La gentilezza e la generosità del Dr. Kent McDonald di UC Berkeley sono molto apprezzate. Ringraziamo un anonimo recensore per molto utili suggerimenti. Il laboratorio Burch-Smith è supportato da fondi di start-up presso l&#39;Università del Tennessee.

NOTA: La procedura QFS richiede estrema attenzione e cautela da parte dell&#39;utente e che evidenziare queste precauzioni di sicurezza qui come attenzione e note ove applicabili. 1.Preparazione per HPF Run <ol><li> Prima di iniziare la preparazione del campione, accendere il congelatore ad alta pressione seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: L&#39;unità HPF utilizzata in questo protocollo è una unità compatta Wohlwend 02 (Figura 1A), e ci vuole circa un a un&#39;ora e mezzo di procedura di avviamento prima HPF corre può cominciare. <ol><li> Accensione del Wohlwend Compact 02 alta pressione Freezer. <ol><li> Accendere lo strumento ruotando l&#39;interruttore principale da &quot;0&quot; a &quot;1&quot;. </li><li> Rilasciare l&#39;aria compressa alla macchina. </li><li> Rilasciare azoto liquido alla macchina. </li><li> Premere il pulsante &quot;sistema a secco UP&quot;. </li><li> Dopo 30 minuti, premere il tasto &quot;SYSTEM DRY UP &quot;di nuovo il pulsante. </li><li> Premere il tasto &quot;ON / OFF&quot; per accendere lo strumento. </li><li> Premere il tasto &quot;AZOTO&quot;. </li><li> Attendere che la macchina si raffreddi per 20 minuti, anche se il &quot;DRIVE IN&quot; pulsante è già illuminato. </li><li> Il &quot;DRIVE IN&quot; si accende. </li><li> Premere il tasto &quot;DRIVE IN&quot; pulsante. </li><li> Premere il pulsante &quot;AUTO&quot;. </li><li> Il &quot;sistema READY&quot; si accende. </li><li> Inserire la sonda di temperatura e pressione nella camera di pressione e bloccarlo con il perno. </li><li> Premere il tasto &quot;JET AUTO&quot;. Questo passo verifica che l&#39;aumento di pressione e la temperatura diminuiscono sono come desiderato; essenzialmente un giro di prova. Sharp gocce di temperatura e un forte aumento della pressione sono attesi (Figura 1B). </li><li> Effettuare altre due cicli JET. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 Preparazione per la ricng congelati Campioni <ol><li> Riempire una scatola isolata contenente titolari esageratamente con azoto liquido (vedi Avvertenze per la sicurezza), in modo che i titolari sono completamente coperti (Figura 1C). NOTA: Utilizzare DPI compresi cryogloves e occhiali di protezione durante la manipolazione di azoto liquido. </li><li> Collocare il numero appropriato di flaconi contenenti del mezzo FS nei supporti in tubo d&#39;alluminio in azoto liquido (Figura 1C). Con questo protocollo fino a quattro dischi ciascuno contenente un singolo campione può essere collocato in un unico esageratamente. NOTA: I flaconcini devono essere etichettati con un forte strumento come uno scriba diamantato e matita molto morbida. <ol><li> Per fissativo durante QFS utilizzare 1% OsO 4 e il 0,1% di acetato di uranile in acetone 9. Preparare la soluzione in grande volume, dispensare aliquote di 1,5 ml in cryovials e conservare congelati in azoto liquido. NOTA: Seguire le avvertenze di sicurezza per la gestione OsO 4 e acetato di uranile. NOTA: OsO 4 </sub&gt; e acetato di uranile sono sostanze chimiche pericolose e devono essere maneggiati nella cappa indossando opportuni dispositivi di protezione individuale (DPI) tra cui scarpe-piantati chiuso, camice da laboratorio e guanti. NOTA: I cryovials utilizzati per contenere campioni per QFS dovrebbe avere un O-ring duramente per assicurare che i tubi restare sigillati durante il QFS per evitare perdite di OsO 4. </li></ol></li><li> Preparare la pasta di lievito mescolando il lievito di birra con un uguale volume di circa il 10% di metanolo con uno stuzzicadenti o altro strumento fino a quando la pasta è liscia. Il lievito in pasta agisce come crioprotettore extracellulare e viene utilizzato per riempire lo spazio attorno al campione nel supporto del campione. La quantità di pasta dipende dal numero di campioni; per 10 campioni o meno la pasta (1 ml) possono essere miscelati in una provetta. </li></ol> 3 ad alta-pressione di congelamento dei campioni <ol><li> Rimuovere una foglia (o di