Questo lavoro fu supportato da sovvenzioni dell'Accademia di Finlandia [315948, 314387 a N.K.]; Fondazione Sigrid Jusélius [a N.K., J.T.]; Fondazione Emil Aaltonen [a J.-A.M., T.L.]; Programma di dottorato turco di medicina molecolare [S.C.-M., O.O.].

Il mantenimento dei topi di laboratorio e di tutti gli esperimenti sugli animali è stato effettuato in conformità con le linee guida e le normative pertinenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio nell'Università di Turku.
1. Preparazione di tubuli seminiferi per la microdisezione
<ol><li>Sacrifica un topo maschio adulto (≥8 settimane, testicolo 80-120 mg a seconda del ceppo e dell'età) attraverso l'asfissia di CO2 seguita da lussazione cervicale. NOTA: Il topo deve essere sessualmente maturo e preferibilmente di almeno 8 settimane. Il modello di transilluminazione dei topi giovani differisce dall'adulto perché l'onda dell'epitelio seminifero non è ancora stata completamente stabilita e la tempistica della prima ondata di spermatogenesi èdistinta 21,22. La mancanza di spermatidi allunganti nei topi maschi di 4 settimane impedisce il loro uso per la microdisezione assistita da transilluminazione. Possono essere utilizzati tutti i ceppi di topo che hanno una normale spermatogenesi.</li>
	<li>Spruzzare l'addome ventrale con il 70% di etanolo. Aprire la cavità addominopelvica usando forbici sterili, facendo un'apertura a forma di V.</li>
	<li>Tirando sul cuscinetto grasso epididimale con forcep sterili, individuare i teste, sezionarli usando le forbici e posizionarli su una piastra di Petri sterile da 100 mm contenente PBS. NOTA: Per mantenere la sterilità, assicurarsi che tutti i labware e gli strumenti chirurgici siano sterili.</li>
	<li>L'uso di forbici a punta fine decapsula i testicoli tagliando una fessura nell'albuginea tunica,il foglio fibroso spesso che incapsula il testicolo. Quindi apri la tunica usando un paio di forcep. Forzare i tubuli premendo con le forcep e scartare la tunica. NOTA: Durante lo scartamento della tunica, potrebbe essere utile per alcune applicazioni a valle che l'arteria testicolare venga rimossa insieme alla tunica. Evitare di danneggiare i tubuli seminiferi.</li>
	<li>Spostare i tubuli seminiferi in una nuova piastra di Petri e versare abbastanza PBS sterile per coprire il fondo della piastra di Petri. Quindi, allontana delicatamente i tubuli ma evita di danneggiare i tubuli. NOTA: Troppe sollecitazioni meccaniche influenzeranno il modello di transilluminazione e influenzeranno la vitalità del tessuto e la sua architettura cellulare. I tubuli possono anche essere lavorati per immunosottenimenti a montaggio intero da questo punto senza messa in scena (3B). A volte è sufficiente definire retrospettivamente lo stadio includendo anticorpi contro proteine espresse in spermatogonia differenziante, come SALL4, c-KIT e DNMT3A18,23. La densità della spermatogonia è un indicatore di stadio relativamente affidabile (figura 2).</li>
</ol>2. Microdisezione assistita da transilluminazione
<ol><li>Posizionare saldamente la piastra di Petri sotto un microscopio a dissezione toccarla sul palco. NOTA: È importante nastro bene la piastra di Petri per prevenirne il movimento che potrebbe causare la miscelazione dei segmenti di tubuli seminiferi a fasi raccolti.</li>
	<li>Per rivelare il modello di assorbimento della luce dei tubuli seminiferi sotto messa a fuoco, assicurarsi che il campione sia illuminato dal basso e che la luce passi attraverso il campione, cioè, sia transilluminato. NOTA: La quantità di luce assorbita/dispersa è relativa al livello di condensazione della cromatina negli spermatidi allunganti e al loro raggruppamento all'interno del tubulo seminifero: più si condensa, più la luce viene assorbita, cioè, appare più scura.</li>
