Tim Daley e Andrew Smith fornito molte discussioni computazionali utili durante i primi giorni; Tim Daley ha scritto il rotate_translate_cylindrical programma necessario per Protocollo 5. risorse computazionali sono stati forniti dal cluster High Performance Computing presso la University of Southern California. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere # GM098536 (MDD).

Tutte le procedure e il personale sono stati approvati dalla University of Southern California Institute per la cura degli animali e del Comitato uso (IACUC), il protocollo # 11394. 1. Baculum dissezione e preparazione <ol><li> Euthanize un topo maschio sessualmente maturo via anidride carbonica sovraesposizione, secondo i protocolli stabiliti dal comitato competente Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC). </li><li> Posare l&#39;animale in posizione supina, e protrarre le pene facendo pressione con i pollici lateralmente alla apertura del prepuzio. </li><li> Una volta che il pene è protratto, estendere il tessuto attraverso prepuzio quanto possibile. </li><li> Con le forbici, tagliare il corpo prossimale del pene di glande in cui risiede il baculum. </li><li> Trasferire le pene sezionato in una provetta da 1,7 ml e aggiungere acqua di rubinetto 200 l. Assicurarsi che il pene è completamente sommerso nel liquido. </li><li> Incubare il tessuto in acqua a ~ 50 ° C per 3-5 giorni. </li><li&gt; Dopo l&#39;incubazione corretto, rimuovere il tessuto circostante dal baculum, utilizzando una pinza al microscopio dissezione. schizzare delicatamente il 70% di etanolo per spingere fuori il tessuto rimanente e pulire l&#39;osso. </li><li> Posizionare il baculum sezionato in una nuova provetta con il tappo aperto. Lasciare Cappa di apertura / N per asciugare l&#39;osso. </li></ol> 2. microCT Scansione <ol><li> Premere un supporto cilindrico scansione microCT in un mattone di schiuma fiorista per creare un cilindro di schiuma fioraio. </li><li> Estrarre il cilindro di schiuma fioraio e tagliare fette ~ spessore di 2-5 cm. </li><li> Premere bacula essiccati nella schiuma fioraio, intorno alla periferia di una singola porzione di minimizzare le interferenze durante la scansione. L&#39;orientamento preciso delle ossa deve essere osservato che permette per una corretta identificazione dei singoli esemplari nel protocollo 4. </li><li> Posizionare delicatamente la fetta con le ossa incorporato nel supporto microCT. </li><li> Acquisire scansioni microCT. Nel caso di topo Bacula 14 </sup&gt;, Abbiamo utilizzato uno scanner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Svizzera) presso la USC Molecular Imaging Center con le seguenti impostazioni: 90 kVp, 155 μA, 0.5 mm Al filtro, 750 proiezioni per 180 (360 di copertura), il tempo di esposizione di 500 ms, e le dimensioni voxel di 15,5 mm. </li></ol> 3. Il trattamento microCT: Conversione di un .dcm Pila a un file xyz singolo NOTA: Ogni scansione microCT produce una pila di .dcm, o &quot;DICOM&quot;, file che rappresentano fette di immagini scattate attraverso l&#39;oggetto. Tutta la geometria computazionale a valle richiede file xyz piatte, che è semplicemente un file di testo contenente quattro colonne - i x, y, z e coordinate di ogni pixel, e l&#39;intensità del pixel, che vanno da -5.000 (nero) a 5000 (bianca). Una soglia di pixel superiore a 3.000 generalmente funziona bene come soglia per la definizione delle ossa. <ol><li> Installare Python (www.python.org) ei moduli Python COMANDI, DICOM, PYLAB, SYS, e numpy. </li><li> Aperto 01_pr &quot;ocess_dicom.py &quot;{} Figshare con qualsiasi editor di testo. Nella sezione Variabili, percorso cambiamento, le soglie di pixel, e nomi di directory, se necessario. </li><li> Eseguire &quot;python 01_process_dicom.py&quot;. Il progresso verrà stampato a schermo. All&#39;interno di ogni directory chiamata al punto 3.2, un nuovo file è reso nominato; per esempio, directory_name.PT3000.xyz, dove PT3000 indica la soglia di pixel indicato nel passaggio 3.2. </li></ol> 4. elaborazione microCT: Segmentazione-out singolo provino xyz Files <ol><li> Installare R (https://www.r-project.org/) con la RGL biblioteca. </li><li> Aprire il file &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {} Figshare con qualsiasi editor di testo. Nella sezione Variabili, cambiare il nome del percorso per puntare al file xyz creato nel precedente protocollo 3. </li><li> Dall&#39;interno R, eseguire la &quot;fonte ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)&quot; di comando (senza le virgolette). </li><li> Dopo l&#39;immagine tridimensionale del file xyz creato nel protocollo 3 appare, inserire il numbeR di esemplari nel file generale xyz. Poi etichettare e selezionare i punti da ogni campione utilizzando le funzioni di scorrimento e di zoom. NOTA: Sullo sfondo, saranno effettuati i file xyz separati per ogni campione. Questi appaiono in una directory chiamata, ad esempio, XYZ_FILES_PT3000, dove PT3000 indica la soglia di pixel utilizzato. </li></ol> 5. &quot;Allineamento&quot; Specimen xyz File da comuni coordinate. <ol><li> Aprire lo script &quot;03_transform.py&quot; Python {} Figshare, che richiede la mattdean_modules.py modulo aggiuntivo {} Figshare, così come due applicazioni a sé stanti: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm) che sono utilizzati da questo script. </li><li> Nella sezione Variabili, identificare i nomi di percorso completo per mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Inoltre, identificare il percorso completo della directory contenente il .xy individualefile z creato nel passaggio 4. </li><li> 03_transform.py Run, che crea un nuovo file per ogni campione con il suffisso .TRANSFORMED.xyz. </li></ol> 6. &quot;affettare&quot; campioni Allineati xyz File da identificare Semi-punti di riferimento. <ol><li> Aprire ed eseguire lo script Python &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {} Figshare. Nella sezione Variabili, identificare i nomi percorso completo per la directory contenente i file .TRANSFORMED.xyz. Questo script identifica 802 semirimorchi punti di riferimento che possono essere utilizzati per quantificare dimensioni e forma della struttura. </li></ol>

