Ringraziamo il Dott Alicia Mattiazzi per la discussione critica del lavoro presentato. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da NIH (R01 HL-084.487) per ALE.

Questo protocollo e tutto il trattamento i topi è stato approvato dal Institutional Animal Care e Usa Comitato UC Merced (n ° 2008-201). Esperimenti con parrocchetti sono stati condotti nel 1999 secondo le norme generali per uso animale stabilito dalla commissione scientifica dell&#39;Istituto venezuelano per la Ricerca Scientifica (IVIC). 1. Langendorff Set Up Preparazione <ol><li> Preparare la soluzione di Tyrode contenente le seguenti concentrazioni di soluto in mM: 140 NaCl, KCl 5,4, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucosio, 10 HEPES. Regolare il pH della soluzione Tyrode a 7,4 con NaOH e filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Caricare la soluzione Tyrode nei 60 ml siringhe e tutti i tubi del Langendorff orizzontale set-up 11, 12 illustrati nella figura 4. Assicurati di eliminare tutte le bolle d&#39;aria. </li><li><strong&gt; soluzione Equilibrare Tyrode con 100% O 2 utilizzando un &quot;pietra dell&#39;aria&quot; plastica sommerso come illustrato nella figura 4. <ol><li> Collegare tubazione di plastica ad un serbatoio di O 2. </li><li> Aggiungere un adattatore Tee plastica per abbassare un tubo 5 &quot;nella soluzione Tyrode in 60 mL siringa. </li><li> Attaccare una pietra dell&#39;aria plastica alla fine del tubo 5 &quot;così O 2 si bolla fuori nella soluzione Tyrode. </li></ol></li><li> Collocare una sutura chirurgica non assorbibile intorno un ago usato come cannula. L&#39;ago è accoppiato al collettore (vedi Figura 4) che permette retro-perfusione con soluzioni diverse. Infine, l&#39;aorta del cuore sarà incannulata nell&#39;ago. </li></ol> 2. Preparazione degli animali e di cuore Dissection <ol><li> Pesare e iniettare il mouse con eparina (es. Mouse di peso 20 g, iniettare con 20 unità o 200 mL) 15 minuti prima eutanasia da dislocazione cervicale. Anestetizzare parrocchetti secondo to le guide uso animale del vostro protocollo IACUC e poi procedere con la dislocazione cervicale. NOTA: utilizzare 8 settimane di età topi o 20 g di parrocchetti. </li><li> Rimuovere il cuore dalla cavità toracica dopo euthanization. Estrarre cuori parakeet esattamente nello stesso modo descritto per i topi. <ol><li> Pulire il petto del mouse con etanolo. </li><li> Utilizzando forbici dissezione, fare un&#39;incisione nel basso addome e poi tagliare i lati verso il collo. </li><li> Tirare indietro il tessuto tagliato e pin verso il basso. </li><li> Tagliare il diaframma. Fare attenzione quando si taglia il diaframma per evitare di danneggiare il cuore. </li><li> Rimuovere i polmoni e il tessuto circostante. </li><li> Utilizzare le pinzette per raccogliere il cuore senza schiacciarla. Tagliare l&#39;aorta a lungo possibile. </li></ol></li><li> Trasportare il cuore su una piccola barca pesare con circa 1 mL di soluzione Tyrode. </li><li> Utilizzando una sutura chirurgica non riassorbibile, legare l&#39;aorta sopra l&#39;apparato Langendorff orizzontale tramite unago. Legare l&#39;aorta cuore con l&#39;ausilio di due pinzette sottili. Iniziare retro-perfusione aprendo la valvola posta in serie con le siringhe 60 ml contenente soluzione Tyrode. </li><li> Lasciare che il cuore si stabilizzi per 10 min. Utilizzare questo tempo per pulire il sangue e il tessuto adiposo che circonda il cuore prima di caricare il colorante. Estrarre il tessuto adiposo vicino alla base del cuore con le pinzette e tagliato con piccole forbici dissezione. Essere sicuri di fare questo sotto la vista di un microscopio da dissezione. </li></ol> 3. Ca citosolico 2+ Misure: Preparing Dye Rhod-02:00 <ol><li> Aggiungere 20 ml di Pluronic 20% (un tensioattivo non ionico) in DMSO ad una speciale fiala di plastica confezionato fornito dal produttore tintura contenente 50 ug del colorante. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, evitando le bolle. </li><li> Trasferire il DMSO miscelato con il tensioattivo non ionico e il colorante dalla speciale fiala di plastica confezionato in una fiala di vetro chiaro. Aggiungere 1 ml di Tyrode Soluzione al flaconcino di vetro trasparente. </li><li> Con ultrasuoni per 15-20 minuti in un bagno sonicatore. </li><li> Profumato il colorante usando pompe peristaltiche per 30 minuti a temperatura ambiente. <ol><li> Posizionare il colorante nella camera di tintura. </li><li> Utilizzare un morsetto meccanico per comprimere tutte le altre linee di tubi collegati al collettore. La pinza è disposto sopra il collettore. Questo impedirà qualsiasi riflusso nel tubo collegato ai 60 siringhe ml. </li><li> Accendere la pompa peristaltica perfusione per iniziare circola il colorante. Immediatamente chiudere la valvola a 3 vie al di sotto del 60 mL siringa. </li><li> Posizionare un piccolo tubo che è collegato all&#39;aspirazione della pompa peristaltica accanto al cuore per ricircolare il colorante che è stato perfuso nel cuore. </li></ol></li></ol> 4. Intra-SR Ca 2+ Misure: Preparing Dye Mag-Fluo4AM <ol><li> Preparare Mag-Fluo4AM nello stesso modo come Rhod-2 del mattino. Fare riferimento alla Sezione 3 per le istruzioni passo-saggio. </li><li> after caricare il colorante, aprire la valvola posta in serie con le siringhe 60 ml contenente soluzione Tyrode iniziare retro-perfusione. Assicurarsi di rimuovere la fascetta sopra il collettore. </li><li> Aggiungere la soluzione Tyrode alla camera orizzontale e riscaldare a 37 ° C. </li><li> Retro-nei profumi con la soluzione Tyrode per 45 minuti per rimuovere il colorante citosolico. </li></ol> 5. potenziale di membrana Misure: Preparing Dye Di-8-ANEPPS <ol><li> Aggiungere 5 ml di 99% di etanolo al flaconcino di colorante che contiene 5 mg del colorante. </li><li> Aliquota 10 ml in 500 singoli 1 fiale di plastica ml con una pipetta ripetitore. </li><li> Desiccate nel vuoto velocità e conservare a -20 ° C. </li><li> Aggiungere 20 ml di 20% Pluronic in DMSO ad una fiala di plastica con 10 ug del colorante essiccato. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, evitando le bolle. </li><li> Trasferire la miscela contenente DMSO con Pluronic e colorante dalla fiala di plastica ad un cilindro graduato (10 mL). Aggiungere la soluzione Tyrode ad un vo finalelume di 5 ml. </li><li> Con ultrasuoni per 20-25 minuti in un bagno sonicatore. </li><li> Profumato nel cuore per 30 minuti utilizzando pompe peristaltiche. Fare riferimento alle istruzioni graduali nella Sezione 3.5. </li></ol> 6. La registrazione di segnali epicardici <ol><li> Dopo aver caricato il colorante, retro-defluire in cuore con soluzione Tyrode rimuovendo la pinza sopra il collettore. Aprire la valvola posta in serie al ml siringa da 60 contenente soluzione Tyrode. soluzione Tyrode Retro-nei profumi per 10 minuti per stabilizzare il cuore. </li><li> Riempire la camera orizzontale con soluzione Tyrode e accendere l&#39;unità Peltier per portare la temperatura del bagno a 37 ° C. </li><li> Posizionare la fibra ottica sulla superficie del cuore. <ol><li> Posizionare la fibra ottica all&#39;interno di una pipetta 2 ml e quindi collegare la pipetta ad un micromanipolatore. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per premere leggermente la fibra ottica contro la superficie del LV. </li></ol></li><li> Esternamente ritmo il heaRT con uno stimolatore controllato da un generatore di onde. <ol><li> Programmare il generatore di onde fornire un impulso quadrato con una larghezza di 1 ms. </li><li> Impostare lo stimolatore essere sincronizzato esternamente e collegare l&#39;ingresso esterno al generatore d&#39;onda. </li><li> Per ogni uscita dello stimolatore, collegare un filo con un ago da agopuntura saldato alla fine. </li><li> Posizionare entrambi aghi nel vertice del cuore circa 3 mm l&#39;uno dall&#39;altro. </li><li> Solo dopo gli aghi vengono inseriti nel tessuto, attivare l&#39;uscita dello stimolatore per evitare scosse elettriche. </li></ol></li><li> Nel software di acquisizione, regolare frequenza di acquisizione a 10 kHz. </li></ol> 7. La registrazione di segnali endocardici <ol><li> Fare riferimento al punto 6.1 e 6.2 per stabilizzare il cuore dopo aver caricato il colorante. </li><li> Utilizzando un punto 23Ga tagliente delle dimensioni della fibra ottica, fare un piccolo foro nella superficie del cuore nel LV vicino al setto. </li> &lt;li&gt; Inserire un adattatore chirurgia sclerotomie intravitreale per aiutare nel posizionamento della prima fibra ottica nella endocardio con un micromanipolatore. </li><li> Esternamente stimolare il cuore. Fare riferimento al punto 6.4. </li><li> Nel software di acquisizione, regolare frequenza di acquisizione a 10 kHz. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento è centrato nel descrivere le tecniche di campo fluorescenza locali per valutare la funzione dei miociti cardiaci ex vivo. Lo studio di queste cellule in un ambiente accoppiata non solo è più fisiologico, ma è anche molto appropriato per valutare patologie a livello di organo. Gli eventi cellulari sottostanti accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) possono essere valutati a livello organo complesso con l&#39;uso di sonde molecolari che controllano intracellulari Ca 2+ dinamiche (Rhod 2 citosolico Ca 2+, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) e attività elettrica (di-8-ANEPPs). Qui, abbiamo presentato tre tecniche LFFM epifluorescenza che sia eccitare e raccogliere l&#39;emissione da indicatori fluorescenti che utilizzano fibre ottiche. Esse variano in base alla sorgente luminosa utilizzata e dal tipo di modulazione della luce. Il PLFFM utilizza un laser che impulsi di luce, CLFFM utilizza la luce laser in continua, mentre LEDFM usa LED che possono anche essere pulsate nella PLEDFM. Tutti questisono presentati in Figura 1 come un insieme, ma può essere costruito con una sola delle tre modalità epifluorescenza. Inoltre, la luce rilevata può essere elaborata in modi diversi. Ad esempio, la Figura 2 illustra due diverse situazioni in cui la fotocorrente può essere integrato o direttamente convertita in tensione mediante un convertitore corrente-tensione. In generale, l&#39;approccio LFFM può essere utilizzato per misurare contemporaneamente più siti anatomici, come visto per la Figura 3. Il metodo qui presentato per valutare le proprietà cardiache a livello organo intatto è più adeguato per studiare problemi in cui l&#39;accoppiamento tra le cellule è critica nel definire il comportamento del tessuto. L&#39;eterogeneità intrinseca del cuore può produrre diversi AP forme d&#39;onda 13, 21, 22 sulla base dei tessuti specifico da cui ceLLS origine. Pertanto, studi interi organi forniscono la possibilità di valutare la funzione fisiologica locale della cella in diverse strutture anatomiche. Inoltre, abbiamo visto che gli eventi intracellulari, come le scintille e le onde hanno diverse cinetica nelle cellule dissociate rispetto nell&#39;organo intatto 15. Il Langendorff set-up (figura 4) è critico per il mantenimento cuore in una situazione che è più vicino in vivo. Inoltre, permette l&#39;retroperfusion di droghe e varie sonde molecolari fluorescenti che consentono la misurazione di diverse variabili fisiologiche. Modifica delle sonde fluorescenti esogeni utilizzati, aumentando la dimensione della fibra ottica, o scegliendo una sorgente di luce differente può alterare drasticamente l&#39;applicazione della tecnica. Inoltre, l&#39;unità Peltier sotto la camera orizzontale può facilitare lo studio di Ca 2+ dinamiche a varie temperature. L&#39;aggiunta di accessoriper LFFM quale un divisore del fascio può aumentare il numero di fibre ottiche utilizzate per registrare da diverse regioni nel cuore intatto. Questo è un adattamento molto utile per testare se le differenze regionali verificano in scenari patologici. Figura 3 mostra l&#39;endocardio ed epicardio essere valutato simultaneamente. Inoltre, perfusione il cuore con diversi agonisti ci permette di comprendere come le diverse regioni di tutta la parete del ventricolo sono regolati. La segnalazione elettrica (figura 5) e Ca 2+ cinetica (Figura 6) eterogeneità può essere