	<li>Conoscere il modello di assorbimento della luce di diversi stadi, come descritto nella figura 2, figura 5A e figura S1 spostando accuratamente i fasci di tubuli utilizzando forcep fini. NOTA: Le fasi si sus seguono sempre in ordine logico, formando l'onda dell'epitelio seminifero. Tuttavia, è importante sapere che la direzione dell'onda spermatogenica occasionalmente si inverte e poi ritorna di nuovo (nota anchecome modulazioni 4,9), a volte complicando la procedura. Inoltre, la lunghezza di ogni stadio, in termini di quanti mm di tubulo, varia considerevolmente.</li>
	<li>Sollevare con cura il tubulo di interesse utilizzando le forcette con una punta agganciata, quindi tagliare un segmento di lunghezza appropriata utilizzando forbici a microdisezione (vedere Video supplementare 1). Un gancio sulla punta delle forcep facilita il sollevamento e la tenuta di un tubulo e aiuta a evitare di spremerlo. NOTA: La lunghezza dei segmenti da tagliare dipende dalle applicazioni a valle. Per la raccolta di pezzi di tubuli raggruppati di uno stadio specifico per l'analisi di proteine o RNA12,13 (II–V, VII-VIII e IX-XI, Figura 5B) la lunghezza è tipicamente di 2-5 mm. Quando si utilizza l'estrazione standard fenolo-cloroformio, circa 200 ng di RNA possono essere derivati da 1 mm di tubulo. Per la colorazione a montaggio intero dei segmenti di tubuli a fasi, la lunghezza dei segmenti deve essere >5 mm. Per i preparati di zucca la lunghezza dei segmenti non deve superare 1-2 mm perché le celle al centro del segmento potrebbero non uscire se troppo lunghe. Utilizzare una scala mm sotto la piastra di Petri per una misurazione accurata della lunghezza del tubulo.</li>
</ol>3. Immunostaining di diversi preparati
<ol><li>Preparazione dello squash: verifica dello stadio e immunosocienza NOTA: I pezzi di tubuli specifici dello stadio possono essere schiacciati su uno scivolo al microscopio con un vetro di copertura per eseguire analisi morfologiche delle cellule viventi mediante microscopia a contrasto di fase e successiva immunosocienza. Si consiglia a un principiante di utilizzare questo approccio per verificare le fasi quando si fa conoscenza con il metodo di microdisezione assistito da transilluminazione.<ol>
<li>Raccogliere il segmento in un volume di 10 μL utilizzando una pipetta e spostarlo su uno scivolo al microscopio.</li>
		<li>Schiacciare il tubulo posizionando con cura un vetro di copertura (20 mm x 20 mm) sul tubulo. Di conseguenza, le cellule fluiranno fuori dal tubulo e formeranno un monostrato a cellule vive. Posizionare una carta da filtro sul bordo del vetro di copertura per facilitare la diffusione delle cellule. Evitare di schiacciare troppo le cellule per mantenerle in vita.</li>
		<li>Monitorare la diffusione delle cellule al microscopio. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con obiettivo 40x per verificare il riconoscimento dello stadio esaminando i tipi di cella presenti (Figura 2, Figura S2).</li>
		<li>Una volta che le cellule si sono diffuse per formare un monostrato rotondo da entrambe le estremità del tubulo, immergere lo scivolo in un contenitore contenente azoto liquido tenendolo con le punte. Tienilo sommerso per 10 s. In alternativa posizionare lo scivolo su una piastra di ghiaccio secco per il congelamento.</li>
		<li>Rimuovere il vetro di copertura capovolgendolo usando un bisturi.</li>
		<li>Senza indugio, procedere con la fissazione e posizionare rapidamente lo scivolo in un contenitore con il 90% di etanolo per 2-5 minuti. NOTA: Assicurarsi che la preparazione della zucca non si scongeli prima di posizionarla al 90% di etanolo. Altri fissivi possono anche essere utilizzati, come l'acetone, per 10 minuti.</li>
