This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in corso di approvazione dei protocolli IACUC, numerate 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, e 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, manipolazione, e cura etico <ol><li> Raccogliere Gambusia affinis dal sito campo (guida di identificazione a http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) utilizzando un piccolo tuffo rete e posto in 19 L secchi. Utilizzare ispezione visiva per identificare le specie. </li><li> pesce Riposo per 1 - 2 d in un secchio con acqua di stagno. In seguito, il trasferimento del pesce in 76 o 189 carri armati L acquario riempiti con acqua acqua di rubinetto metà stagno / mezza a 25 ° C, gassate con una pietra porosa bubbling. Utilizzare un piccolo tuffo rete durante la manipolazione di pesce come a disturbare minimamente la loro microbiome pelle. NOTA: la densità di pesce non deve essere superiore a 20 pesci / 38 l di acqua. I pesci sono acclimatati per l&#39;acquario per almeno 5 d prima sperimentazione. </li><li> Mangiare pesce su un regime quotidiano con 5 mg di cibo in scaglie per pesci. Hopesce LD con un / 12 h ciclo buio 12 ore di luce. </li></ol> 2. Esposizione antibiotico iniziale per tutti gli esperimenti <ol><li> Disegno tutti i pesci da ogni esperimento dallo stesso acquario, luogo in due gruppi separati (trattati: esposto a antibiotica e di controllo: non esposto) in 19 L secchi. i dati precedenti raccolti mostrano che i pesci nello stesso acquario hanno omogeneizzati microbiomes della pelle che hanno poco variazione nella composizione della comunità. 12 </li><li> Durante gli esperimenti, mantenere i pesci in 2 litri di acqua del laghetto artificiale (PMU; 0,33 g / L CaCl 2, 0,33 g / L MgSO 4, 0,19 g / L NaHCO 3) che viene sterilizzato in autoclave prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il brodo soluzione antibiotica rifampicina con l&#39;aggiunta di 50 mg / mL in dimetilsolfossido (DMSO). La rifampicina è un rappresentante antibiotico ad ampio spettro che non è tossico per i pesci. Negli esseri umani e topi, si distribuisce anche nei tessuti. </li><li> Dal magazzino rifampicina amministrare un finaleconcentrazione di 25 mg / mL in 2 L di PMU per esposizione ad antibiotici del gruppo pesci trattati per 3 giorni. Si noti che dopo 3 d, pelle coltivabili numeri batterica ritorno simile a quello della pelle di pesce pretrattati. </li><li> In parallelo, mantenere un gruppo di pesci non trattate, APW e dare una quantità equivalente di DMSO (0,5 mL per L di PMU) nella colonna d&#39;acqua di agire come gruppo di controllo. </li><li> Come esperimenti sono destinati a misurare gli effetti di un microbiome antibiotico-modificata sulla fenotipi pesce, al fine di evitare effetti direttamente dal antibiotica, dopo l&#39;esposizione di tre giorni antibiotico (o controllo) periodo, pesce trasferimento in un secchio con 2 L di APW fresco. <ol><li> Utilizzare un periodo di riposo 10 h così l&#39;antibiotico viene rimosso dagli organi dei pesci. Base questa volta eliminazione su esperimenti dove i pesci sono stati esposti a 25 ug / ml di antibiotico per tre giorni. Eutanasia il pesce snipping midollo spinale seguita da enervazione, quindi omogeneizzare il tutto il corpo utilizzando una smerigliatrice tessuto.</li><li> Determinare presenza antibiotico ponendo 50 ml di questa sospensione dopo 0,2 micron filtrazione al centro di una capsula di Petri agar. Fare un foro per la sospensione premendo un testa in giù sterile 200 microlitri punta della pipetta nel agar, che rimuove un piccolo plug. </li><li> Utilizzare piastre di agar con 20 mL volume misurato di agar nutriente, e diffondere uniformemente usando un tampone di cotone con un indicatore organismo, Bacillus subtilis, che è sensibile alla rifampicina. Ottenere la B. subtilis da un agar nutritivo incubati a 25 ° CO / N e con il tampone di cotone per ottenere una colonia. Osservando una zona di inibizione dopo incubazione per una notte a 25 ° C indica la presenza di antibiotici nei tessuti dei pesci. