Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione da parte del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Ringraziamo Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee al NTU, Leigh Zerboni presso la Stanford University e il dottor Peter Hoffmann presso l&#39;Università delle Hawaii per la lettura del manoscritto, Yun Chien a NTU per l&#39;assistenza tecnica, e il dottor Wen Wei-Chi in agricoltura biotecnologie Centro di ricerca presso Academia Sinica per un parere tecnico.

topi femmina a 8 - 12 settimane di età sono stati utilizzati per questo studio. C57 / BL6 wild-type (WT) e IL-15 carente (IL15 - / -) topi sono stati acquistati da National Laboratory Animal Centre (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, rispettivamente. IL-15-deficienti (IL15 - / -) e IL-15-dominante (IL15 +/- e IL15 + / +) hanno mostrato un rapporto 1: 3 nella seconda generazione dalla croce di eterozigoti IL15 +/-. Il genotipo di IL-15 - / - mice è stata confermata da analisi PCR. I topi sono stati mantenuti nella struttura specifico patogeno libero (SPF) presso il Laboratorio Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Tutte le procedure di animali, tra cui i materiali ei metodi di anestesia sono stati eseguiti in conformità con il protocollo degli animali approvato dalla National Taiwan University College of Medicine e al Collegio della sanità pubblica Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) (Dichiarazione giurata di approvazione del protocollo Animal 20.130.225). &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Preparazione di aghi agopuntura NOTA: Aghi di agopuntura sono dispositivi medici composti da un&#39;impugnatura ed un&#39;estremità dell&#39;ago (Figura 1A). I diametri dell&#39;ago agopuntura variava da 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Selezioniamo il punto più fine dell&#39;ago per evitare danni potenziali delle cellule eccessivo durante pungendo la pelle. Ci sono 4 differenti lunghezze dell&#39;ago 0,2 mm di cui 13 mm (0,5 pollici), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 pollici) e 50 mm (2,0 pollici) di lunghezza. Un fascio di 10 aghi con spezzone 13 mm, purché la presa migliore confortevole durante oscillazione dell&#39;ago su C57BL / 6 mouse pelle. I parametri possono essere modificati se il metodo viene applicato sulla pelle di animali più grandi o eseguito da ricercatori con mani più grandi. <ol><li> Rimuovere aghi dalla confezione sterile, apirogena. Mettere gli aghi su un telino sterile. </li><li> Usare nastro adesivo per legare l&#39;etichettatura 10 aghi insieme ina fascio (Figura 1B). NOTA: I 10 aghi sono geometricamente disposti a formare una forma cilindrica. Per comodità, utilizzare un pezzo di parafilm per stabilizzare la disposizione prima di applicare il nastro adesivo. Assicurarsi che tutti i punti di ago sono sullo stesso piano. Utilizzando un fascio invece di un singolo ago facilita infusione DNA massima aumentando l&#39;area di contatto tra gli aghi e la cute. </li></ol> 2. Preparazione di un Importo di grandi dimensioni e privo di endotossine plasmidi DNA <ol><li> Trasformare cellule batteriche competenti chimicamente con il DNA plasmidico. </li><li> Selezionare e inoculare una singola colonia batterica in 3 mL di terreno LB contenenti antibiotici e incubare a 37 ° C in un agitatore notte. </li><li> Scalare la cultura diluendo la coltura batterica a 1: 100 a 250 mL di terreno LB con antibiotici e agitazione durante la notte a 37 ° C. </li><li> Preparare una grande quantità di DNA utilizzando un alta quality, endotossine kit di preparazione gratuito plasmide seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: protocollo Acufection richiede un&#39;elevata purezza e una grande quantità di DNA plasmidico. Uso di alta qualità, è consigliabile endotossine e DNA plasmidico purificato colonna. </li><li> Eluire il DNA in acqua sterile. DNA Conservare in piccole aliquote a -20 ° C fino al momento acufection. NOTA: Evitare ripetuti di congelamento e scongelamento del DNA al fine di garantire plasmide di espressione del DNA coerente. </li><li> Diluire DNA plasmidico a 1 mg / ml in PBS sterile per acufection. </li></ol> 3. Procedura per Acufection NOTA: La quantità ottimale di DNA e l&#39;area della superficie della pelle bersaglio