Questo protocollo fornisce un modello riproducibile di polmonite che genera una robusta lesione polmonare acuta. Altri vantaggi di questo modello è che può essere utilizzato per riprodurre l'ARDS infettiva o la sindrome da distress respiratorio acuto nei topi. Come ho detto, questo modello è altamente riproducibile in cui la mortalità e il livello di lesione possono essere facilmente titolati per valutare le fasi precoci e tardive del danno polmonare acuto e la risoluzione, che funge da piattaforma per valutare le strategie terapeutiche.
Sebbene questo protocollo non fornisca un nuovo approccio per la diagnosi o il trattamento del danno polmonare, è un modello affidabile in cui è possibile testare nuove terapie, particolarmente utile per aree legate all'immunologia, alle malattie polmonari e alle malattie infettive. Uno dei vantaggi di questa tecnica è la sua riproducibilità. Tuttavia, le persone che eseguono questa tecnica per la prima volta possono avere difficoltà a inserire il catetere per via intratracheale.
Ecco perché idealmente, le persone che imparano questa tecnica dovrebbero iniziare a esercitarsi negli animali sottoposti a eutanasia. Per iniziare, scalda una piastra di agar sanguigno per 10 minuti a 37 gradi Celsius in uno shaker riscaldato o in un'incubatrice. Prendi una nuova fiala di brodo batterico dal congelatore e scongelala agitandola delicatamente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando la fiala non è completamente scongelata.
Evitare di toccare l'O-ring o il tappo con acqua tiepida. Per contare manualmente le colonie batteriche su una piastra, eseguire una diluizione da 1 volta 10 a 10 al sesto e impiattare 200 microlitri dall'ultima diluizione su una piastra di agar sanguigno preriscaldata. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, determinare la nuova concentrazione batterica applicando la formula data. Posizionare il topo anestetizzato su una superficie pulita e sterilizzata. Appendere il topo per gli incisivi e fissare delicatamente gli arti anteriori.
Radere la regione del collo e disinfettare l'area con clorexidina e alcol al 70%. Quindi, utilizzando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione del collo di un centimetro, sulla linea mediana superficiale, per visualizzare la trachea. Se si nota un'abbondanza di tessuto adiposo, sezionare attentamente il tessuto adiposo verticalmente per visualizzare la trachea.
Tirare delicatamente la lingua verso l'esterno e introdurre un angiocatetere calibro 20 attraverso la bocca, facendo avanzare il catetere nella trachea. Applicare una leggera pressione sulla trachea per facilitare l'intubazione. Dopo l'intubazione, collegare il mouse a un respiratore per confermare l'intubazione.
Impostare i parametri del ventilatore su 200 microlitri di volume corrente e 200 colpi al minuto. Dopo aver confermato l'intubazione, scollegare il topo dal respiratore e instillare con cura 50 microlitri di agente batterico attraverso l'angiocatetere utilizzando una pipetta da 200 microlitri, punta per il caricamento del gel. Dopo l'installazione, collegare nuovamente il mouse al respiratore per facilitare la ripresa della respirazione.
Lasciare il mouse sul respiratore per 30-60 secondi per monitorare la respirazione. Se si osserva un modello di respirazione lenta, collegare nuovamente il mouse al respiratore. Chiudere l'incisione aggiungendo una goccia di colla sulla pelle.
Unire le pieghe della pelle e applicare una leggera pressione fino a quando la colla non si asciuga. Stendere il topo soppresso supino su una tavola chirurgica pulita e appenderlo per gli incisivi. Dopo aver spruzzato la pelle del topo con etanolo al 70%, usando le forbici, fare una piccola escissione superficiale del collo sulla linea mediana per visualizzare la trachea.
Incannulare la trachea con un catetere calibro 20 e aggiungere con cura un millilitro di PBS libero da calcio per via intratracheale utilizzando una siringa da un millilitro. Consentire la completa espansione polmonare, quindi aspirare il fluido utilizzando la stessa siringa. Ripetere la procedura due volte per un totale di due millilitri.
Trasferire il lavaggio broncoalveolare, o BAL, in un'aliquota da due millilitri. Usando le forbici, apri la cavità toracica per esporre il polmone, il cuore e la trachea. Sezionare con cura il diaframma e rimuovere la gabbia toracica assicurandosi di non pizzicare il tessuto polmonare.