altri tessuti) di interesse dalla pianta e delicatamente posizionarlo su un pezzo di dentacera l o altra superficie di taglio. Utilizzare un punzone di 2,0 mm o dimensione desiderata per tagliare un campione di foglia. Maneggiare il campione delicatamente con un paio di pinze e lavorare il più rapidamente possibile. </li><li> Lavorare sotto un microscopio da dissezione, collocare il disco foglia nella parte 0.2 mm di tipo A supporto del campione e coprire completamente in pasta di lievito. Assicurarsi che il disco sia completamente piena e la pasta è a livello con il bordo del titolare problema rendendo l&#39;impasto con un pennello fine (Figura 2). </li><li> Posizionare il vettore nel supporto del campione. Coprire il campione con il vettore campione di tipo B, superficie piatta verso il basso. NOTA: Il supporto del campione deve essere asciutto ed a temperatura ambiente. </li><li> Prendere campione portacampione, inserirlo nella macchina e avviare un ciclo di congelamento premendo il tasto &quot;JET AUTO&quot;, che dovrebbe completare in un secondo o due. </li><li> Lavorare il più rapidamente possibile, rimuovere il supporto dalla macchina e posizionare la punta tenendo la sample in azoto liquido nella scatola isolata sulla parte superiore della macchina HPF. Immergere la punta delle due coppie di pinze in azoto liquido per raffreddare loro. NOTA: Dopo il congelamento, i vettori devono essere trattati solo con una pinza azoto raffreddato a liquido. Caldi (temperatura ambiente) pinze sono spesso la causa di fallimento in cryotechniques. </li><li> Aprire un esageratamente contenente il supporto FS, e posizionare il coperchio sul lato della scatola. Con l&#39;aiuto di un paio di pinze azoto raffreddato a liquido, rimuovere delicatamente il disco dal supporto del campione, assicurandosi che il disco è sempre in azoto liquido o di vapore. Lavorare nel vapore di azoto liquido, tenere il tubo FS con una pinza pre-raffreddato e utilizzare l&#39;altro per posizionare il supporto nel flacone FS. Avvitare il coperchio della fiala FS indietro. Non intrappolare qualsiasi azoto liquido nel flaconcino. NOTA: Durante il trasferimento dei campioni di cryovials per QFS, assicurarsi che nessun azoto liquido è intrappolato in fiale. L&#39;azoto liquido si espande 700 volte durante il riscaldamento e qualsiasi Trapped azoto liquido può causare esplosioni durante questo tempo. </li><li> Ripetere i punti da 3.1 a 3.7 fino a quando tutti i campioni desiderati sono congelati. Dischi fogliari multiple contenenti lo stesso tipo di campione possono essere collocati nella stessa fiala. Si noti che il titolare del campione deve essere asciugato e portato a temperatura ambiente tra i funzionamenti di congelamento. Per fare questo in modo rapido, scaldare con un phon, e controllare la sua temperatura al tatto. </li></ol> 4 Preparazione Fermo Sostituzione <ol><li> Immergere completamente il blocco riscaldatore in alluminio in azoto liquido per 10 minuti o fino a quando si ferma ebollizione nucleata. Mentre questo accade, uno strato di ghiaccio secco (1-2 cm) nel fondo del contenitore utilizzato come camera di FS (figura 3). Un contenitore di polistirolo o secchiello per il ghiaccio può essere utilizzato per FS, con ghiaccio o pellet secco schiacciato. </li><li> Inserire velocemente i cryovials contenenti i campioni con la sonda di temperatura nelle righe centrali del blocco riscaldatore. Accertarsi che i coperchi sulflaconi sono strettamente avvitati in modo che i media FS non fuoriesca durante FS. Iniziare la registrazione della temperatura. <ol><li> Effettuare la sonda di temperatura posizionando una termocoppia attraverso la parte superiore di un esageratamente in modo che raggiunga il fondo della provetta. Sigillare il coperchio del tubo con resina modo che non perda liquido fuori. Riempire la provetta con 1,5 ml di acetone all&#39;inizio di ogni esecuzione QFS. </li></ol></li><li> Utilizzando cryogloves isolati o grandi pinze, versare tutto l&#39;azoto liquido dal blocco del riscaldatore. Fare attenzione a non versare i cryovials. NOTA: Utilizzare DPI compresi cryogloves e occhiali di protezione durante la manipolazione di azoto liquido. </li><li> Posizionare il blocco contenente le