		<li>Asciugare all'aria e conservare a temperatura ambiente (RT) (fino a qualche giorno) o a -80 °C (a lungo termine).</li>
		<li>Per l'immunostaining, post-fissare i campioni in paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 minuti a RT.</li>
		<li>Risciacquare in PBS e permeabilizzare con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min.</li>
		<li>Risciacquare in PBS e disegnare un anello di grasso attorno a ciascun campione di zucca.</li>
		<li>Aggiungere 50-100 μL di BSA al 10% (albumina di siero bovino) nello 0,1% tween in PBS (PBST) all'interno dell'anello di grasso e bloccare i campioni per 30 minuti a RT.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione BSA e incubare con un anticorpo primario diluito in BSA al 10% in PBST per 1 h a RT.</li>
		<li>Lavare 3 volte per 5 minuti con PBST.</li>
		<li>Incubare con un anticorpo secondario diluito nel 10% di BSA in PBST. NOTA: Per macchiare gli acrosomi, i campioni possono essere incubati con anticorpo di agglutinina di arachidi con etichetta Rhodamina (PNA, 1:1000) nel 10% di BSA in PBST per 1 h a RT (Figura S3) invece di anticorpi primari e secondari specifici.</li>
		<li>Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBST, risciacquare con PBS e montare con un montante contenente DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunosottenimento a montaggio intero dei tubuli seminiferi NOTA: Il protocollo seguente descrive la colorazione a montaggio intero per i segmenti di tubuli a fasi (dal passaggio 2.4). Se un ricercatore desidera eseguire la colorazione a montaggio intero senza messa in scena (dal passaggio 1.5), prestare attenzione alle note nei punti 3.2.1 e 3.2.7.<ol>
<li>Utilizzando una pipetta, trasferire i segmenti di tubuli (dal passo 2.4) in PBS ghiacciato in un tubo conico da 15 mL e consentire loro di sedimentare sul ghiaccio. NOTA: Se si utilizzano tubuli non stanziati da 1.5., separare i tubuli in una piastra di Petri pipettando più volte su e indietro su una piastra inclinata. Utilizzare una pipetta da 1 mL con una punta di taglio. Questo passaggio ha lo scopo di aprire la struttura del tessuto. Tuttavia, evitare un'troppo pipettazione in quanto potrebbe danneggiare i tubuli. La sedimentazione dei tubuli richiederà alcune decine di secondi. Piccoli frammenti di tubuli, cellule interstiziali e detriti cellulari rimangono nel supernatante.</li>
		<li>Rimuovere con cura il supernatante (SN) pipettando o con un aspiratore. Aggiungere 10 mL di PBS ghiacciato e mescolare per inversione.</li>
		<li>Lasciare sedimentare e quindi rimuovere SN come prima.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di PFA al 4% e fissare per 5 ore su un tavolo rotante (20-30 giri/min) a +4 °C. NOTA: Il tempo di fissazione dipende dalle proteine di interesse e dalla loro localizzazione subcellulare. Per le proteine nucleari e citoplasmatiche, una fissazione di 2 ore è tipicamente sufficiente, tuttavia, marcatori di membrana, come GFRα1 (recettore della famiglia GDNF alfa 1; Figura 6A,B), beneficiare di una fissazione più lunga, fino a 6 ore.</li>
		<li>Lasciare sedimentare, rimuovere SN (PFA) come prima e risciacquare brevemente aggiungendo 10 ml di PBS e invertendo il tubo.</li>