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Estrazione <ol><li> Estrarre un campione microbiome pelle dall&#39;epidermide mucose esterne mettendo il pesce in una sterile tubo da 15 ml riempita con 2 ml di PBST sterile (137 mm NaCl, 10 mM fosfato, 0,1% Tween-20, pH 7.4), soluzione e vortex ad una regolazione di 10 per 1 min con 10 s incrementi di pausa. Detergente e sale nel buffer promuove anche la dispersione di batteri in soluzione. Risultati comparabili sono stati trovati con il 0,85% di soluzione salina, ma abbassato conta batterica con acqua pura. </li><li> Trasferire il pesce dal tubo conico di un secchio di recupero. Letalità del estrazione di pelle è in genere inferiore al 10%. O, analizzare la sospensione batterica nel tubo immediatamente dopo estrazione o pellet batteri da un 2 min di spin in una centrifuga a temperatura ambiente a 15.000 xg e conservare a -80 ° C per le analisi future. NOTA: Tutta la cultura e le analisi biochimiche sono immediati; DNA o estrazione di proteine ​​possono essere da campioni congelati. </li><li> Per ottenere un campione intestino microbiome, il primo posto il pesce in una capsula di Petri sterile. Eutanasia il pesce da recidere il midollo spinale cervicale direttamente dietro la testa con le forbici chirurgiche, seguita da enervazione, E poi disinfettare esternamente al corpo 70% salviette etanolo. </li><li> Dopo la dissezione, rimuovere l&#39;intero intestino tagliando dopo l&#39;esofago e prima l&#39;ano. </li><li> Tagliare l&#39;intestino in piccole sezioni 1 - 2 mm di lunghezza e mettere tutte le sezioni in due mL di soluzione PBST in un tubo conico. Dopo vortex per 1 minuto, rimuovere il surnatante in un&#39;altra provetta pulita (fare attenzione a non elaborare sezioni dell&#39;intestino). NOTA: Il surnatante contiene batteri intestinali estratti che possono essere utilizzate sia per le analisi dirette o pellettato con il metodo precedente menzionato per campioni di pelle. </li></ol> 4. L&#39;infezione preparazione del modello e bagno di un agente patogeno specifico <ol><li> Ottenere un ceppo infettivo di Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e mantenere la cultura conservati a -80 ° C. Strain 93-146 utilizzato in questo studio, isolata da un pesce gatto infetto, è stato ottenuto da Mark Lawrence, College di Medicina Veterinaria, Mississippi State University. </li><li> streak E. magazzino ictaluri su un terreno selettivo e differenziale chiamati E. ictaluri dei media (EIM) di agar 19 alla cultura i batteri e incubare per 2 d a 27 ° C. </li><li> Trasferire una colonia pura isolato dalla cultura e inoculare un pallone da 150 ml contenente 40 ml di brodo nutritivo (NB; 5 g / L peptone, 4 g / L estratto di carne). Inserire matraccio in un agitatore impostato a 150 rpm per 2 d a 27 ° C. </li><li> Dopo incubazione, diluire un campione della cultura in PBST ad una lettura spettrometro di 0,2 OD a 650 nm per calibrare E. cultura ictaluri per volumi dose infettante desiderati. </li><li> Trasferimento successivo sia trattata (dopo 3 d di esposizione agli antibiotici) e gruppi di pesci non trattati in singoli bicchieri di plastica contenenti 130 ml di acqua fresca laghetto artificiale, o APW per circa 10 h per clearance del farmaco nei tessuti dei pesci. </li><li> Poi da entrambi i gruppi, trasferire di nuovo ogni pesce in bicchieri di plastica da 8 once contenenti 130 ml di PMU pulito. </li&gt; <li> Dare ad ogni pesce una dose letale contenente 2,8 x 10 6 CFU / ml di E. cultura ictaluri nella PMU (bagno modello di infezione) e tenere in un incubatore a 27 ° per 24 ore. </li><li> Dopo il bagno E. ictaluri, trasferire il pesce singolarmente in nuove tazze con 130 ml di PMU. </li><li> Dopo