fiale sullo strato di ghiaccio secco nella camera QFS. Assicurarsi che il blocco viene posizionato in modo che i tubi sono distesi orizzontalmente, ma con una leggera inclinazione verso l&#39;alto. Non ci dovrebbero essere perdite se vengono utilizzati i cryovials corretti. </li><li> Confezione camera QFS con ghiaccio secco in modo che i tubi FS sono coperti, anche se non è necessariocoprire la parte superiore del blocco. Posizionare il coperchio sulla camera. </li></ol> 5. rapida FS NOTA: Eseguire la corsa QFS in una cappa aspirante nel caso in cui qualsiasi perdita di OsO 4 si verifica involontariamente nonostante altre precauzioni. <ol><li> Mettere camera QFS su una piattaforma agitatore rotante in una cappa aspirante e ruotare a 125 rpm per 120 min. Durante questo tempo la temperatura del blocco dovrebbe aumentare gradualmente fino a circa -80 ° C. L&#39;agitazione assicura la miscelazione dei componenti per FS migliori. NOTA: Il posizionamento di shaker nella cappa e la posizione della porta cappa deve essere la stessa per tutta la procedura QFS e per ogni QFS gestite per garantire il riscaldamento costante di campioni. </li><li> Togliere il ghiaccio secco dalla camera e continuare l&#39;agitazione per un&#39;altra ora. NOTA: necessario aumentare la temperatura a circa -15 ° C a -20 ° C. </li><li> Rimuovere i campioni e sonda di temperatura dalla camera QFS e immettere sulagitatore a temperatura ambiente per un altro 10-15 minuti, fino a raggiungere la temperatura ambiente. Interrompere la registrazione della temperatura. </li><li> Durante FS, spegnere la macchina HPF. <ol><li> Chiudere il rubinetto del serbatoio di azoto liquido mentre la macchina HPF viene riempito con azoto. </li><li> Premere il tasto &quot;AZOTO&quot;. </li><li> Attendere che le rosse &quot;PISTONE DOWN&quot; si spegne la luce. </li><li> Premere il tasto &quot;ON / OFF&quot;. </li><li> Premere il pulsante &quot;sistema a secco UP&quot;. </li><li> Interrompere l&#39;alimentazione di aria compressa alla macchina. </li><li> Dopo un minimo di 12 ore (per garantire l&#39;essiccazione di umidità), spegnere la macchina portando l&#39;interruttore principale da &quot;1&quot; a &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6 post FS Processing <ol><li> Rimuovere con cautela il supporto FS con pipette di plastica e posto in apposito contenitore per rifiuti tossici. NOTA: OsO 4 e acetato di uranile sono sostanze chimiche pericolosee deve essere maneggiato nella cappa indossando opportuni dispositivi di protezione individuale (DPI) tra cui scarpe-piantati chiuso, camice da laboratorio e guanti. </li><li> Campioni Lavare quattro volte con il 100% di acetone. Raccogliere i primi due lavaggi e posizionare nel contenitore rifiuti tossici. </li><li> Utilizzando una pinza sottile, togliere i campioni di tessuto dai titolari. Conservare i campioni bagnato con acetone come questo è fatto, e lavorare molto delicatamente per evitare la rottura dei campioni. NOTA: Non è insolito e può effettivamente essere utile avere la pasta di lievito cadono lontano dai campioni a questo punto. La pasta lievito è di solito marrone molto scuro, mentre il tessuto foglia è ancora verde. </li><li> Raccogliere i campioni in cryovials contenenti acetone. Procedere con la preparazione del campione (infiltrazione e embedding) per TEM secondo i protocolli usuali. </li></ol>

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L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing,+cellular+tomography,+and+structural+cell+biology.">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li><li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy.">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il successo del protocollo presentato qui dipende molto l&#39;utente. In primo luogo, una preparazione avanzata è necessaria per garantire che tutti i materiali necessari sono facilmente disponibili e in quantità sufficiente per completare un intero run HPF-QFS. In secondo luogo, l&#39;utente deve lavorare velocemente, passando da passo-a-passo in modo efficiente che minimizza la manipolazione del campione, riducendo così al minimo i cambiamenti allo stato nativo del tessuto. Una volta che i campioni sono congelati e...