paragonato al epicardio ed endocardio. Inoltre, più coloranti con diverse lunghezze d&#39;onda di eccitazione e filtri di emissione possono essere utilizzati. Ad esempio, utilizzando Mag-Fluo-4, i livelli di Ca 2+ nel lume del SR possono essere registrati (Figura 7). Variando la dimensione della fibra ottica può anche aumentare la capacità di questo metodo, consentendo la registrazione fluorescenza da una larregione ger. Questo documento mostra anche che oltre a laser costosi, i LED possono essere utilizzati come fonte di luce di eccitazione nella nostra tecnica. La Figura 8 mostra che questo tipo economico di sorgente di luce può essere utilizzato per misurare ratiometrically AP. La misura raziometrico mostrato in figura 8 è vantaggiosa nella produzione di una registrazione finale senza artefatti sperimentali comprese quelle causate dal movimento. Infine, anche il transitorio di Ca 2+ e AP possono essere otticamente registrati, contemporaneamente, da multiplexing diverse lunghezze d&#39;onda e l&#39;utilizzo di coloranti con lo stesso spettro di emissione. L&#39;elaborazione dei segnali illustrato nella figura 9 è fondamentale nella rimozione di contaminazione interna prodotta dalla sovrapposizione spettri di emissione dei coloranti. Registrazione Ca 2+ transitori e punti di accesso, contemporaneamente, ma come due segnali di uscita indipendenti, è utile nello studio di ECC e Ca 2+ indotta Ca 2+ </sup&gt; rilascio (CICR), che sono processi in cui queste due variabili sono altamente interconnessi. LFFM è una tecnica con più applicazioni in fisiologia cellulare dei tessuti intatti. Tuttavia, una limitazione importante è che la fluorescenza registrata è una media di emissioni da parte degli indicatori fluorescenti sottostanti della regione locale in cui la fibra ottica è in contatto con il tessuto. Anche quando si utilizzano due fibre ottiche, LFFM non fornisce una distribuzione spaziale subcellulare dei segnali misurati. Mappatura ottica è una tecnica migliore per monitorare le variabili fisiologiche che cambiano nello spazio e nel tempo, come la propagazione delle AP, Ca 2+ transitori, e alternans 23, 24, 25. LFFM è anche in grado di fornire immagini di strutture, come la microscopia confocale e di altre tecniche di mappatura ottica. Tuttavia, l&#39;uso di fibre ottiche rende pratico in recording segnali di fluorescenza locali dalla endocardium o di altre regioni che sono difficili o impossibili da l&#39;accesso in un cuore intatto con un microscopio confocale. Il confronto tra le variabili fisiologiche ottenute dai cuori intatte e dagli esperimenti miociti isolati è impegnativo. Il più grande vantaggio di utilizzare isolati miociti cardiaci è l&#39;occasione unica per valutare le proprietà biofisiche delle cellule in condizioni di patch clamp. Al contrario, LFFM permette lo studio dei fenomeni fisiologici e patologici in un ambiente più nativo. Ad esempio, nei cuori intatti possiamo valutare le differenze transmurale 15, frequenza cardiaca dipendenza di AP e Ca 2+ al fisiologico gamme 13 che sono irraggiungibili in cellule isolate. Inoltre, si possono studiare gli effetti di un insulto ischemico sulla funzione del cuore intatto 9, 10. Tutto il cuore exesperi- permettono anche di valutare l&#39;interazione tra altri tipi di cellule e miociti 11. LFFM permette la visualizzazione dei segnali cellulari a livello del cuore intatto in cui le cellule hanno accoppiamento fisiologico. LFFM consente lo studio dell&#39;attività intracellulare mentre le cellule sono ancora nell&#39;organo intatto. In combinazione con coloranti fluorescenti e epiluminescenza, LFFM può monitorare due principali proprietà cardiaci: Ca 2+ dinamica e l&#39;attività elettrica. Infine, il metodo qui presentato può avere molteplici applicazioni nello studio di ECC. E &#39;uno strumento che rivela come i segnali supramolecolare sono interessati in situazioni patologiche, come aritmie 16 e ischemia 9, 15. Questa tecnica è un must per studiare queste patologie poiché possono essere comprese solo a livello di organo intatto.