la sostituzione di acqua, record di pesce mortalità per tutta la durata di una settimana. I pesci non sono alimentati in questo periodo. In contrasto pesce gatto, Gambusia non mostrano segni esterni di infezione, quindi è indispensabile utilizzare letalità come endpoint sperimentale. </li></ol> 5. polimicrobiche sfida con le feci e del suolo <ol><li> Trattamento feci <ol><li> Ottenere feci umane fresche da un volontario sano soggetto che non ha ricevuto antibiotici nelle precedenti due settimane, usando guanti sterili e sterili tubo da 50 ml. </li><li> Al momento la raccolta, raccogliere materia fecale in un sacchetto di plastica sterile e poi trasferire in una sterile 15 ml ctubo onical. Creare una concentrazione magazzino sospendendo feci in PBST per dare una soluzione stock di 500 - 800 mg / mL. Questa miscela di spessore è migliore per trasferire utilizzando un 1 mL o maggiore puntale in plastica che è stato tagliato in basso con forbici sterili modo che l&#39;apertura è più grande. </li><li> Dopo l&#39;esposizione antibiotico iniziale di gruppi di pesci non trattati trattati e di controllo, separato in singoli bicchieri di plastica contenenti sospensione fecale a concentrazioni finali di ciascuna 15 mg / ml o 10 mg / mL in PMU con un volume totale di 130 mL. Tenere tazze in un incubatore a 25 ° C. </li><li> mortalità dei pesci di registrazione durante l&#39;esposizione fecale da un&#39;attenta osservazione su 2 d. </li></ol></li><li> trattamento del suolo <ol><li> Raccogliere 1 - 2 kg di ricco terriccio organico (dovrebbe contenere la più alta densità e la diversità dei microbi) circa 7 - 15 cm verso il basso in modo approfondito e mettere in un contenitore di plastica pulito. Si noti che il terreno deve essere utilizzato entro due giorni seguenti la raccolta. </li><li> terribilectly dopo il periodo di esposizione iniziale, separare i due gruppi di antibiotici trattati e pesce non trattati in singoli bicchieri di plastica contenenti 18,2 g di terreno in 130 ml di PMU. Mescolare il suolo nel pozzo a mano prima di aggiungere il pesce. La maggior parte del particolato non sospendono e rimanere sul fondo della tazza. </li><li> Esporre pesce per una durata di 3 d a 25 ° C e registrare qualsiasi mortalità. </li></ol></li></ol> 6. Sfida stress osmotico <ol><li> Dopo il trattamento, seguito da un periodo di 10 h come descritto sopra, individuare pesci nelle tazze separate contenenti NaCl a 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 mL di PMU. Questa è la metà della tipica salinità dell&#39;acqua di mare, che non è pienamente letale (&lt;50%) per controllare pesce, ma è fortemente stressante, richiedendo osmoregulation efficace. </li><li> Osservare per la mortalità nel corso di un periodo di 36 h. </li></ol> 7. nitrato Tossicità Sfida <ol><li> pesce riposo per un periodo di 10 ore dopo esposizioni antibioticiure, e pesce quindi separata nelle tazze individuali contenenti una concentrazione di nitrato di sodio di 10 mg / mL (118 mM) o 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 mL di PMU. </li><li> Record per la mortalità oltre 4 d per basse dosi e 1 d per alta dose. </li></ol> 8. Analisi crescita dei pesci individualizzato o raggruppati <ol><li> Completa 3 d esposizione agli antibiotici o di controllo periodo come gruppi in secchi. </li><li> Per i singoli, riempire 8-oz tazze di polistirolo con 150 mL APW ciascuna, trasferire un singolo pesce nella tazza e registrare il peso corporeo totale per la valutazione iniziale. <ol><li> Ripetere l&#39;operazione per tutti i pesci in entrambi i gruppi trattati e non trattati. Utilizzare tazze di polistirolo bianche invece di bicchieri di plastica trasparente perché i pesci non mangiare quando nelle tazze chiare. </li></ol></li><li> Mangiare pesce ogni giorno con la dieta standard di due pellet per pesci. I pellet sono stati utilizzati, piuttosto che