Sezionare l'aorta addominale per consentire il dissanguamento. Perfondere il tessuto polmonare praticando una piccola incisione di circa uno o due millimetri nel ventricolo destro usando le forbici e iniettando cinque millilitri di PBS freddo, usando un catetere calibro 20. Dopo una perfusione riuscita, il tessuto polmonare diventa bianco e pallido e la PBS lascia il compartimento intravascolare attraverso l'aorta addominale.
Quindi estrarre con cura il polmone e sezionarlo dalla trachea. In alternativa, se il polmone viene utilizzato per l'istologia, inserire con cautela un catetere calibro 20 per gonfiare i polmoni fino a 25 centimetri con una soluzione di formalina. Una volta che i polmoni sono insufflati, passare una corda di sutura a 3/O lunga circa cinque centimetri sotto la trachea e legarla saldamente due volte per garantire che la formalina rimanga nel tessuto polmonare.
Sezionare delicatamente il polmone dal resto dei tessuti e metterlo in una provetta conica da 15 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione di formalina. Centrifugare il BAL a 500 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere il surnatante privo di cellule in una provetta separata. Lisi i globuli rossi aggiungendo 100 microlitri di tampone lisanti per un minuto.
Neutralizzare la reazione di lisi aggiungendo un millilitro di PBS. Centrifugare il BAL e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 100-300 microlitri di PBS. Successivamente, eseguire una conta cellulare con una colorazione blu di tripano allo 0,4% mediante conta cellulare automatizzata.
Sezionare delicatamente il polmone dai tessuti in una provetta conica da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS freddo. Dopo la dissezione, rimuovere il polmone dal PBS e asciugarlo con un tovagliolo di carta. Sezionare il polmone destro e sinistro da altri tessuti che sono stati estratti come la trachea.
Preparare un cocktail digestivo come descritto nel manoscritto del testo e trasferire il polmone in un tubo C contenente un millilitro di cocktail digestivo. Trasferire la provetta al dissociatore tissutale e seguire il protocollo standardizzato per la lavorazione del tessuto polmonare. Dopo la dissociazione, aggiungere 10 millilitri di PBS freddo nella provetta e mescolare correttamente.
Filtrare la sospensione a cella singola utilizzando un filtro cellulare da 70 micron sopra un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Centrifugare la sospensione e rimuovere il surnatante. Aggiungere un millimetro di tampone di lisi per un minuto a temperatura ambiente.
Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS freddo per fermare la reazione di lisi e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in PBS ed eseguire una conta cellulare con colorazione blu di tripano mediante conta cellulare automatizzata. Dopo il danno polmonare indotto da polmonite batterica nei topi, i gruppi infetti hanno mostrato un peso corporeo inferiore rispetto al controllo non infetto.
Lo streptococcus pneumoniae o gruppo Spn ha recuperato il peso corporeo verso il basale, mentre Klebsiella pneumoniae, o topi infetti da Kpn, hanno mostrato un recupero lento dopo sei giorni dall'infezione. La concentrazione della proteina BAL e la conta totale delle cellule sia per il BAL che per i polmoni erano marcatamente più alte nei gruppi infetti. Sezioni istologiche rappresentative che mostrano il processo infiammatorio in entrambi i modelli sono state ottenute al secondo, quarto e sei giorno dopo le inoculazioni, mostrando evidenza di infiammazione alveolare persistente nei topi infetti da Kpn, anche al giorno 10.
I topi infetti da Kpn hanno continuato la lesione entro il decimo giorno, mentre i topi infetti da Spn hanno risolto l'infiammazione polmonare entro il sesto giorno. Il panorama delle cellule immunitarie mediante citometria a flusso multicolore dopo sei giorni dall'infezione da Spn ha mostrato un aumento del numero di granulociti, macrofagi interstiziali, monociti, cellule B e cellule T, comprese le cellule natural killer. Durante il tentativo di questo metodo, l'inserimento del catetere è la chiave per avere infezioni replicabili.
Si tratta di un metodo affidabile che funge da piattaforma per l'identificazione di bersagli per lo studio del danno polmonare acuto e la risoluzione.