Il cuore è l&#39;organo centrale del sistema cardiovascolare. Contrazione del cuore viene avviata da un aumento intracellulare [Ca 2+]. Il rapporto tra eccitabilità elettrica e cambiamenti in intracellulare Ca 2+ stampa è stato storicamente studiato in cellule dissociate enzimaticamente 1, 2. Tuttavia, le cellule cardiache sono elettricamente, metabolicamente e meccanicamente accoppiati 3, 4. Quando isolato, i miociti non sono solo fisicamente disaccoppiati, ma miociti da diversi strati si mescolano durante la dissociazione 5. Inoltre, nonostante gli enormi vantaggi emersi dallo studio delle cellule isolate in condizioni clamp tensione, 6, 7, 8, la natura intrinseca del cuore come un sincizio alwa elettricoys pone la questione di come funzionalmente differenti sono dissociate cellule da quelli presenti nel tessuto 3. In questo manoscritto, descriviamo i progressi conseguiti nella conoscenza della fisiologia cardiaca mediante l&#39;uso di tecniche di microscopia locale campo fluorescenza (LFFM) nel cuore intatto. LFFM utilizza indicatori fluorescenti per misurare più variabili fisiologiche come citosolico Ca 2+, intra sarcoplasmatico reticolo (SR) Ca 2+ e potenziale di membrana. Queste misure possono essere ottenuti simultaneamente e in collaborazione con la pressione del ventricolo 9, 10, elettrocardiogrammi 9, potenziali d&#39;azione elettrici (AP), le registrazioni corrente ionica e flash fotolisi di composti in gabbia 4, 11. Inoltre, queste misurazioni possono essere ottenute stimolazione cuore intatto a frequenze superiori closer per i tassi fisiologici. Sebbene numerosi articoli 9, 11, 12, 13, 14 sono stati pubblicati dal nostro gruppo utilizzando tecniche LFFM, la presunzione di complessità tecniche associate con questa tecnica ha impedito l&#39;uso massiccio nello studio ex vivo fenomeni fisiologici nel cuore e altri organi. La tecnica LFFM (Figura 1) è basata su misurazioni epifluorescenza ottenuti utilizzando una fibra ottica multimodale in contatto con il tessuto. Come qualsiasi tecnica di imaging contatto di fluorescenza, la risoluzione ottica dipende dal diametro e l&#39;apertura numerica (NA) della fibra. Un diametro maggiore NA e più piccola della fibra aumenta la risoluzione spaziale delle misurazioni. AN e diametri delle fibre può variare da 0.22 a 0,66 e da 50 micron a 1 mm rispettivamente. Incordonatura la NA migliorerà il rapporto segnale-rumore (S / N) accettando fotoni che arrivano da un angolo solido più ampio. Per agire come dispositivo epifluorescenza, il fascio di luce viene focalizzato nella fibra ottica con una lente asferica o un obiettivo epifluorescenza dove la NA della lente e la partita fibra. Questa corrispondenza massimizza il trasferimento di energia per l&#39;eccitazione e per raccogliere indietro i fotoni emessi dal fluoroforo. Per eccitare gli indicatori fluorescenti esogeni caricati nel tessuto, diverse fonti di luce e modalità di illuminazione possono essere utilizzati. I nostri studi pionieristici che utilizzano il pulsato campo locale microscopia a fluorescenza 3, 12 (PLFFM) impiegato un laser a basso costo picosecondi (Figura 1a, PLFFM). Questo tipo di sorgente luminosa ha l&#39;enorme vantaggio di eccitare una grande frazione di molecole fluoroforo sotto l&#39;area di illuminazione, senza candeggio sostanzialmente il colorante a causaper il breve impulso durate 12. Inoltre, l&#39;uso di impulsi ultracorti ha permesso di valutare la durata della fluorescenza del colorante 12. La durata della fluorescenza è una proprietà che può essere utilizzato per quantificare la frazione di molecole di colorante legate al Ca 2+. Purtroppo, il jitter temporale degli impulsi e le variazioni di ampiezza di impulso a impulso limitare l&#39;applicazione di questa strategia sperimentale ai casi in cui la variazione di fluorescenza prodotta dal legame al colorante legante è grande. Continuous Wave (CW) laser sono di solito usati come fonte di illuminazione principale di LFFM (figura 1b, CLFFM). Il raggio laser può illuminare continuamente il tessuto oppure può essere ferroelectrically modulata. La modulazione ferroelettrico del fascio permette la generazione di impulsi di luce microsecondi. Questa modulazione può essere controllato da