Vorremmo ringraziare Patrick Hayden (MatTek) per le discussioni utili, e Robert Smith e Libby Perry della Georgia Health Sciences University per le loro abilità EM. Questo studio è stato finanziato dalla dell&#39;NIDCD concedere DC010187 a DAD

1. Preparazione del cabinet biosicurezza per i tessuti EpiAirway <ol><li> Indossando un camice da laboratorio dedicato, con i capelli raccolti sulla nuca e guanti, avviare il flusso laminare. Dopo 5 minuti, spostare qualsiasi strumento nell&#39;armadio (pipette, consigli, provette da centrifuga, ecc) da un lato, spruzzare l&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza e fascia con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare l&#39;interno pulito di nuovo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Spostare gli strumenti per il lato pulito e ripetere la procedura di etanolo. </li><li> Usa aerosol puntali barriera e pipettatori dedicato nel gabinetto. Per utilizzare singolarmente in confezioni sterili pipette sierologiche, passare l&#39;estremità chiusa attraverso il flusso laminare, rompere e far scorrere la pipetta nel cabinet, scartando la confezione esterna. </li><li> Gli inserti EpiAirway devono essere maneggiati con pinze sterili. Posto da 6 pollici messa a punta ricurva dissezione pinze in autosigillanti buste sterilizzazione e autoclave. Preparare basta avere almeno sei al giorno pronti per l&#39;uso. </li></ol> 2. Disimballaggio dei tessuti EpiAirway <ol><li> Spruzzare la superficie di lavoro nel quadro di biosicurezza con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare nuovamente e lasciare asciugare la superficie prima dell&#39;uso. Aprire la finestra di EpiAirway ed eliminare il polistirolo e materiale di imballaggio. </li><li> L&#39;antibiotico-multimediale gratuito manutenzione EpiAirway, AIR-100-MM ABF (MM), è di proprietà di MatTek e viene inviato nel kit con gli inserti. Nel quadro di biosicurezza, l&#39;etichetta sei provette sterili 50 ml con il tipo di supporto e la data, e allentare i tappi. Spruzzare la bottiglia dei media con il 70% di etanolo e aperto all&#39;interno del cabinet. Aliquota 25 ml di MM in ogni provetta utilizzando una nuova pipetta sterile sierologici per ogni tubo, serrare i tappi, e conservare a 4 ° C. Utilizzare una nuova aliquota di MM ogni giorno. </li><li> Ripetere 2.2 sopra utilizzando una bottiglia fresca di 1 X Dulbecco PBS (D-PBS) con calcio e magnesio. Ripetere ancora una volta con D-PBS senza calcio e magnesio. Conservare tutte le aliquote a 4 ° C. </li><li> Gli inserti EpiAirway AIR-100 arriva a un 24-pozzetti a 4 ° C su supporti solidi contenenti agarosio, e devono essere inseriti in 6 pozzetti per l&#39;uso. Etichettare ogni piatto con la data e la descrizione con un etanolo resistente marcatore. Mettere 1 millilitro di 4 ° C MM EpiAirway in ciascun pozzetto. Rimuovere la piastra di trasporto dalla confezione, spruzzare con il 70% di etanolo, e posto nel gabinetto di biosicurezza. Rimuovere il nastro e aprire il piatto. Utilizzando pinze in autoclave, rimuovere la garza umida sopra gli inserti EpiAirway. </li><li> Prendete un inserto con una pinza in autoclave con un movimento rotatorio per aiutare a rilasciarlo dal agarosio, e posto in un pozzo di un 6-pozzetti. Alcuni agarosio possono aderire al inserire, in particolare per quanto la temperatura della piastra di trasporto aumenta di ambiente. Utilizzare un tampone di cotone sterile per rimuovere con attenzione l&#39;agarosio da inserire. Evitare di toccare la membrana, e verificare che non bolle d&#39;aria intrappolate sotto gli inserti. Porre la piastra in un umidificata a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. </li><li> Attendere almeno 24 ore per i tessuti per equilibrare nell&#39;incubatore prima di iniziare co-culture. </li></ol> 3. Mantenimento dei tessuti EpiAirway <ol><li> Utilizzando pinze autoclave, prendere un inserto e delicatamente pipetta 200 microlitri di pre-riscaldato D-PBS con calcio e magnesio sul tessuto e rock l&#39;inserto. Inclinare l&#39;inserto in un angolo e posiziona il puntale sterile P1000 contro