Questa tecnica ci consente di misurare la suscettibilità agli antibiotici in condizioni clinicamente più rilevanti. La tecnica ci consente anche di determinare la vera concentrazione di antibiotici che può uccidere i batteri negli aggregati. Questa tecnica può essere applicata per determinare la concentrazione necessaria per eliminare gli aggregati GC.
Il metodo può anche essere applicato alla misurazione della suscettibilità antimicrobica di qualsiasi batterio in grado di formare aggregati. Prestare attenzione alle fasi di lisi per assicurarsi che lalisi sia completa. Altrimenti il saggio di misurazione ATP sottovaluterà il numero di batteri vitali.
La visualizzazione di questo metodo consentirà ad altri ricercatori di seguire e replicare questo esperimento con coerenza. Inizia striando neisseria gonorrhoeae, o ceppi GC, su agar GCK integrato con 1%Kellogg per un'incubazione da 16 a 18 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. La mattina seguente, usa un microscopio chiaro per selezionare attentamente colonie pili-negative senza bordi scuri o colonie pili-positive con bordi scuri da ogni piastra e strisci le colonie raccolte su nuove piastre GCK per una coltura da 16 a 18 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
La mattina seguente, utilizzare un applicatore sterile per raccogliere colonie gc da ogni piastra e rimescolare ogni tampone in brodo caldo integrato con bicarbonato di sodio al 4,2% e soluzione 1%Kellogg. Misurare la densità ottica a 650 nanometri, o OD650, per determinare la concentrazione dei batteri sospesi e regolare la concentrazione di GC a circa una per 10 alle otto unità di formazione della colonia per millilitro. Successivamente, aggiungere 99 microlitri della sospensione GC in singoli pozzi di una piastra da 96 porri e consentire ai batteri di aggregarsi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore.
Al termine dell'incubazione, aggiungere un microlitro di ceftriaxone diluito serialmente ad ogni pozzo lasciando alcuni pozzi non trattati per fungere da controlli e riportare la piastra all'incubatrice per altre 24 ore. Il giorno dopo, sonicare le sospensioni in ogni pozzo tre volte a 144 watt e 20 kilohertz per cinque secondi per sonicazione e aggiungere 100 microlitri di reagente di utilizzo ATP disponibile in commercio a ciascun pozzo. Trasferire con cura 150 microlitri di miscela da ogni pozzo in singoli pozzi di una nuova micropiastra nera da 96 po 'e misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 560 nanometri su un lettore di piastre.
Quindi, calcola il tasso di sopravvivenza in base al rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento antibiotico seriale e la lettura dai pozzi non trattati. Per la visualizzazione degli aggregati GC vivi/morti, utilizzare un applicatore sterile per raccogliere GC dalle piastre coltivate durante la notte e rimescolare il GC in mezzo GCP prebellico integrato con 1%Kellogg. Misurare l'OD650 per spettrofotometria e regolare la concentrazione a circa una per 10 alle sette unità di formazione della colonia per millilitro.
Successivamente, aggiungere 198 microlitri di sospensione GC in camere con fondo di copra a otto pozzi e incubare le camere a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore. Al termine dell'incubazione, trattare i batteri con due microlitri di ceftriaxone per condizione di aggregazione e restituire le camere all'incubatore per l'appropriato periodo di incubazione sperimentale. Al termine dell'incubazione, aggiungere 0,6 microlitri di soluzione di colorazione viva / morta in ogni pozzo e restituire le camere all'incubatore per altri 20 minuti.
Quindi, utilizzare un microscopio confocale per ottenere immagini della serie Z. Per misurare le dimensioni degli aggregati GC, aprite la prima immagine in ImageJ e selezionate linee a mano libera per cerchiare l'area di ogni aggregazione nell'immagine. Fare clic su analizza e misura.
La dimensione degli aggregati sarà indicata sotto la colonna dell'area. Per quantificare il rapporto di intensità di fluorescenza della colorazione vivo-morto in ogni aggregato, fare clic su analizza e impostare le misurazioni e controllare la densità integrata nella finestra popup. Fare clic su OK e quindi su immagine, colore e strumento canali.
Selezionare il colore e canalizzarne uno come fluorescenza per la colorazione dei batteri morti. Selezionate linee a mano libera per cerchiare l'area di ogni aggregazione e fate clic su analizza e misurate per ottenere il rapporto di intensità della fluorescenza per ogni aggregato nella colonna di densità integrata. Selezionare il canale due per la fluorescenza per la colorazione batterica viva e misurare l'intensità della fluorescenza in ogni aggregato come appena dimostrato.
Quindi dividi i dati sull'intensità della fluorescenza viva per i dati sull'intensità della fluorescenza morta per ottenere il rapporto di intensità della fluorescenza da vivo a morto. In questo esperimento rappresentativo, i batteri pili positivi, aggregati pili positivi o aggregati e interrotti pili positivi non aggregati sono stati trattati con diluizioni seriali di ceftriaxone prima della misurazione dei loro livelli di ATP. Il GC preaggregato ha dimostrato una sopravvivenza significativamente più elevata rispetto al GC non aggregato o interrotto dall'aggregazione se trattato con concentrazioni uguali di ceftriaxone o superiore.
I ceppi pili-positivi che formano aggregati più grandi hanno mostrato i più alti livelli di ATP dopo il trattamento con ceftriaxone rispetto ai ceppi mutanti. Indipendentemente dal ceppo testato, la colorazione viva /morta prima del trattamento antibiotico ha rivelato batteri morti in gran parte situati negli strati esterni della coltura, mentre il GC vivo è stato identificato principalmente all'interno del nucleo degli aggregati trattati con ceftriaxone. Come previsto, i batteri pili-positivi formavano gli aggregati più grandi, mentre le colture pili-negative formavano le più piccole.
In particolare, gli aggregati pili-positivi erano ancora vivi nei loro strati principali dopo il trattamento antibiotico, mentre il GC nei piccoli aggregati mutanti sciolti era morto. In base alle dimensioni e alla sopravvivenza del GC, è possibile tracciare un grafico di correlazione per esaminare la relazione tra la dimensione dell'aggregazione e la sopravvivenza antibiotica dei batteri. La sonicazione è importante per assicurarsi che l'ATP di ogni singolo batterio sia rilasciato all'interno degli aggregati strettamente legati.
In caso contrario, le misurazioni non saranno coerenti. È importante placcare i batteri dopo che si aggregano e vengono trattati con antibiotici per misurare sia i batteri vitali che i batteri capaci di replicazione. La tecnica misura l'influenza dell'aggregazione batterica sulla suscettibilità agli antibiotici consentendo ai ricercatori di sviluppare farmaci migliori per il trattamento delle malattie.