può variare per diversi geni e devono essere ulteriormente ottimizzata. La forza spillatura e il numero di volte per disperdere lo strato corneo della pelle può anche variare a seconda dello spessore della pelle. Queste condizioni devono essere determinate con cura dopo aver valutato il livello di espressione del gene transcri acufectedpts da qRT-PCR. <ol><li> Pesare i topi e amministrare tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) mediante iniezione peritoneale. NOTA: 2,2,2-tribromoethanol è un agente anestetico iniettabile che era comunemente usata nei topi. Le soluzioni sono realizzate sciogliendo un grado non farmaceutico 2,2,2-tribromoethanol (2,5 g) in acqua distillata (200 mL) contenente 2,5% di 2-metil-2-butanolo. </li><li> Utilizzare veterinario oftalmologica pomata sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia. NOTA: effetto anestetico sarà indotta a 1 - 2 min. Controllare il pinch riflesso punta a garantire sufficiente profondità dell&#39;anestesia prima del funzionamento. </li><li> Radere la pelle dorsale fianco e applicare una crema depilatoria per sciogliere proteine ​​di cheratina nel fusto del capello. NOTA: L&#39;uso della crema depilatoria per eliminare i peli faciliterà l&#39;infusione di DNA nella pelle. </li><li> Utilizzare batuffoli di cotone imbevuto di acqua per rimuovere la crema depilatoria. NOTA: La crema depilatoria è solubile in acqua. La rimozione completa del wil cremal prevenire una superficie unta e garantire un risultato migliore puntura. </li><li> Usare un tampone di cotone sterile imbevuta di etanolo al 70% per disinfettare la superficie della pelle. </li><li> Mark l&#39;area di destinazione (1 cm x 1 cm) sulla pelle depilata con uno stampino predosato. NOTA: In occasione del sito di destinazione vi aiuterà ad applicare il fascio ago su e giù all&#39;interno di un&#39;area definita. Questo è importante per garantire la consegna della stessa quantità di DNA ad una superficie specifica per minimizzare la variazione esperimento a esperimento. </li><li> Una goccia 10 ml di DNA plasmidico (10 ug) sulla pelle sensibile. NOTA: La quantità di DNA per acufection varia con differenti geni e il tipo di vettore di espressione. La quantità di DNA usato deve essere attentamente titolato prima di effettuare l&#39;esperimento di interesse. Il 10 microlitri è una piccola goccia di liquido e si siede bene sulla pelle rasata e depilate senza rotolare giù mentre puntura. Includere un gruppo di controllo di topi trattati con 10 microlitri vuoto vettore di DNA da confrontare con un topicufected con il gene di studio. </li><li> Tenere il fascio di agopuntura (Figura 1B) e forare la superficie contrassegnata con un movimento su e giù per 100 volte o finché l&#39;umidità dal DNA in PBS sulla pelle scompare. NOTA: può verificarsi un certo rossore della superficie della pelle. Evita di fare tagli profondi che sanguinano. Il numero di up-and-down pungendo movimenti sulla superficie della pelle è operativamente determinata quando l&#39;umidità dal DNA in PBS (10 mL) scompare sulla pelle. Abbiamo deciso 100 volte in 30 s, perché ha dato i risultati più consistenti da geni acufection-consegnato. Se del caso, gli aghi possono essere riutilizzati per 6 punture pelle bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno). Risciacquare gli aghi in etanolo al 70% e PBS tra acufection. Cambiare per nuovi aghi quando sono spenti o per diversa DNA plasmidico per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> Mettere i topi acufected su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea fino a quando sveglio. </li><li> Rientro topi per loro gabbia quando hannoripreso conoscenza sufficiente. Nota: Tenere topi acufected in gabbia separata (meno di 5 animali per gabbia) dalla gabbia di topi non-acufected. </li><li> Mettere bottiglia d&#39;acqua in luogo e tornare la gabbia alla IVC (gabbie a ventilazione individuale) rack. </li></ol> Cura 4. post-operatorio <ol><li> Per le prime 48 ore dopo la procedura, monitorare attentamente i topi per qualsiasi disagio compresi i cambiamenti comportamentali (irrequietezza, agitazione o disturbo alimentare) o aspetto anomalo (pelo ruvido o la postura ricurva). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) trattamento della pelle IL-15ΔE7-acufected NOTA: l&#39;espressione trascrizionale e proteine ​​produzione di gene acufected sono rilevabili il giorno 3. I topi acufected con il plasmide di interesse può essere trattata con diversi tipi di stimolanti 3 giorni dopo la trasfezione. Illustriamo qui trattando la pelle del mouse IL-15ΔE7-acufected con crema di IMQ. IMQ è un f imidazoquinolin ammina approvatoo trattare genitali esterni e verruche perinatali 13. Il trattamento topico IMQ è mostrato di indurre disturbi della pelle psoriasi-come l&#39;essere umano nei topi con la manifestazione di pelle squamosa, la proliferazione epidermica e l&#39;infiltrazione 12, 14, 15 dei neutrofili cutanea. NOTA: Il vettore plasmidico conteneva intera lunghezza topo IL-15 cDNA, sotto la regolazione del fattore di allungamento-1 α (PEF), fiancheggiata da un peptide segnale IL-2 e un tag FLAG al C-terminale (pEF-IL- 15, 5859 paia di basi), che è stato costruito come descritto da Bamford et al. 16. Il plasmide viene utilizzato come modello IL-15 per eliminare i primi 16 ammino acidi nelle residui 33 - 48 nell&#39;esone 7 del IL-15 gene IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 paia di basi) da SOE (sintesi per estensione sovrapposizione) PCR 17. colonie batteriche che sono stati con successotrasformato con IL-15ΔE7 sono stati verificati mediante digestione con enzimi di restrizione e sequenziamento del DNA seguita da 12, 18. Una grande quantità di DNA plasmidico privo di endotossine è stato preparato come descritto nel passaggio 2 protocollo. <ol><li> Anestetizzare topi acufected mediante iniezione intraperitoneale di tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) e applicare veterinario pomata oftalmica sugli occhi per evitare secchezza sotto anestesia. Controllare il pinch riflesso punta per assicurare sufficiente profondità dell&#39;anestesia prima dell&#39;inizio delle procedure operative. NOTA: Poiché una pelle 2 cm x 2 cm verranno trattati per IMQ, 2 dosi di pil-15ΔE7 DNA plasmidico (10 mg in 10 ml di PBS per dose) è acufected su 2 siti bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno). </li><li> Mark affiancano pelle (2 cm x 2 cm) che copre l&#39;area acufected. </li><li> Utilizzare Q-applicatore per applicare topicamente la crema IMQ sulla superficie contrassegnata. Nota: passo 5.1 viene eseguita soltanto per la prima dose (60 mg / dose).I prossimi dosi consecutive vengono applicati ai topi non anestetizzati. </li><li> Documentare i cambiamenti della pelle dorsale IMQ-trattati giornalmente con una videocamera ad alta definizione. Nota: Una persona tiene il mouse mentre un altro sta registrando. Ancora immagini sono girato e montato in un secondo momento. </li><li> Euthanize topi iniettando una dose eccessiva di tribromoethanol (800 mg per peso corporeo gm) seguita da dislocazione cervicale il giorno 4 o 7 ° giorno dopo il trattamento IMQ. La pelle è asportato ed elaborato (passi 4,1-4,5). </li></ol> 6. Omogenato della pelle del mouse <ol><li> Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per eseguire un taglio orizzontale dalla base della coda. Procedere bilateralmente alla base della arti posteriori e continuare a tagliare verticalmente lungo il fianco alla base dell&#39;arto anteriore. </li><li> sbucciare accuratamente la pelle dal tessuto sottostante dal posteriormente al anteriore. Usare le forbici per tagliare la pelle dorsale. Posizionare la pelle su una piastra di Petri sterile. </li><li> Utilizzare un bisturi per asportare bersagliopelle e congelare in azoto liquido immediatamente. Nota: Le stesse dimensioni della pelle acufected colpo (1 cm x 1 cm) o con il trattamento IMQ (2 cm x 2 cm) è fissato per ogni mouse per minimizzare le variazioni esperimento-to-esperimento. </li><li> Posizionare il tessuto della pelle congelata al centro di un pre-raffreddata malta 2-vano con manici e un pestello. Utilizzare un martello di piombo sulla malta per polverizzare il tessuto. </li><li> posizionare rapidamente il tessuto polverizzato in una nuova provetta contenente 500 ml di reagente di lisi cellulare per l&#39;estrazione di RNA o ad una provetta contenente 50 ml di PBS e 1x proteasi inibitore cocktail avere lisato proteico. </li></ol> 7. H &amp; E e la colorazione immunoistochimica di Sezione della cute <ol><li> Posizionare il tessuto cutaneo in una