Questo metodo consente di generare immagini istologiche tridimensionali da campioni in scala millimetrici di piccole dimensioni, inclusi organismi di piccoli modelli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i campioni incorporati sono molto stabili, consentendo di conservare i campioni per lunghi periodi di tempo e di immaginerli più volte, ad esempio con diversi metodi di imaging nel corso degli anni. L'output di questo metodo sarà altamente utile per la fenomica del sistema di modelli ad alta produttività, la tossicologia e potenzialmente anche la diagnostica dei tessuti umani.
Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché i campioni sono relativamente piccoli e difficili da orientare o manovrare. La dimostrazione visiva è fondamentale perché è necessaria attenzione per evitare danni al campione. Per i pesci zebra giovani o più anziani, affamati per almeno 24 ore al fine di ridurre il volume del contenuto intestinale prima della fissazione.
Spostare il 10% di formalina tampone neutra o NBF e 2x Tricaine-S pre-refrigerata a quattro gradi Celsius sul ghiaccio. Raddoppia il volume dell'acqua di pesce con 2x MS-222 refrigerato per un'eutanasia rapida e umana. Sessanta secondi dopo che il pesce ha smesso di muoversi, dopo l'eutanasia umana, posizionare il pesce in soluzione refrigerata 10%NBF in fiale di vetro a fondo piatto a temperatura ambiente e fissarli durante la notte.
Il secondo giorno, sciacquare gli esemplari di pesce fissi tre volte in 1x PBS pH 7,4 per 10 minuti ciascuno. Dopo il lavaggio, immergere i campioni in 35%etanolo e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione. Quindi ripetere questo passaggio con il 50% di etanolo.
Incubare i campioni in acido fosfotungsteno appena preparato o soluzione di PTA durante la notte a temperatura ambiente con delicata agitazione per macchiarli. Inizia il terzo giorno preparando una miscela uno-a-uno volume per volume di etanolo al 100% e resina acrilica bianca LR. Risciacquare i campioni tre volte in 70%etanolo per 10 minuti ciascuno, quindi incubare i campioni in etanolo al 90% a temperatura ambiente per 30 minuti con agitazione delicata.
Ripetere l'incubazione nelle stesse condizioni ma 95%etanolo e poi altre due volte con 100%etanolo. Alla fine, immergere i campioni in miscela di etanolo uno a uno e resina acrilica bianca LR e incubare a temperatura ambiente durante la notte con delicata agitazione. Il quarto giorno rimuovere la miscela dal flaconcino e aggiungere resina bianca 100%LR per immergere i campioni.
Incubare per due ore a temperatura ambiente con delicata agitazione. Dopo due ore, sostituire la resina con resina bianca fresca 100%LR e incubare per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Per assemblare l'apparato di incorporamento, utilizzare i tubi poli MI con un diametro di almeno 0,1 millimetri più grande del diametro del campione e tagliarlo a una lunghezza standard di 30 millimetri.
Quindi attaccare una testa di micro-tubo P1000 all'estremità bianca dell'adattatore di incorporamento e inserire il tubo poli MI all'estremità stretta. Dopo che i campioni hanno incubato per un'ora in resina bianca 100%LR, trasferirli su una piccola barca di pesata e immergerli completamente in resina bianca 100%LR. Puntare il tubo dell'apparato di incorporamento all'estremità larga del campione fisso, o verso la testa, e pipettare lentamente il campione nel tubo.
Posizionare il campione al centro del tubo, assicurandosi che il tubo sopra e sotto il campione sia riempito con resina. Subito dopo, per sigillare l'estremità aperta del tubo, appiattire un pezzo di argilla modellante morbida a base di olio in un foglio dello spessore di circa un millimetro e stabilizzare il tubo tra indice e dita medie. Quindi premere lentamente l'argilla contro l'estremità del tubo con il pollice e rimuovere l'argilla in eccesso.
Rimuovere l'apparato di incorporamento dalla testa del micro-tubo. Estrarre i tubi con una leggera rotazione. Tenendo un dito contro l'estremità sigillata per evitare l'espulsione dell'argilla, sigillare l'altra estremità spingendo lentamente l'estremità non sigillata del tubo nell'argilla.
Posizionare il tubo orizzontalmente su un rack di tubi e lasciare che la resina polimerizzi per 24 ore a 65 gradi celsius nel forno. Alla fine del giorno successivo, raccogliere i campioni per l'acquisizione di immagini. Una larva zebrafish incorporata con successo non ha bolle d'aria intrappolate.
Se l'aria è intrappolata durante il processo di incorporamento, può spostarsi verso il campione se il campione non viene posizionato orizzontalmente durante la polimerizzazione, il che può degradare la qualità dell'immagine. Questo protocollo è riuscito a incorporare vari organismi modello. Come zebrafish, Drosophila, Daphnia e embrione di topo.
L'incorporamento riuscito può essere mostrato con rendering 3D ricostruiti, immagini mediante scansione micro-CT per zebrafish, Daphnia e Drosophila. L'incorporamento della resina può essere visto in tutte le scansioni al di fuori del campione, ma non interferisce con il campione stesso. Questi campioni possono essere conservati per un lungo periodo di tempo e riutilizzati per più sessioni di imaging, come mostrato con la larva di zebrafish immagine nel 2011.
E poi di nuovo nel 2013. Le caratteristiche anatomiche sono conservate dopo la conservazione, come si vede nei primi piani dei muscoli di entrambe le scansioni. Inoltre, i profili di intensità normalizzati alle loro medie corrispondenti lungo linee segmentate, mostrano picchi locali che corrispondono spazialmente in entrambe le scansioni.
I valori di intensità media per le regioni selezionate in entrambe le scansioni sono stati divisi per una media per lo sfondo e utilizzati per generare rapporti segnale-rumore, che corrispondevano bene tra le scansioni. Durante il tentativo di questo metodo, è importante lavorare delicatamente per evitare danni al campione e lavorare con attenzione per prevenire l'introduzione di bolle d'aria. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'istologia o la microscopia elettronica possono essere usati per studiare modelli di espressione proteica, o ottenere una risoluzione più elevata delle regioni di interesse in 2D.
La nostra speranza è che questa pubblicazione ti aiuti ad accedere alla potenza della micro-TAC tissutale ad alta risoluzione.