La nostra conoscenza della ultrastruttura cellulare proviene principalmente da microscopia elettronica, che possono risolvere dettagli nell&#39;intervallo di pochi nanometri 1. Pur essendo così potente nella risoluzione TEM non è considerato user-friendly, come la preparazione del campione richiede tempo e protocolli laboriosi, e richiede una certa esperienza da professionista. Fissazione tradizionale dei campioni ha combinato l&#39;uso di aldeidi e tetrossido di osmio prima di ulteriori trasformazioni che comprende la disidratazione, inclusione in resina e poi sezionamento per la produzione di sezioni ultrasottili che vengono poi colorate con metalli pesanti. Tuttavia, è noto che la fissazione chimica può produrre artefatti compresi aggregazione proteica e la perdita di lipidi 1, e modifiche alle membrane che influenzano in definitiva più compartimenti cellulari 2. Questi manufatti sono in gran parte attribuite al basso tasso di fissazione e disidratazione a temperatura ambiente 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Cryofixation da alta pressione congelamento (HPF) evita la maggior parte degli artefatti causati dalla fissazione chimica. Il principio di cryofixation è che abbassa il punto di congelamento dell&#39;acqua di 20 gradi, rallenta la nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio e aumenta la viscosità dell&#39;acqua in un campione biologico in modo che costituenti cellulari sono essenzialmente immobilizzati 6, 7. HPF diminuisce un temperatura del campione a quella dell&#39;azoto liquido, sotto pressione molto elevata (210 MPa o 2.100 bar) in millisecondi. Quando fatto correttamente HPF impedisce la formazione di grossi cristalli di ghiaccio che possono causare gravi danni alla ultrastruttura delle cellule. HPF può essere utilizzato per fissare i campioni di 100-200 micron di spessore a concentrazioni tipiche di soluti biologici 7. Ci sono numerose recensioni sulla fisica ei principi di base HPF, ad esempio, 1, 7, 8. Dopo HPF, i campioni vengono incubati a bassa temperatura (-78,5 ° C a -90 &amp;# 176, C) in presenza di solventi contenenti fissativi chimici liquidi organici come tetrossido di osmio, generalmente per un paio di giorni. A questa bassa temperatura, l&#39;acqua del campione è sostituito dal solvente organico, tipicamente acetone o metanolo 1, 9. Pertanto, questo processo è chiamato sostituzione congelamento (FS). Il campione viene poi gradualmente riscaldato e durante questo tempo è fisso, di solito con tetrossido di osmio e acetato di uranile 9. Reticolazione a bassa temperatura ha il vantaggio di fissare molecole che sono immobilizzati 1. FS produce pertanto campioni di qualità superiore rispetto a quelli fissati dalla fissazione chimica convenzionale a temperatura ambiente, in particolare si traduce in una migliore conservazione ultrastrutturale, migliore conservazione di antigenicità e ridotta perdita di componenti cellulari non legati 10, 11. La maggior parte delle FS viene effettuata su periodi di tempo lunghi, in genere fino a diversi giorni. Ciò è particolarmente true per le piante campioni 12, 13, 14. Un protocollo recente sviluppato da McDonald e Webb riduce notevolmente il tempo di FS da diversi giorni a poche ore 15. Nella procedura loro rapida sostituzione congelamento (QFS), FS viene effettuata più di 3 ore, mentre nelle FS super veloce (SQFS) campioni vengono processati in 90 minuti. La qualità dei campioni prodotti da questi metodi è paragonabile a quelli derivanti dai protocolli FS tradizionali. Abbiamo adottato il protocollo QFS per la lavorazione a valle di campioni vegetali dopo HPF. Questo ha dimostrato di risparmiare non solo tempo ma anche denaro, come QFS e SQFS utilizzano apparecchiature di laboratorio comune al posto delle macchine FS disponibili in commercio costosi. Tessuti vegetali sono spesso molto impegnativo per preparare TEM. In media, le cellule vegetali sono più grandi di quanto sia cellule batteriche o animali. La presenza di idrofobica cuticola cerosa, pareti cellulari spesse, grandi vacuoli pieni d&#39;acqua contenenti acidi organici, idrolasi e fenolica compounds che possono occupare fino al 90% del volume cellulare totale 16, e la presenza di spazi aerati diminuisce notevolmente la conducibilità termica del sistema 17. Inoltre, nel caso di impianti, lo spessore del campione