cassetta e immergerlo in paraformaldeide al 4% durante la notte. </li><li> Incorporare e sezione di tessuto, che nel nostro caso è stato eseguito dal Laboratorio Patologia LAC, NTU. Nota: La sezione è tagliato ad uno spessore di 5 um. Luogo secti tessutions su vetrini con carica positiva. </li><li> Riscaldare le diapositive a 65 ° C per 15 min. </li><li> Porre i vetrini in un rack di colorazione. Immergere il rack in corrispondenti serbatoio contenente sostituto xilene per 5 minuti seguita due volte per immersione sequenziale in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% di etanolo (5 min ciascuna) per la reidratazione. Immergere i vetrini in acqua di rubinetto per 3 minuti prima della colorazione. </li><li> Eseguire ematossilina ed eosina. Nota: H &amp; E macchia è stata eseguita su richiesta al Laboratorio di Patologia presso il LAC, NTU. </li><li> Per macchia immunoistochimica, bloccare la sezione con soluzione blocco a temperatura ambiente per 5 minuti per ridurre il fondo non specifica colorazione. Nota: La soluzione blocco viene sviluppato commercialmente con tecniche di immunoistochimica. Nessun siero animale è contenuto in questo prodotto. </li><li> Immergerlo in PBS per sciacquare la soluzione blocco. </li><li> Diluire la soluzione blocco in PBS a 1:10 e aggiungere 2% di siero fetale bovino (FBS) (soluzione diluente). </li><li&gt; Pipettare l&#39;anticorpo primario opportunamente diluito sulla sezione e incubare per 60 min a temperatura ambiente. Nota: Gli anticorpi sono diluiti in soluzione diluente. concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono stati ottimizzati a 1: 800 e 1: 200 per Ki67 (clone SolA15) e Ly6G (clone 1A8), rispettivamente. Queste concentrazioni si trovano a mostrare macchie distinte, senza colorazione di fondo. <ol><li> Macchiare una sezione serie nello stesso ciclo con la stessa soluzione omettendo l&#39;anticorpo primario per controllare per il legame non specifico dell&#39;anticorpo secondario. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in TBS più 0,1% Tween-20 (soluzione TBST) per 5 minuti ciascuna. Cambio soluzione tra un lavaggio. </li><li> Pipetta una goccia di polimeri etichettate per ogni sezione e incubare a temperatura ambiente per 40 min. Nota: Il polimero marcato viene commercialmente preparato combinando polimeri amminoacidici con perossidasi e l&#39;anticorpo secondario che si riduce ad un frammento Fab&#39;. Il reagente è pronto all&#39;uso percolorazione immunoistochimica di sezioni di tessuto mouse. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in TBST per 5 minuti ciascuno. Cambio soluzione tra un lavaggio. </li><li> Pipetta 3,3&#39;-diaminobenzindine tetraidrocloride soluzione (DAB) sulla sezione di tessuto e lasciare riposare a temperatura ambiente fino un precipitato marrone è visibile sotto un microscopio campo chiaro. Nota: Il tempo per DAB precipitare in presenza di perossidasi è di circa 30 min. </li><li> Immergere i vetrini in acqua per interrompere l&#39;attività perossidasica. Immergere i vetrini in soluzione verde di metile per la colorazione nucleare. Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Posizionare un coprioggetto sulla sezione macchiato che è coperto con montante fisso (8 ml per sezione). </li></ol> 8. fotografia e analisi di macchiato sezione di tessuto <ol><li> Visualizza H &amp; E macchiato e IHC sezioni di tessuto sotto un microscopio a campo luminoso. catturare immagini utilizzando Charge Coupled Device (CCD) collegata al microscopio. per qanalisi QUANTITATIVA, software di imaging può essere utilizzato <ol><li> Scandire l&#39;intera sezioni colorate usando uno ScanScope con un obiettivo 20X. </li><li> Misurare lo spessore epidermico all&#39;interno di un segmento 1 mm dell&#39;epidermide e contare il numero di cellule Ki67-immunoreattive all&#39;interno del segmento. NOTA: quantitativa analisi viene eseguita utilizzando la microscopia automazione e immagine software di analisi. spessore epidermico è definito dalla distanza tra lo strato basale e lo strato più esterno dell&#39;epidermide. </li><li> Contare il numero di cellule Ly6G-immunoreattive nella zona cutanea (230 x 270 um 2 rettangolo) immediatamente sotto topica cutanea IMQ-trattata. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari da dichiarare.