i fiocchi perché pellet hanno una bassa varianza di massa individuale (3,53 ± 0,42 mg ciascuna, o 8% di variazione), resulting di pesce ricevere simili quantità di cibo. Monitorare il consumo registrando visivamente pellet non consumati. tassi di consumo erano tipicamente superiore all&#39;80%. </li><li> Alla fine di ogni settimana per 4 settimane, determinare il peso del pesce. Preparare una nuova tazza con fresco PMU, posto su una bilancia, e quindi registrare il peso. Poi, versare un pesce in una rete tuffo dalla coppa originale e trasferire nella nuova tazza, che viene poi nuovamente pesati. I pesci non sono gestite per evitare lo stress. </li><li> Per i gruppi, porre 2 L di PMU in un 19 L secchio e tarare la bilancia. Mantenere pesce insieme in entrambi i gruppi durante il trasferimento in nuove secchi APW quindi registrare il peso totale del gruppo. Record di peso gruppo di pesce ogni settimana per un arco di tempo il mese con il trasferimento ad un nuovo secchio. </li></ol> 9. Gut Tempo di transito <ol><li> Utilizzare marcato con fluoresceina 70 kDa destrano anionico. Destrano non è significativamente digerito, ed è troppo grande per essere assorbito attraverso lo strato intestino, quindi passare misurerà il tempo di transito attraverso l&#39;intestino.destrano etichettato è stato incorporato nel cibo per pesci. </li><li> In una sterile 1.7 ml, aggiungere 360 ​​ml di acqua deionizzata sterile e 52 mg di gelatina (soluzione al 13%), e posizionare il tubo su un blocco di calore a 60 ° C fino a quando si scioglie gelatina ed è completamente sciolta. <ol><li> Macinare fiocchi alimentari pesci rossi ad una polvere fine con un mortaio e pestello e aggiungere 40 mg di questa polvere al tubo, insieme a 20 ml di olio di pesce. Dopo la miscelazione, aggiungere 1,6 mg di FITC-destrano. </li></ol></li><li> Versare il composto liquido caldo in 20 microlitri cade sul Parafilm sul banco di laboratorio, e lasciarli raffreddare velocemente e solidificare. Gocce possono essere conservati per un massimo di 4 d prima che diventino troppo difficile per i pesci da mangiare. Conservare gocce in frigorifero posizionando il Parafilm su metà di una capsula di Petri, che viene poi quotata in acqua sterile in un contenitore di plastica sigillato, che mantiene le gocce umidificate. </li><li> Poco prima di alimentazione, quarto scende in sezioni utilizzando una lama di rasoio. Acclimatare il pesce al Styroschiuma tazze individualmente per 2 giorni senza alimentazione (Nota: solo pesce di controllo non esposti sono stati utilizzati). Mettere quattro quarti del cibo nella tazza con il pesce, ed osservare il pesce per 30 minuti per quanti pezzi del cibo che mangiano ogni. </li><li> Per iniziare il periodo di monitoraggio, il trasferimento del pesce individualmente nelle tazze con 80 ml di APW utilizzando una rete di tuffo. Ogni 2 ore, miscelare delicatamente il PMU a mano, e poi prendere un campione e negozio di 1 ml in un tubo di 1,7 ml etichettata a 4 ° C. Prelevare campioni per 36 ore. </li><li> Record fluorescenza, con uno spettrofotometro a fluorescenza, di tutti i campioni allo stesso tempo dopo il completamento del test. Posizionare l&#39;intero campione 1 ml in una provetta, e registrare la fluorescenza misurata con eccitazione a 495 nm ed emissione a 520 nm. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Alcune sfide richiedono un periodo di riposo in PMU pulita dopo il trattamento antibiotico per il farmaco ad esaurirsi nei tessuti dei pesci. Se viene saltato il periodo di riposo poi presenza antibiotico può confondere i risultati, soprattutto quando il saggio comporta l&#39;esposizione ai batteri. Al fine di esaminare gli effetti di una composizione microbiome alterato senza grandi variazioni nel numero totale di microbi sul padrone di casa, esperimenti preliminari monitoraggio della composizione microbiome (16S prof...

