8437</td>
			<td style="width:191px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Interpath,&#160; Australia</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:191px;">10% FBS used in culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:136px;">15070-063</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Whatman, USA</td>
			<td style="width:136px;">110409</td>
			<td style="width:191px;">Membrane (0.8 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">IWR1</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">10161-5mg</td>
			<td style="width:191px;">100 &#181;M concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">15710</td>
			<td style="width:191px;">16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot 
			be disposed of in the sink</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">214-20L PL</td>
			<td style="width:191px;">Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">2509-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">T8787-50ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">621-500mg</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Di-hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Ajax Finechem, USA</td>
			<td style="width:136px;">4745-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">465-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:247px;">Cytokeratin8/Troma I</td>
			<td style="width:195px;">Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td>
			<td style="width:136px;">TROMA-I</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">active &#946;catenin&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Cell Signalling Technology,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">D13A1</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">Phospho-Histone3</td>
			<td style="width:195px;">Millipore, MA, USA</td>
			<td style="width:136px;">06-570</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">111-545-047</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:247px;">Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">112-585-072</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">242-500ml</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">n-Propyl galate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">2370</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D9564-10mg</td>
			<td style="width:191px;">Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">2225-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cover Slips (24x50 mm)</td>
			<td style="width:195px;">Lomb Scientific</td>
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organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

morfogenesi Tubal è un requisito fondamentale per lo sviluppo della maggior parte degli organi di mammiferi, compreso il sistema riproduttivo maschile. L&#39;epididimo, parte integrante del tratto riproduttivo maschile, è responsabile per la conservazione dello sperma, la maturazione, e il trasporto. L&#39;epididimo adulto è un tubo altamente spirale che si sviluppa da un semplice e diretto precursore embrionale noto come condotto Wolffian (WD). La corretta avvolgimento dell&#39;epididimo è essenziale per la fertilità maschile, come spermatozoi nel testicolo non sono in grado di fecondare un ovocita. Tuttavia, il meccanismo responsabile dello sviluppo epididymal e spiralatura è chiaro, in parte a causa della mancanza di metodi di coltura interi organo e di imaging. In questo studio, descriviamo un sistema di coltura in vitro e l&#39;intero protocollo di immunofluorescenza monte per visualizzare meglio il processo di WD avvolgimento e di sviluppo, che può essere applicato anche per studiare altri organi tubolari.

Durante lo sviluppo, la WD subisce cambiamenti significativi in ​​cui un tubo semplice e lineare si trasforma in un condotto molto complesso e arrotolato. Utilizzando metodi sopra descritti, WD subiscono una trasformazione simile in condizioni di coltura. Qui abbiamo dimostrato i risultati WDs coltivate per 3 d (Figura 3). Per analizzare i meccanismi molecolari coinvolti nella morfogenesi WD, il terreno di coltura può essere integrato con gli inibitori e attivatori di targeting diverse vie di segna...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  University of Newcastle.  Vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione. 

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...