La fase più critica per garantire l&#39;espressione del DNA plasmidico è acufected ad oscillare in modo uniforme e allentare lo strato corneo della pelle. Spingendo gli aghi delicatamente senza tagliare la pelle, la forza dovrebbe essere abbastanza duro per deprimere la superficie. Per facilitare l&#39;assorbimento del DNA in 10 microlitri soluzione su un 1 cm x 1 cm di superficie, gli aghi devono oscillare su e giù per circa 100 volte in 30 s. Si può determinare la forza che deve pungere la pelle e notando il numer...

La pelle è la prima linea di difesa ospite. Cheratinociti (KC) sono il tipo di cellula importante nella pelle degli esseri umani e topi. In risposta a stimoli ambientali (per esempio luce solare, ossigeno, prodotti chimici e invasione patogeni), KC sono attivati e produrre una vasta gamma di citochine proinfiammatorie e chemochine, quali IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α e GM-CSF 1. Insieme innescano il reclutamento di cellule immunitarie per la pelle. Infiammazione cutanea aggravata è spesso associata a numerose malattie umane compresi dermatite da contatto ectopica acuta e l&#39;infiammazione mediata da cellule T cronica (es dermatite allergica da contatto e psoriasi) 2. Modulando risposte proinfiammatorie nella pelle inibendo l&#39;attivazione KC è un approccio plausibile per trattare l&#39;infiammazione cutanea. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per esprimere transitoriamente un gene citochina nell&#39;epidermide per studiare res immunitarioponse conseguenti ad un tale trattamento nella pelle. L&#39;epidermide compone lo strato più superficiale della pelle. Essa funge da barriera fisica mantenendo sostanze esterne come acidi nucleici e patogeni di entrare negli strati più profondi della pelle. Diverse tecniche senza ago sono stati stabiliti per il trasferimento epidermica DNA 3, 4. DNA in soluzione o associata con liposomi cationici o vettori di adenovirus è stata applicata direttamente alla epidermide modificati con tecniche come la rimozione dello strato corneo o il trattamento con il reagente depilazione. Rimozione dell&#39;epitelio corneo facilita DNA attraversare la barriera epidermica e l&#39;interazione con cheratinociti e cellule di Langerhans per indurre risposte immunitarie 5. Mentre una grande area di superficie disponibile per il trasferimento di DNA e questo approccio non comporta aghi, ci sono svantaggi tra cui il requisitoper le grandi quantità di DNA periodo (10 - 100 pg), trattamento duro sulla pelle di strippaggio, ei risultati inconsistenti nell&#39;indurre risposta immunitaria negli animali immunizzati senza consegna DNA richiamo 6. Consegna intracellulare microparticelle mediata da DNA nudo alla pelle ha dimostrato di essere altamente efficiente e riproducibile per indurre la risposta immunitaria 7, 8. Una pistola gene portatile è stato utilizzato per bombardare sito bersaglio pelle con plasmide particelle d&#39;oro rivestite di DNA 2 micron di diametro di dimensioni per mezzo del flusso d&#39;aria in pressione dell&#39;elio 9. Il DNA plasmidico è presumibilmente assorbito dalle cellule dendritiche (DC) KCsand nella pelle e la proteina è espressa localmente o essere trasportati a linfonodi drenanti dalle DC 10. Anche se il sistema di pistola gene è semplice e non richiede esperienza tecnica limitata, il costo per la preparazione e la consegna dei &quot;bul DNAlet &quot;(cioè polvere d&#39;oro, gas elio) e per la pistola gene stesso ha limitato l&#39;applicazione generale. Inoltre, la necessità di un sistema di erogazione di gas elio limita la facilità di trasporto pistola genica quando gli esperimenti sono condotti in luoghi diversi. Microseeding è stato dimostrato per ottenere una maggiore efficienza del trasferimento genico di singola iniezione e bombardamento di particelle 11. Microseeding utilizza una pistola tatuaggio per consegnare il DNA alla pelle senza l&#39;uso di perline di particelle 11. oscillante i microaghi sulla pelle utilizzando questo approccio rischia di raschiare direttamente la membrana cellulare e quindi trasferire il DNA a più celle contemporaneamente. Tuttavia, il dolore associato con il gran numero di iniezioni con aghi 0,254 mm di diametro è uno svantaggio. Qui forniamo un approccio alternativo alla consegna del DNA in vivo. Il &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocollo abbiamo descritto qui fornisce un modo economico ed efficiente per fornire DNA plasmidico in pelle topo. Brevemente, dieci aghi (0,2 mm di diametro x 13 mm di lunghezza) sono stati legati in un fascio con nastro adesivo. Un volume di 10 microlitri di PBS con 10 pg di DNA plasmide contenente il transgene di interesse è stato posto sulla rasata, depilatoria pelle fianco crema-trattata. Utilizzando il fascio di agopuntura oscillare la superficie (1 cm x 1 cm) della pelle, le cheratine a strato corneo sono stati allentati e il DNA plasmidico applicato alla superficie è stato assorbito nell&#39;epidermide. danni alla pelle è stata monitorata ed è risultato essere il minimo. Espressione del gene trasfettato nella pelle acufected stato confermato sia quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) ed ELISA. Gli effetti modulatori del sistema immunitario del acufection consegnate IL-15ΔE7 su infiammazione cutanea sono stati dimostrati utilizzando il modello di topo IMQ-trattati 12. Mentre acufection dimostra di essere un dema facile e menoMetodo nding per la consegna del DNA in vivo, la quantità ottimale di DNA per i diversi geni e le volte per pungere la pelle deve essere attentamente ottimizzata per ottenere risultati riproducibili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