supera quasi sempre 20 micron, il limite per l&#39;uso di fissaggio chimico. A questi spessori, la bassa conducibilità termica di acqua impedisce una velocità di congelamento più di -10.000 ° C / sec al centro del campione. Questo tasso è necessaria per evitare la formazione di ghiaccio danneggiare esagonale (cristalli di ghiaccio con una densità più bassa e più grande di 10 a 15 nm) 8. Insieme, questi presentano sfide sia corretto congelamento del campione e FS successive. Tuttavia, cryofixation è il metodo migliore per il fissaggio campioni vegetali. Qui un protocollo per HPF-QFS di campioni di tessuto vegetale è presentato. Si concentra sul modello di specie Arabidopsis thaliana, ma è stato utilizzato anche con Nicotiana benthamiana. I risultati tipici dimostrano che HPF-QFS produce samples di qualità paragonabile a tradizionali HPF-FS in una frazione del tempo. Con aggiustamenti, questo protocollo può essere utilizzato anche per altri campioni biologici relativamente spessi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Poiché la microscopia elettronica a trasmissione 1940 (TEM) ha fornito i biologi con immagini ultra-alta risoluzione di materiali biologici. Tuttavia, a causa dei protocolli laboriose e lunghe che richiedono anche esperienza nella preparazione dei campioni prive di artefatti, TEM non è considerata una tecnica di facile utilizzo. Preparazione del campione Tradizionale per TEM usato fissativi chimici per preservare le strutture cellulari. Di congelamento ad alta pressione è il cryofixation di campioni biologici sotto alte pressioni per produrre velocità di raffreddamento molto rapidi, limitando in tal modo la formazione di ghiaccio, che è dannoso per l&#39;integrità della ultrastruttura cellulare. Di congelamento ad alta pressione e la sostituzione congelamento sono attualmente i metodi di scelta per produrre la morfologia più alta qualità nelle sezioni in resina per TEM. Questi metodi minimizzano i manufatti normalmente connessi con l&#39;elaborazione convenzionale per TEM di sezioni sottili. Dopo cryofixation l&#39;acqua congelata nel campione viene sostituito con il liquidosolvente organico a basse temperature, un processo chiamato sostituzione congelamento. Sostituzione di Fermo è tipicamente effettuata per diversi giorni in dedicati, attrezzature costose. Una recente innovazione permette il processo per essere completato in tre ore, invece dei soliti due giorni. Questo è in genere seguito da diversi giorni di preparazione del campione, che comprende l&#39;infiltrazione e l&#39;inclusione in resine epossidiche prima del sezionamento. Qui vi presentiamo un protocollo che combina il congelamento ad alta pressione e la sostituzione di congelamento rapido che consente la fissazione del campione pianta per essere realizzato in poche ore. Il protocollo può essere facilmente adattato per lavorare con altri tessuti o organismi. Tessuti vegetali sono di particolare interesse per la presenza di spazi aerati e vacuoli pieni d&#39;acqua che impediscono il congelamento senza ghiaccio d&#39;acqua. Inoltre, il processo di sintesi chimica è particolarmente lunghi in piante dovuto a pareti cellulari che impediscono la penetrazione delle sostanze chimiche di profondità all&#39;interno dei tessuti. Tessuti vegetali sono quindi particlarmente impegnativo, ma questo protocollo è affidabile e produce campioni di altissima qualità.

I risultati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando un Wohlwend Compact 02 per HPF (Figura 1A). Uno dei principali vantaggi di questo strumento è la facilità di utilizzo dei vettori dei campioni e dei suoi titolari. Quando si utilizzano altri strumenti, McDonald raccomanda che due utenti devono effettuare la preparazione del campione e HPF, una preparazione dei campioni, mentre l&#39;altro fa il congelamento e trasferimento FS cryovials 9. Tuttavia, il Wohlwend provino vettori...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Views.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Ricerca

Biologia

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Plunge congelamento: uno strumento per l&#39;ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash-e-Freeze: una tecnica innovativa per l&#39;acquisizione di membrana Dynamics con microscopia elettronica

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.