hardware esterno. Questa procedura non solo riduce drasticamente tha jitter temporale degli impulsi di luce, ma permette anche fasci di diverse lunghezze d&#39;onda di miscelazione. La miscelazione di fasci avviene multiplazione raggi di laser diversi. Di conseguenza, diversi coloranti aventi differenti proprietà spettrali possono essere eccitati per effettuare misurazioni di una serie di variabili fisiologiche, per esempio, Rhod-2 per citosolico Ca 2+, MagFluo4 per intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS per potenziale di membrana. Sebbene laser presentano diversi vantaggi come la sorgente luminosa in LFFM, altri tipi di sorgenti di luce possono essere utilizzati compresi diodi emettitori di luce (LED). In questo caso, la sorgente di luce di eccitazione costituito da un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). In LED, i fotoni vengono emessi spontaneamente quando elettroni dalla banda di conduzione si ricombinano con fori nella banda di valenza. La differenza con laser a stato solido è che l&#39;emissione non viene stimolato da altri fotoni. Ciò si traduce in un fascio non coerente euna emissione spettrale più ampia per i LED. Diversi tipi di LED ad alta potenza possono essere utilizzati. Per le registrazioni AP utilizzando Di-8-ANEPPS e Ca 2+ transitori registrati utilizzando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, abbiamo utilizzato un LED che ha un&#39;emissione tipica picco a 485 nm (blu) e mezzo larghezza di 20 nm (Figura 1d). Per Ca 2+ transitori registrati con Rhod-2, il LED ha una emissione tipica picco a 540 nm (verde) e mezza la larghezza di 35 nm (Figura 1d). LED emettono in una lunghezza d&#39;onda di banda e quindi richiedono filtri per restringere la propria emissione spettrale. Inoltre, la luce pulsata può essere generata ad una velocità di 1,6 kHz con durata di 20 ms. I LED sono state pulsate con un transistore ad effetto di campo MOSFET di potenza veloce. registrazioni simultanee con differenti indicatori possono essere eseguite da time-multiplexing i LED. Sfortunatamente, la luce emessa dai LED è più difficile mettere a fuoco su una fibra ottica rispetto ad un fascio laser. Così, il principale svantaggio di noiing LED è che i loro profili di emissione hanno spostamenti angolari (± 15 °) rispetto all&#39;asse principale e un ottica ausiliaria devono essere utilizzati per correggerlo. In tutte le configurazioni ottiche precedentemente descritte, la luce di eccitazione viene riflessa con l&#39;aiuto di uno specchio dicroico. Il fascio viene successivamente focalizzata da una lente asferica e un obiettivo microscopio su una fibra ottica multimodale che è posizionato sul tessuto. Come in qualsiasi disposizione epifluorescenza, lo specchio dicroico serve anche per separare l&#39;eccitazione dalla luce emessa. Lo spettro della luce emessa viaggia indietro attraverso un filtro barriera per rimuovere ogni eccitazione riflessa. Infine, la luce emessa è focalizzato con un obiettivo su un fotorivelatore (Figura 1). La trasduzione dalla luce a corrente elettrica viene eseguita da fotodiodi a valanga silicio. Questi diodi hanno una risposta veloce e una sensibilità elevata che consente il rilevamento di scarsa luminosità. Ilfotocorrente prodotto dai fotodiodi a valanga può essere amplificato in due modi: un amplificatore di transimpedenza avente un elemento resistivo di retroazione (Figura 1e) o da un integratore per convertire la corrente in una tensione (Figura 1f). Utilizzando il primo approccio, la tensione di uscita è proporzionale alla fotocorrente e la resistenza di feedback. Un tipico esempio di rilevamento resistivo di impulsi laser picosecondi è illustrata nelle figure 2a, 2b e 2c. Pannello 2a illustra l&#39;uscita dell&#39;amplificatore transimpedenza e il pannello 2b mostra un&#39;espansione tempo dell&#39;intervallo indicato con un asterisco (*). Un algoritmo di picco di tracciamento è stato realizzato per rilevare il picco (rosso) e la base (verde) per le risposte fluorescenti 12. La misurazione della fluorescenza di base fornisce informazioni sia della corrente scura del fotodiodo a valanga e le interferenze introdotto da lig ambientHT e accoppiamento elettromagnetico. Una rappresentazione