		<li>Lasciare sedimentare, rimuovere SN come prima e ripetere la fase di lavaggio PBS tre volte per almeno 10 minuti ciascuno su un tavolo rotante a +4 °C e procedere con la colorazione o conservare a +4 °C. NOTA: Se le condizioni di lavoro sono sterili e pulite, i campioni possono essere conservati e utilizzati per almeno alcune settimane. In alternativa, aggiungere azide di sodio a una concentrazione finale dello 0,02% (w/v) da una soluzione stock del 2% per aiutare a preservare i tubuli prima della conservazione a +4 °C.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta da 1 mL, spostare 10-20 segmenti di tubuli fissi su un tubo a fondo tondo da 2 ml. Lasciare sedimentare e rimuovere SN. NOTA: Se si lavora con lunghi tubuli che non sono stati messi in scena, versare i tubuli su una piastra di Petri e utilizzare forbici a microdissezione e segmenti tagliati a forza di circa 5-20 mm. Segmenti troppo lunghi si aggroviglieranno durante la procedura di colorazione, mentre i segmenti troppo corti vengono facilmente persi.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 2% BSA + 10% FBS (siero bovino fetale) nello 0,3% Tritone X-100 in PBS (PBSX). Bloccare per almeno 1 h su un tavolo rotante (20-30 giri/min) a RT.</li>
		<li>Risciacquare con 1 mL di PBSX, rimuovere LN mediante pipettazione e aggiungere 250 μL di anticorpo primario diluito in 1% di BSA in PBSX (1:100–1:2000 diluizione). Incubare per 2 ore a RT o durante la notte a +4 °C su un tavolo rotante (20-30 giri/min).</li>
		<li>Rimuovere la soluzione anticorpale con pipettando e risciacquare i tubuli con 1 mL di PBSX come sopra. Lavare tre volte per 1 h in PBSX su un tavolo rotante (20-30 giri/min) a RT. NOTA: Dopo questo primo lavaggio il campione può essere lasciato durante la notte a +4 °C, se necessario.</li>
		<li>Rimuovere l'SN e aggiungere 250 μL di anticorpo secondario diluito in 1% di BSA in PBSX (in genere 1:500 diluizione di un anticorpo con etichetta fluorescente). Coprire in lamina e incubare su un tavolo rotante (20-30 giri/min) a RT per 1 h.</li>
		<li>Ripetere il file 3.2.10.</li>
		<li>Infine rimuovere SN e versare i tubuli su uno scivolo al microscopio. Separare delicatamente e disporre i tubuli in strisce lineari utilizzando punte di caricamento in gel. Scolare il buffer in eccesso e aggiungere il supporto di montaggio e un coverslip. NOTA: Evitare l'asciugatura dei tubuli mentre li si dispone. Nella maggior parte dei casi non è necessaria la contro-colorazione dei nuclei con DAPI. Sigillare il bordo del coperchio con smalto per unghie per evitare l'essiccazione e il deterioramento del campione. Le diapositive possono essere conservate per 1-2 settimane a +4 °C prima dell'imaging.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di microdisezione assistita da transilluminazione che abbiamo descritto sopra consente un approccio orientato allo stadio per lo studio della spermatogenesi. La spermatogenesi è un processo altamente sincronizzato, e tutti i passaggi chiave durante la differenziazione spermatogenica sono regolati ed eseguiti in modo dipendente dallo stadio, come l'impegno di differenziazione (nelle fasi VII-VIII), l'insorgenza della meiosi (VII-VIII), le divisioni meiotiche (XII), l'insorgenza dell'allungamento spermatido (VIII) e lo spermiazione (VIII)1,26,27. L'analisi orientata allo stadio fornisce un potente strumento per studiare questi particolari eventi che sono limitati a specifici passaggi di spermatogenesi e quindi trovati solo in fasi definite del ciclo epiteliale seminifero. Padroneggiare il metodo richiede un po 'di pratica e l'uso di un microscopio a dissezione di buona qualità e condizioni illuminanti adeguate sono fondamentali per il successo. L'implementazione di questo metodo come parte del toolkit quotidiano ha la capacità di migliorare notevolmente l'impatto e la rilevanza biologica della ricerca sulle funzioni riproduttive maschili consentendo una dissezione più accurata degli eventi molecolari durante la spermatogenesi.