l&#39;anello di plastica che tiene la membrana in fondo l&#39;inserto. Non toccare il tessuto. Aspirare il D-PBS sciacquare e posto in una provetta Microbank ™ etichetta sterile. I campioni possono essere congelati a -20 ° C e analizzati per mucina e / o espressione di citochine in un secondo momento. </li><li> Modificare il MM basale quotidianamente da aspirazione e la sua sostituzione con 1 millilitro di MM fresca. Usare un nuovo puntale barriera per ciascun pozzetto. Trattare i supporti utilizzati con il 10% di candeggina durante la notte e scartare. </li></ol> 4. Inoculazione dei tessuti EpiAirway <ol><li> Streak una coltura fresca di nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) dal magazzino glicerolo congelato su agar cioccolato. Crescere durante la notte in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno successivo, risospendere singole colonie di NTHi in pre-riscaldato D-PBS con calcio e magnesio ad un OD (600 nm) di circa 0,7. Energicamente prima di misurare la densità ottica. La relazione tra densità ottica di unità formanti colonia per ml (CFU / ml) di NTHi è che un OD (600 nm) di 0,2 equivale a circa 1,0 x 10 8 UFC / ml. Pertanto, un OD (600 nm) dello 0,7 è di circa 3,5 x 10 8 UFC / ml. Questo algoritmo deve essere convalidato per ogni ceppo NTHi prima dell&#39;inoculazione. </li><li> I tessuti EpiAirway AIR-100 sono coltivate su inserti con una superficie di 0,6 cm 2 e una membrana di 0,4 micron. I tessuti sono composti di circa 8,0 x 10 5 a ~ 1,0 x 10 6 &lt;/ Sup cellule&gt;. Pertanto, un inoculo di 1,0 x 10 7 CFU corrisponde a una molteplicità di infezione di circa 10 - 12. Per inoculare, lavare ogni inserto EpiAirway come in 3.1, quindi aggiungere 28 microlitri della sospensione batterica preparato in 4.2 alla superficie apicale di ciascun frutto EpiAirway nell&#39;armadio biosicurezza. Non inoculare il MM basale. Ritorna ogni piatto per l&#39;incubatrice. </li></ol> 5. Quantificazione dell&#39;inoculo NTHi <ol><li> Preparare un tampone fosfato salino (PBS) soluzione con 0,1% di gelatina (PBS-G), autoclave per sterilizzare. Etichetta sterili da 1,5 ml provette Eppendorf con le diluizioni 1:10 auspicate in base alla OD (600 nm) del 900 microlitri inoculo e aliquota del PBS sterile-G in ciascuna provetta. </li><li> Determinare il numero di piastre di agar cioccolato necessario per enumerare le NTHi inoculato. Posto queste piastre in un incubatore d&#39;aria a testa in giù con la parte inferiore della piastra che poggia su metà della parte superiore per un&#39;ora. Questo permetterà la piastra per entrambi caldo a 37 ° C e asciugare la superficie, facilitando l&#39;abbandono di placcatura NTHi. </li><li> Avviare il diluizioni seriali 1:10 del inoculo con l&#39;aggiunta di 100 microlitri della sospensione batterica da 4,2 a primo tubo. Vortex ogni diluizione vigorosamente per 5 secondi prima di effettuare la successiva. Calo del 10 microlitri aliquote sulle piastre cioccolato pre-riscaldato e superficie secca agar, usando la metà della piastra per ogni diluizione. Cinque o sei aliquote da 10 microlitri può andare bene su una metà di ogni piatto 100 millimetri senza correre insieme. Una volta asciutta, posto a testa in giù in un umidificata 37 ° C incubatore CO 2 durante la notte. </li><li> Il giorno seguente, determinare l&#39;UFC / ml contando le diluizioni che hanno 15-30 colonie distinte in ogni goccia e calcolando di nuovo al vostro inoculo reale vitali di NTHi. </li></ol> 6. A lungo termine co-coltura con NTHi <ol><li> Ogni 24 ore, lavare gli inserti come in 3.1, poi piscina i lavaggi di ogni tessuto che è stato inoculato con lo stesso ceppo di batteri e congelare a -20 ° C in una provetta Microbank ™ etichetta per le analisi future. Questi campioni possono essere analizzati per la presenza di mucina da macchine punto o per l&#39;espressione delle citochine da ELISA. In alternativa, i tessuti possono essere raccolti per mRNA e qPCR possono essere eseguite su geni di interesse. Modificare il MM basale quotidiano come in 3.2. Continua per tutta la durata del co-coltura. </li></ol> 7. La raccolta