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	<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrics+morphometrics.">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern morphometrics in physical anthropology. 6, (2005).</li><li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Geometric morphometrics for biologists: a primer. , (2004).</li><li>Rohlf, F. J., Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensions+of+the+Procrustes+method+for+the+optimal+superimposition+of+landmarks.">Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks.</a> Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).</li><li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semilandmarks:+a+method+for+quantifying+curves+and+surfaces.">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li><li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+bony+labyrinth+reconsidered,+introducing+a+comprehensive+geometric+morphometric+approach.">The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach.</a> J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).</li><li>Mitteroecker, P., Gunz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+geometric+morphometrics.">Advances in geometric morphometrics.</a> Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).</li><li>Bookstein, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landmark+methods+for+forms+without+landmarks:+morphometrics+of+group+differences+in+outline+shape.">Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape.</a> Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).</li><li>Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F., Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern morphometrics in physical anthropology. , 73-98 (2005).</li><li>Oxnard, C., O'Higgins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+Clearly+Needs+Morphometrics.+Does+Morphometrics+Need+Biology?.">Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology?.</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li><li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice.">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li><li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution.">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li><li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones.">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li><li>Adams, D. C., Ot&#225;rola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=geomorph:+an+R+package+for+the+collection+and+analysis+of+geometric+morphometric+shape+data.">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Le fasi critiche nel protocollo di cui sopra sono: 1) la dissezione del Bacula, 2) la raccolta delle immagini microCT, 3) convertire l&#39;uscita microCT di un file flat di coordinate XYZ, 4) la segmentazione fuori nuvola di punti per ogni campione, 5) trasformando ogni campione per un standardizzato sistema di coordinate, e 6) che definisce semi-punti di riferimento. Questi passaggi possono essere facilmente modificati per accogliere oggetti diversi. Questi metodi possono probabilmente esse...