Tutti i ceppi di topo WT che abbiamo studiato mostrano un modello di transilluminazione simile e mostrano associazioni cellulari conservate nelle fasi del ciclo epiteliale seminifero. A condizione che la differenziazione spermiogenica delle cellule germinali non sia grossolanamente diversa dai topi WT, lo stesso vale anche per tutti i modelli di topo knock-out che abbiamo studiato. Inoltre, può essere applicato ad altre specie che presentano una disposizione segmentale longitudinale degli stadi del ciclo epiteliale seminifero7. Tuttavia, le specie con stadi non segmentali (come l'umano) non possono essere utilizzate. Dato il ruolo essenziale della condensazione della cromatina negli spermatidi allunganti nella definizione del modello di transilluminazione, è chiaro che qualsiasi fraintendimento di questo processo inevitabilmente intaccherà l'implementazione di questo metodo. Nei topi giovani e nei giovani adulti (5-6 settimane) il modello di transilluminazione non è ancora stato pienamente stabilito e, pertanto, devono essere utilizzati solo topi di età superiore a 8 settimane. È anche importante tenere presente che spremere e tirare i tubuli inevitabilmente impatta sul modello di transilluminazione perché distorce l'architettura cellulare all'interno dell'epitelio seminifero.
I segmenti isolati di tubuli seminiferi possono anche essere coltivati consentendo l'osservazione ex vivo e la manipolazione di processi accoppiati alla spermatogenesi, compresa la meiosi. Per garantire la vitalità del tessuto e prevenire la degradazione dell'RNA e delle proteine, i campioni devono essere raccolti e lavorati non più di 2 ore dopo aver sacrificato il topo. Per la cultura ex vivo dei tubuli seminiferi, il tempo dal sacrificio all'inizio della cultura non dovrebbe superare 1 ora. L'integrità dei frammenti di tubuli può in genere essere mantenuta fino a 72 ore in vitro se raccolta correttamente.
Lo stadio del ciclo epiteliale seminifero può essere verificato e definito in modo ancora più accurato utilizzando la microscopia a contrasto di fase dei preparati di zucca16. La microscopia viene eseguita su cellule viventi, che fornisce una dimensione aggiuntiva nell'analisi e consente l'osservazione dei movimenti di organelli o cellule in fasi specifiche della spermatogenesi28,29,30. La microscopia a contrasto di fase fornisce una stadiazione esatta per la successiva immunostaining, che consente un'analisi molto dettagliata dell'espressione proteica e delle dinamiche di localizzazione durante la spermatogenesi, compresi i cambiamenti specifici dello stadio.
Mentre le cellule vengono rilasciate dal contesto epiteliale nei preparati di zucca, le immunosottenizioni a montaggio intero dei segmenti di tubuli consentono lo studio delle cellule spermatogeniche nel loro ambiente fisiologico. Pertanto, i preparati a montaggio intero possono fornire una migliore visualizzazione dell'architettura dei tubuli seminiferi e dei suoi contatti intercellulari rispetto all'immunostaining sulle sezioni trasversali. È importante sottolineare che la stadiazione assistita dalla transilluminazione dei segmenti di tubuli prima dell'immunosomozione rende l'approccio ancora più potente includendo informazioni sullo stadio specifico di un dato segmento. La colorazione a montaggio intero è uno strumento particolarmente utile per lo studio delle cellule alla periferia dei tubuli seminiferi, come le cellule mioidi peritubulari, i macrofagi peritubulari e la spermatogonia, ma potrebbe anche aprire nuove intuizioni sulla ricerca sulle cellule germinali meiotiche e postmeiotiche.

La differenziazione delle cellule germinali maschili dalla spermatogonia diploide agli spermatozoi aploidi maturi, cioè la spermatogenesi, è unprocesso complesso che si svolge nell'epitelio dei tubuli seminiferi nei teste di un individuo sessualmente maturo1. I discendenti mitotici della spermatogonia A1 prima si dividono cinque volte per espandere la popolazione impegnata nella differenziazione, quindi entrano nella meiosi come spermatociti che alla fine danno origine a spermatidi aploidi. La differenziazione degli spermatidi rotondi in spermatozoi, cioè spermiogenesi, comporta complessi cambiamenti nella morfologia cellulare, tra cui la compattazione nucleare e la costruzione di strutture specifiche dello sperma come l'acrosoma eil flagello. Nel topo, l'intero processo di spermatogenesi richiede 35 giorni per completare2,3.