Disregolazione della risposta immunitaria in pelle è associata a numerosi disturbi della pelle umana. Trasferimento diretto dei geni immuno-correlati nel tessuto della pelle è un approccio interessante per indagare la modulazione immunitaria di infiammazione cutanea in modelli murini di malattie umane. Qui vi presentiamo un protocollo costo-efficacia che ha trasportato DNA nudo in pelle mouse e porta alla espressione del transgene. Il metodo è coniato &quot;acufection&quot;, che denota acu DNA puntura mediata fection trans. Per eseguire acufection, pelle di topo è stato infuso con il DNA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi punge leggermente con un fascio di aghi per favorire l&#39;assorbimento di DNA e trasfezione in cellule. Il DNA plasmidico è presumibilmente occupato da cheratinociti e cellule dendritiche (DC) nella pelle ed espresso in proteine. Puntura meccanico con il aghi per sé non ha causato danni alla pelle o indurre attivazione dei cheratinociti. L&#39;espressionedei geni trasfettati è stato rilevato nella pelle sia a livello trascrizionale e traslazionale seguenti acufection per 2 giorni e mantenuto fino a 7 giorni. L&#39;obiettivo primario per lo sviluppo di questo metodo acufection è stato quello di indagare su un&#39;isoforma precedenza indefinito di IL-15. Usando questo metodo, un splicing alternativo IL-15 isoforma con parzialmente eliminato esone 7 (IL-15ΔE7) è stata espressa nella pelle e successivamente trattati con un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), per indurre infiammazione. Acufection consegnate IL-15ΔE7 in pelle soppressa proliferazione dei cheratinociti, spessore epidermico e il reclutamento di neutrofili nell&#39;infiammazione cutanea IMQ-indotta. Con crescente interesse nell&#39;identificazione dei meccanismi regolatori di infiammazione cutanea, il protocollo qui descritto fornisce un costo alternativo efficace e versatile al cannone gene o microseeding per la consegna del DNA in vivo. Essa può consentire potenzialmente scoperta della funzione di un romanzogene in pelle o per indagare nuovo trattamento per le malattie cutanee.

Mentre alcuni rossore era evidente entro la prima ora dopo puntura con aghi di agopuntura, la pelle liberata il giorno 2 ed è stata osservata alcuna reazione avversa cutanea fino al giorno 7 dopo puntura (Figura 2A). Ago che pungono indotto molto basso livello di epidermico orthokeratosis e infiltrazione dermica minima da H &amp; E analisi comparata con la pelle non trattata (Figura 2B). Lo spessore epidermico <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research at JoVE.com

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Questo protocollo è un&#39;alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L&#39;obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea.

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da &quot;Acufection&quot; e la sua applicazione alla ricerca della pelle

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K Views.  National Taiwan University College of Medicine.  Questo protocollo è un'alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L'obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea. 

Video: Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Sviluppo di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modello per studiare l&#39;interazione tra<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

Coltivazione di<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un immunomodulante nematode parassita ei suoi prodotti secreti

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...