È stato stabilito che gli antibiotici possono disturbare il microbioma umano che porta a disbiosi, il che significa uno squilibrio comunità microbica. Alterazione della composizione del microbiota dopo trattamenti antibiotici ha dimostrato di ridurre la diversità della comunità, di ridurre i membri chiave, e alterare il metabolismo della comunità, in particolare nell&#39;intestino 1, 2. Disturbi antibiotico del microbioma intestinale in grado di ridurre la resistenza colonizzazione da Clostridium difficile 3, 4 e 5 Salmonella. Inoltre, l&#39;interruzione del microbiota è stato collegato allo sviluppo di molte sindromi e malattie negli esseri umani (per esempio, associata agli antibiotici enterocolite, malattie infiammatorie intestinali, disturbi metabolici, ecc.). Gli antibiotici sono anche ampiamente implementati in agricoltura come promotori della crescita neibestiame e pollame di produzione 6. L&#39;utilizzo di questi potenti strumenti non è priva di effetti collaterali, che è evidente nel rapido aumento della resistenza agli antibiotici, così come gli effetti di una microbiome perturbato ha con il suo ospite abitato. Molti studi hanno dimostrato che l&#39;ampio spettro di utilizzo di antibiotici ha lunghe conseguenze durature per la struttura e la funzione del microbiota, eppure gli effetti collaterali da un microbiome impatto fisiologia ospite antibiotico-perturbato sono solo speculazioni, che devono ancora essere supportato. L&#39;interazione tra host, microbiota, e antibiotici è ben lungi dall&#39;essere inteso in modo conciso. Pertanto, un modello semplice e più trattabile è vantaggioso per illuminare il sistema di mammiferi molto complesso. mucose negli esseri umani, tra cui l&#39;intestino, il porto la più alta densità e la diversità dei microbi, e anche i più intimi interazioni microbo-ospite. Il microbioma pelle mucosa offre pesce svantaggi everal come sistema modello. Il Teleostei (pesci ossei) è uno dei primi lignaggi a divergere ai sensi vertebrati che teleostei hanno sia innato e acquisito un sistema immunitario che sono co-evoluti un rapporto con le comunità batteriche commensali 7. Azioni pelle di pesce molte caratteristiche con le superfici di tipo 1 mucose di mammiferi, come le funzioni fisiologiche, i componenti di immunità, e la disposizione delle cellule che producono muco 8. La posizione esterna della superficie cutanea pesci mucosa offre microbiome facile da manipolare sperimentalmente e campione. Il mosquitofish occidentale, affinis Gambusia affinis (G.), è un pesce modello che è stato usato in passato per lo studio dell&#39;accoppiamento e tossicologia 9, 10, 11. Data la piccola dimensione, numero di esemplari in natura come una specie invasiva, m<html> costi di assistenza inimal, e la natura resistente, abbiamo sviluppato G. affinis come modello microbiome mucosa. Inoltre, Gambusia condividono la fisiologia del parto a vivere i giovani con i mammiferi vivipari, il che è raro in specie di pesci. Abbiamo completato il più ampio studio al momento della pelle di pesce microbiota normale utilizzando 16S profilatura con Gambusia 12. Ulteriori lavori hanno dimostrato tre effetti negativi sulla serie seguenti interruzione della pelle e flora intestinale con un antibiotico ad ampio spettro 13. Cinque diversi effetti sono stati esaminati nel pesce dopo l&#39;esposizione agli antibiotici. Il vantaggio ospite più consolidata del microbioma è esclusione competitiva di agenti patogeni. Il pesce patogeno Edwardsiella ictaluri è noto per provocare focolai di setticemia enterica in allevamenti di pesce gatto commerciali 14. E. ictaluri è stato anche dimostrato di infettare mortalmente zebrafishclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 e 17 Gambusia. Una sfida con questo patogeno dalla colonna d&#39;acqua può servire come una misura di esclusione. Come confronto suscettibilità a un patogeno