In qualsiasi luogo, l'epitelio seminifero ospita fino a cinque coorti di cellule germinali differenzianti più le cellule staminali/progenitrici germinali e le cellule somatiche di Sertoli1. Le cellule germinali differenzianti formano strati concentrici la cui composizione è prevedibile e le cellule aploidi in un dato fase di sviluppo si associano sempre a determinati tipi di spermatociti e spermatogonia4,5. Pertanto, qualsiasi sezione trasversale di un tubulo ospita coorti di cellule germinali di una composizione costante. Queste associazioni cellulari specifiche sono definite come gli stadi dell'epitelio seminifero. Le fasi di per sé non presentano stati stagnanti simili a check-point, ma si sviluppano continuamente man mano che la differenziazione delle coorti di cellule germinali progredisce insincronia 1,2,6. Nei topi, ci sono 12 stadi (I-XII)2 che sono disposti in modo segmentale lungo l'asse longitudinale del tubulo seminifero, e si sus seguono in ordine logico formando così l'onda dell'epitelio seminifero, o onda spermatogenica7,8,9 (Figura 1). Il completamento della spermatogenesi richiede quattro cicli e strati gerarchici o coorti di cellule germinali differenzianti all'interno di qualsiasi sezione trasversale del tubulo seminifero sono temporaneamente un ciclo seminifero l'uno dall'altro. La durata del ciclo dipende dalle specie e nel topo ogni ciclo richiede 8,6 giorni10.
Le fasi possono essere identificate sulla base della composizione cellulare e dell'organizzazione dell'epitelio seminifero sulle sezioniistologiche dei testicoli 5(figura 1 e figura 2). Tuttavia, l'analisi istologica è laboriosa, dispendiosa in termini di tempo e richiede fissaggio e colorazione e non può, quindi, essere applicata ai tessuti vivi. È importante sottolineare che la stadiazione può essere eseguita anche su tessuti viventi al microscopio a dissezione sfruttando modelli distinti di assorbimento/dispersione della luce esibiti da diverse fasi del ciclo (Figura 2). La capacità di ogni stadio di assorbire e disperdere la luce è relativa al livello di condensazione della cromatina degli spermatidi post-meiotici tardi che ogni dato stadio ospita e all'imballaggio di queste cellule infasci 7,11. La differenziazione spermatidi, cioè la spermiogenesi, è ulteriormente divisa in 16 fasi di sviluppo, tra cui8 passaggi di spermatidi rotondi (fase 1-8) e 8 passaggi di differenziazione spermatido allungante (fasi 9-16)(Figura 1). Gli spermatidi allunganti step 9-11 (stadio IX-XI) mostrano solo un basso livello di condensa di cromatina con conseguente assorbimento di una bassa quantità di luce. La condensazione della cromatina inizia nel passaggio 11 spermatidi (stadio XI) e gli spermatidi allunganti fase 15-16 (stadio IV-VIII) contengono cromatina completamente condensata e quindi mostrano un massimo assorbimento della luce(Figura 3). La cromatina deve essere condensata per essere ben imballata nella testa dello sperma. Altri fattori che contribuiscono al modello di assorbimento della luce sono la posizione degli spermatidi allunganti all'interno dell'epitelio (basale vs. apicale) e l'aggregazione di spermatidi allunganti (pronunciati negli stadi II-V)11 (Figura 3). I fasci sono visti come macchie al centro dei tubuli e come strisce sui bordi sotto un microscopio a dissezione e più condensata è la cromatina, più scura è la macchia / striscia11.