Il campo di morfometria include una varietà di metodi per quantificare le dimensioni e la forma della forma biologica, un passo fondamentale nella ricerca scientifica 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tradizionalmente, l&#39;analisi statistica di forma e dimensioni comincia identificando punti di riferimento su una struttura biologica, e poi misurando distanze lineari, angoli e rapporti, che possono essere analizzati in un quadro multivariata. Landmark a base geometrica Morfometria è un approccio che mantiene la posizione spaziale dei punti di riferimento, conservando le informazioni geometriche dalla raccolta dei dati attraverso l&#39;analisi e la visualizzazione 5. Generalized Analisi Procrustes (AAP) può essere applicato per rimuovere variazione di posizione, scala e rotazione dei punti di riferimento per produrre un allineamento tra esemplari minimizes le loro differenze squadrate - ciò che rimane è la forma dissomiglianza 7. Un concetto importante di qualsiasi analisi morfometrica è omologia, o l&#39;idea che si possa identificare in modo affidabile punti di riferimento che rappresentano le caratteristiche biologicamente significativi e discreti che corrispondono tra i campioni o strutture. Ad esempio, teschi umani hanno processi omologhi, forami, suture, e condotti che possono consentire le analisi morfometriche. Purtroppo, l&#39;individuazione dei punti di riferimento corrispondenti è difficile in molte strutture biologiche, in particolare quelli con superfici lisce o curve 8, 9, 10. Ci avviciniamo a questo problema di seguito utilizzando la geometria computazionale. Il flusso generale è quello di generare tre scansione tridimensionale dell&#39;oggetto che può essere rappresentato come una nuvola di punti, e quindi ruotare e trasformare questa nuvola di punti in modo che tutti specimens sono orientati su un sistema di coordinate comune. Poi abbiamo matematicamente definiamo semi-punti di riferimento provenienti da regioni specifiche dell&#39;oggetto. Discrete semi-punti di riferimento posti su tali regioni sono biologicamente arbitraria 11. Condurre GPA e successive analisi statistiche in grado di produrre artefatti indesiderabili 8, 12 perché monumenti arbitrariamente collocati non possono essere biologicamente omologa. Pertanto, lasciamo che questi semi-punti di riferimento matematicamente &quot;slide&quot;. Questa procedura riduce al minimo la differenza di potenziale tra le strutture. Come sostenuto altrove l&#39;algoritmo scorrevole usato qui è opportuno quantificare regioni anatomiche simili, privi facilmente identificati punti di riferimento 3, 6, 8, 10, 11, 12 corrispondente. Questi metodi hanno loro limitations 13, ma dovrebbe essere adattabile ad oggetti di dimensione e forma diversa. Qui, illustriamo come questo metodo è stato applicato in un recente studio del baculum del mouse 14, un osso nel pene che è stato guadagnato e perso più volte indipendenti nel corso dell&#39;evoluzione dei mammiferi 15. Discutiamo la dissezione e la preparazione di un osso specifico, il baculum (protocollo 1), la generazione di immagini microCT (Protocol 2), e la conversione di queste immagini in un formato che consente a tutti geometria computazionale valle (protocolli 3 e 4). Dopo questi passaggi, ogni esemplare è rappresentato da coordinate ~ 100K xyz. Abbiamo poi a piedi attraverso una serie di trasformazioni che si allineano in modo efficace tutti i campioni in un orientamento comune (Protocollo 5), quindi definire semi-punti di riferimento da campioni allineati (Protocollo 6). I protocolli 1-4 dovrebbero essere simili a prescindere dell&#39;oggetto analizzato. Protocollo 5 e il protocollo 6 sono specifically progettato per un baculum, ma è la nostra speranza che, in dettaglio questi passaggi, gli investigatori possono immaginare le modifiche che potrebbero essere rilevanti per il loro oggetto di interesse. Ad esempio, sono state applicate modifiche di questi metodi per studiare balena ossa del bacino e le costole 16.

<table><tbody><tr><td>Dissecting scissors</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>Most sizes should work</td></tr><tr><td>Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>To be diluted to 70% for dissections</td></tr><tr><td>Floral Foam</td><td>Wholesale Floral</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>uCT50 scanner&amp;nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection, microct scanning and morphometric analyses of the baculum

morfometria moderni fornisce potenti metodi per quantificare dimensioni e la forma di variazione. Un requisito fondamentale è un elenco di coordinate che definiscono punti di riferimento; tuttavia tali coordinate devono rappresentare strutture omologhe tra i campioni. Mentre molti oggetti biologici costituiti da punti di riferimento facilmente identificabili per soddisfare l&#39;ipotesi di omologia, in molti casi mancano tali strutture. Una possibile soluzione è quella di Matematicamente luogo semi-punti di riferimento su un oggetto che rappresentano la stessa regione morfologica tra i campioni. Qui, illustriamo una pipeline recentemente sviluppato per definire matematicamente semi-punti di riferimento dal mouse baculum (osso del pene). I nostri metodi dovrebbero essere applicabile ad una vasta gamma di oggetti.

Le coordinate XYZ dei semi-punti di riferimento prodotte nel protocollo 6 possono essere importati direttamente in qualsiasi morfometria geometrica analisi punto di riferimento basata su 17. La conduttura di calcolo di cui sopra è stato applicato per studiare topo bacula 14, nonché pelvico balena e costole 16. Maggiori dettagli sulla definizione di calcolo di semi-punti di riferimento sono presentati qui, nel tenta...

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Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Molte strutture biologiche mancano punti di riferimento facilmente definibili, il che rende difficile applicare moderni metodi morfometrici. Qui illustriamo metodi per studiare la baculum mouse (un osso nel pene), compresa la dissezione e la scansione microCT, seguita da metodi computazionali per definire semirimorchi punti di riferimento che sono usati per quantificare dimensione e forma variazione.