individuo, la sopravvivenza durante l&#39;esposizione ad alta densità di organismi misti stata inoltre effettuata. Feci e organico ricco suolo sono stati utilizzati come fonti comunemente riscontrate delle comunità microbiche. Un altro ruolo stabilito la comunità batterica intestinale svolge è l&#39;elaborazione di nutrienti e di energia raccolta, influenzando così l&#39;assorbimento nutrizionale generale per l&#39;host. Come una misura lorda di alimentazione, il peso corporeo del pesce è stato confrontato prima e dopo un mese di essere alimentati con una dieta standard. pesce trattata con antibiotici come media ha perso peso, mentre i pesci di controllo, in media, ha guadagnato peso nel corso del mese. Il meccanismo di questa mancanza di aumento di peso non è chiaro. Una possibile fattore è il tempo di transito del cibo nell&#39;intestino. A Moti GIMetodo lità è stato adattato da zebrafish (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicazione personale) per determinare il tempo di transito. Non è stato ancora determinato se pesci trattati con antibiotici hanno un tempo di transito alterato. Una sfida comune vissuta in un ambiente naturale da parte di tutti gli organismi, in particolare il pesce, è lo stress osmotico. Gambusia hanno dimostrato di adattarsi rapidamente quando acutamente sottolineato in alte concentrazioni di salinità 18. Sorprendentemente, pesce con un microbiome antibiotico-alterato esibito abbassato la sopravvivenza ad un elevato stress salino. Il meccanismo di questo romanzo fenotipo è sotto inchiesta. Un altro sforzo comune relativa agli animali acquatici, soprattutto in acquari, è forme tossiche di azoto (ammoniaca, nitrati, nitriti e). Survival contro nitrati non era significativamente differente tra trattata con antibiotici e controllo dei pesci. I metodi presentati in questo manoscritto possono essere utilizzati con Gambusia o simile modello pesci organismi, come zebrapesce e Medaka, per misurare fenotipi nel pesce seguenti manipolazione sperimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="568">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:127px;">557303-1GM</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS tablets</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6500-OP</td>
			<td>tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Un diagramma schematico generale del sistema sperimentale utilizzato per studiare gli effetti ospitanti pesci da esposizione ad antibiotici 13 è rappresentata nella Figura 1A e comprende la tecnica per estrarre la pelle (Figura 1B) e dell&#39;intestino (Figura 1C) microbiomes dal pesce. Tre giorni è stato selezionato come il periodo di esposizione agli antibiotici, perché dati precedenti rivela che, mentre il n...

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Questo studio coinvolge i metodi per rivelare gli effetti su un host modello di pesce seguito alterazione della pelle e intestino composizione delle comunità microbiome da un antibiotico.

L&#39;esame dei fenotipi host in<em&gt; affinis Gambusia</em&gt; In seguito a trattamento antibiotico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K Views.  Sam Houston State University.  Questo studio coinvolge i metodi per rivelare gli effetti su un host modello di pesce seguito alterazione della pelle e intestino composizione delle comunità microbiome da un antibiotico. 

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Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

L&#39;esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Analisi di basati su reazione a catena della polimerasi quantitativa del Microbiota intestinale murina dopo il trattamento antibiotico orale

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Dereplication antibiotico utilizzando la piattaforma di resistenza agli antibiotici

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...