Questo articolo descrive l'uso del metodo di microdisezione assistita da transilluminazione per l'isolamento di segmenti di tubuli seminiferi che rappresentano fasi specifiche del ciclo epiteliale seminifero. Una volta isolati, i segmenti di tubuli a fasi possono essere soggetti a varie analisi a valle, tra cui analisi biochimiche dell'RNA e delle proteine12,13,14,15,citometria diflusso 16, coltura di tubuli ex vivo17 e immunostaining18. Qui forniamo anche protocolli dettagliati a valle per preparare monostrati schiacciati di segmenti di tubuli a fasi per l'analisi morfologica delle cellule vive e la successiva immunostaining, nonché immunosottenimenti a montaggio intero di segmenti di tubuli. Il flusso di lavoro in breve descritto nella figura 4.
Il metodo di microdisezione assistita da transilluminazione consente un'accurata identificazione e isolamento delle cellule germinali in specifiche fasi di differenziazione grazie alla composizione cellulare sincronizzata degli stadi. È importante sottolineare che consente anche lo studio di eventi dipendenti dallo stadio durante la spermatogenesi sul tessuto vivo. Data la mancanza di modelli scalabili in vitro per la spermatogenesi, questo metodo ha anche un vantaggio unico di consentire studi mirati di sviluppo a breve termine e tossicologici su segmenti di tubuli specifici per stadio ex vivo12,17. Mentre descriviamo il metodo qui per il topo, la stessa procedura può essere applicata a qualsiasi specie di mammiferi con disposizione longitudinale e segmentale di stadi epiteliali seminiferi, come ilratto 4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

La spermatogenesi è un processo di differenziazione unico che alla fine dà origine a uno dei tipi cellulari più distinti del corpo, lo sperma. La differenziazione delle cellule germinali avviene nelle sacche citoplasmatiche delle cellule somatiche di Sertoli che ospitano da 4 a 5 generazioni di cellule germinali contemporaneamente e coordinano e sincronizzano il loro sviluppo. Pertanto, la composizione dei tipi di cellule germinali all'interno di una sezione trasversale è costante, e queste associazioni cellulari sono anche note come stadi (I-XII) del ciclo epiteliale seminifero. È importante sottolineare che gli stadi possono anche essere identificati da tubuli seminiferi intatti in base alle loro caratteristiche differenziali di assorbimento/dispersione della luce rivelate dalla transilluminazione, e al fatto che gli stadi si sus seguono lungo il tubulo in ordine numerico. Questo articolo descrive un metodo di microdisezione assistita da transilluminazione per l'isolamento di segmenti di tubuli seminiferi che rappresentano stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo. Il modello di assorbimento della luce dei tubuli seminiferi viene prima ispezionato al microscopio a dissezione, quindi i segmenti di tubuli che rappresentano stadi specifici vengono tagliati e utilizzati per applicazioni a valle. Qui descriviamo protocolli immunosottenibili per preparazioni di zucca specifiche dello stadio e per segmenti di tubuli intatti. Questo metodo consente a un ricercatore di concentrarsi su eventi biologici che si svolgono in specifiche fasi di spermatogenesi, fornendo così uno strumento unico per studi di sviluppo, tossicologici e citologici della spermatogenesi e dei meccanismi molecolari sottostanti.

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Questo protocollo descrive la microdissezione assistita dalla transilluminazione di segmenti di tubuli seminiferi di topi adulti che rappresentano stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero, e i tipi di cellule in esso, e la successiva immunostaining di preparati di zucca e segmenti di tubuli intatti.

Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

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6.8K Views.  University of Turku, Turku, Finland. Questo protocollo descrive la microdissezione assistita dalla transilluminazione di segmenti di tubuli seminiferi di topi adulti che rappresentano stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero, e i tipi di cellule in esso, e la successiva immunostaining di preparati di zucca e segmenti di tubuli intatti.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall&#39;epididimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissezione e preparazione coronale fetta di sviluppare la ghiandola pituitaria del Mouse

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissezione, cultura e analisi delle cellule staminali primarie dal mouse per lo studio della delaminazione e della migrazione delle cellule creste neurali

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...