Dissezione, microCT scansione e morfometriche analisi del Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  University of Southern California (USC).  Molte strutture biologiche mancano punti di riferimento facilmente definibili, il che rende difficile applicare moderni metodi morfometrici. Qui illustriamo metodi per studiare la baculum mouse (un osso nel pene), compresa la dissezione e la scansione microCT, seguita da metodi computazionali per definire semirimorchi punti di riferimento che sono usati per quantificare dimensione e forma variazione. 

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Medicina

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioingegneria

Biomechanical Testing of Murine Tendons

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, and surgical repair, often fail. In order to define tendon function and demonstrate efficacy of new treatments, the mechanical properties of tendons from animal models must be accurately determined. Murine animal models are now widely used to study tendon disorders and evaluate novel treatments for tendinopathies; however, determining the mechanical properties of mouse tendons has been challenging. In this study, a new system was developed for tendon mechanical testing that includes 3D-printed fixtures that exactly match the anatomies of the humerus and calcaneus to mechanically test supraspinatus tendons and Achilles tendons, respectively. These fixtures were developed using 3D reconstructions of native bone anatomy, solid modeling, and additive manufacturing. The new approach eliminated artifactual gripping failures (e.g., failure at the growth plate failure rather than in the tendon), decreased overall testing time, and increased reproducibility. Furthermore, this new method is readily adaptable for testing other murine tendons and tendons from other animals.

The protocol describes efficient and reproducible tensile biomechanical testing methods for murine tendons through the use of custom-fit 3D printed fixtures.

Test biomeccanici di Murine Tendons

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, ...

Analysis of Craniomaxillofacial Malformations in Mice Using Three-dimensional Microcomputed Tomography

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to specifically inhibit RAR transcriptional activity in mice. This approach allowed us to investigate the effects of VAD on cranial hypomineralization, mandibular deformity, and clavicular hypoplasia in clinical cases. In this study, microcomputed tomography (microCT) scanning of the craniomaxillofacial region of mice represented a valuable tool for studying the growth and development of this animal model. The manual estimation of images is both time-consuming and inaccurate. Hence, here, we present a straightforward, efficient, and accurate approach for segmenting and quantifying the microCT images of each craniomaxillofacial bone. MicroCT software was used to slice the mandible, frontal bone, parietal bone, nasal bone, premaxilla, maxilla, interparietal bone, and occipital bone of mice and measure their corresponding lengths and widths. This segmentation method can be applied to study growth and development in developmental biology, biomedicine, and other related sciences and allows researchers to analyze the effects of genetic mutations on individual craniofacial bones.

Here, we describe in depth a method, which is based on microcomputed tomography, to segment and measure 3D models of craniomaxillofacial bones in mice, for better assessment of craniomaxillofacial bone development in mice than what is possible with current methods.

Analisi delle malformazioni craniomaxillo-facciali nei topi mediante tomografia microcomputerizzata tridimensionale

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to ...

Biologia dello sviluppo

Principi e protocolli dei test meccanici per la suscettibilità alle fratture ossee

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Autore in primo piano: Migliorare l'accuratezza e la riproducibilità nei test di flessione dell'intero osso 

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Biologia

Colorazione HE e micro-TC per valutare la microarchitettura dell'osso trabecolare murino

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton is crucial for gaining insight into the pathophysiology of osteoporosis and improving its treatment. However, handling bone samples can be complex due to their hard and dense properties. Secondly, specialized software makes image processing and analysis difficult. In this protocol, we present a cost-effective and easy-to-use solution for trabecular bone microstructure analysis. Detailed steps and precautions are provided. Micro-CT is a non-destructive three-dimensional (3D) imaging technique that provides high-resolution images of trabecular bone structure. It allows for the objective and quantitative evaluation of bone quality, which is why it is widely regarded as the gold standard method for bone quality assessment. However, histomorphometry remains indispensable as it offers crucial cellular-level parameters, bridging the gap between two-dimensional (2D) and 3D assessments of bone specimens. As for the histologic techniques, we chose to decalcify the bone tissue and then perform traditional paraffin embedding. In summary, combining these two methods can provide more comprehensive and accurate information on bone microstructure.

Autore in primo piano: Un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello di osteoporosi murina 

This protocol presents an economical and efficient method for quantitative evaluation of bone microarchitecture in a mouse model of osteoporosis by combining Hematoxylin-Eosin (HE) staining and micro-computed tomography (Micro-CT) techniques.

Valutazione della microarchitettura dell'osso trabecolare in un modello murino di osteoporosi

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...

Dissezione, microCT scansione e morfometriche analisi del Baculum

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata

Test biomeccanici di Murine Tendons

Analisi delle malformazioni craniomaxillo-facciali nei topi mediante tomografia microcomputerizzata tridimensionale

Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica

Valutazione della microarchitettura dell'osso trabecolare in un modello murino di osteoporosi