di picchi e basi è mostrato in figura 2c. Questa figura illustra la fluorescenza emessa dal colorante (Rhod-2) legato a Ca 2+ durante il ciclo cardiaco di un cuore che batte pappagallo. Nel secondo metodo, la tensione di uscita dell&#39;integratore è una funzione della retroazione di corrente e capacitivi (figure 2d, 2e, 2f e). Figura 2f mostra due cicli consecutivi di integrazione: la prima senza illuminazione esterna e la seconda con impulsi luminosi applicati da un LED pulsata. Una descrizione dettagliata è presentato nelle figure 2g e 2h. Questo approccio, sebbene più laboriosa, fornisce una grande S / N per l&#39;assenza di rumore termico nel condensatore di retroazione. Lo strumento comprende una fase di temporizzazione che genera tutto il controllo e multiplazione della luce di eccitazione e comanda l&#39;integrazione headstage e resperiodi et. Questo è di solito eseguita con un circuito di elaborazione del segnale digitale che svolge anche una differenziazione digitale del segnale di uscita integrato calcolando una regressione on-line dei dati. Nel caso di utilizzo di un risposte resistivo, qualsiasi scheda di acquisizione A / D può essere utilizzato. Infine, la nostra tecnica LFFM è estremamente versatile e può essere adattato per registrare da più di una regione. Aggiunta di un divisore di fascio nel percorso ottico consente di suddividere la luce in due fibre ottiche. Ciascuna fibra ottica può quindi essere posizionato su diverse regioni di un tessuto, in modo indipendente, eccitare ed emissione registrare da sonde fluorescenti esogeni. Questa modifica ci permette di valutare come anatomica differenze regionali influenzano variabili fisiologiche. La figura 3 mostra un divisore di fascio essendo impiegato per dividere la luce di eccitazione CW sono usati in modo tale che due fibre ottiche per misurare transmurale intracellulare elettrico o [Ca 2+] i livelli ingegnoh minore invasività. segnali transmurale possono essere registrati mettendo una fibra sul endocardio e l&#39;altra sullo strato epicardio della parete ventricolare. Pertanto, la tecnica LFFM ha la capacità di misurare l&#39;andamento temporale dei segnali cellulari in diverse regioni e può essere utilizzato per verificare se i cambiamenti regionali verificano in situazioni patologiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

Nel cuore, studi di segnalazione molecolare sono di solito eseguite nei miociti isolati. Tuttavia, molte situazioni patologiche come ischemia e aritmie possono essere pienamente comprese solo a livello organo complesso. Qui, presentiamo la tecnica spettroscopica locale microscopia a campo a fluorescenza (LFFM) che permette la misurazione di segnali cellulari nel cuore intatto. La tecnica si basa sulla combinazione di un cuore perfuso Langendorff e fibre ottiche per registrare segnali fluorescenti. LFFM ha varie applicazioni nel campo della fisiologia cardiovascolare per studiare cuore in condizioni normali e patologiche. variabili cardiaci multipli possono essere monitorati utilizzando indicatori fluorescenti differenti. Questi includono citosolico [Ca 2+], intra-sarcoplasmatico reticolo [Ca 2+] e potenziali di membrana. Le sonde fluorescenti esogeni sono eccitati e la fluorescenza emessa rilevati con tre diverse disposizioni della tecnica LFFM epifluorescenzas presentato in questo articolo. Le differenze centrali tra queste tecniche sono il tipo di sorgente luminosa utilizzata per l&#39;eccitazione e il modo in cui la luce di eccitazione viene modulata. Il LFFM pulsata (PLFFM) utilizza impulsi di luce laser, mentre onda continua LFFM (CLFFM) utilizza la luce laser continuo per l&#39;eccitazione. Infine, diodi emettitori di luce (LED) sono stati usati come sorgente luminosa terzi. Questa disposizione non coerenti è chiamata ad impulsi microscopia a fluorescenza a LED (PLEDFM).

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Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell&#39;organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.

Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  University of California, Merced.  Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche. 

Video: Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...