dei tessuti EpiAirway <ol><li> Preparare una soluzione fresca 1% di saponina in D-PBS senza calcio e magnesio, filtro-sterilizzare e calda a 37 ° C. </li><li> Caldo di un tubo da 50 ml di MM ed un altro di D-PBS senza calcio e magnesio a 37 ° C. </li><li> Preparare i tubi diluizione in 5.1, così come una vuoto sterile provetta Eppendorf da 1,5 ml per inserto, etichettata con il numero di inserimento e deformazione NTHi. </li><li> Il EpiAirways possono essere raccolti sia per totale associato alle cellule dei batteri, che comprende sia gli organismi aderenti e interiorizzato, o per i batteri interiorizzato solo. </li><li> Determinare il numero di piastre di agar cioccolato necessari per drop-piastra la cellula-associato o invaso NTHi, etichetta e asciugare per un&#39;ora in un incubatore d&#39;aria come in 5.2. </li><li> Per raccolto totale associato alle cellule dei batteri, lavare la superficie apicale della EpiAirways tre volte con 200 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio, quindi inclinare l&#39;inserto e risciacquare qualsiasi MM rimanenti dalla membrana basale. Il primo lavaggio può essere congelato per una successiva analisi, scartare i lavaggi successivi. </li><li> Collocare l&#39;inserto lavato in una fresca 6 pozzetti senza MM, e pipetta 250 microlitri della soluzione sterile 1% dal 7,1 saponina sulla superficie apicale di ciascun tessuto. Ritorno al incubatore per 10 minuti. </li><li> Togliere dal termostato, e utilizzando un puntale sterile P1000, macchia i tessuti dalla membrana usando un avanti e indietro movimento, seguito da un movimento circolare per rimuovere il tessuto dai bordi dell&#39;inserto. Utilizzando un grosso puntale sterile P1000, posto la sospensione nella provetta vuota etichetta preparata in 7.3. Aggiungere 250 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio sulla superficie apicale dell&#39;inserto. </li><li> Esaminare l&#39;inserto con un invertito a contrasto di fase microscopio per determinare se ci sono residui di tessuto per essere raccolte. Se necessario, macchia di nuovo con un altro sterile P1000 puntale, quindi aggiungere questa sospensione per il tubo da 7,8 con un grosso calibro sterile puntale P1000. Portare il volume totale del tubo a 1 millilitro utilizzando D-PBS senza calcio e magnesio. </li><li> Vigorosamente vortice la sospensione cellulare alla massima velocità per un minuto. Usando una siringa sterile 1 ml con ago 26 gauge, aspirare la sospensione nella siringa attraverso l&#39;ago. Lentamente passare la sospensione attraverso l&#39;ago 3 volte, facendo attenzione a non creare bolle. Energicamente ancora per un minuto. </li><li> Utilizzando un grosso puntale, posto 100 microlitri della sospensione nella provetta prima diluizione preparata in 7.3. Energicamente per cinque secondi, quindi effettuare diluizioni seriali 1:10. Drop-piastra le diluizioni desiderato sulle piastre cioccolato superficie secca agar. </li><li> Per raccogliere i batteri interiorizzato solo, lavare ogni inserire 3 volte con 200 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio. Conservare e congelare il primo lavaggio. Aggiungere solfato di gentamicina per MM pre-riscaldato a una concentrazione finale di 100 microgrammi / ml. Preparare 1,5 ml di supporti per inserto per essere raccolte. Sostituire la MM basale con la gentamicina contenenti MM, e aggiungere 300 microlitri di gentamicina contenenti MM sulla superficie apicale. Posizionare la piastra posteriore in CO 2 incubatore per un&#39;ora. </li><li> Rimuovere la gentamicina contenenti mm dalla superficie apicale e lavare la superficie apicale e la membrana basale dell&#39;inserto ampiamente pre-riscaldato D-PBS senza calcio e magnesio. Procedere come a 7,7-7,11. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Scansione microscopio elettronico di (A.) EpiAirway tessuto infetto e (B) tessuto dopo 5 giorni di co-coltura con NTHi sono mostrati in Figura 1. Lungo termine co-coltura con NTHi non comporta danni significativi al apicale tessuti, sottolineando l&#39;utilità del modello EpiAirway. Un grafico che rappresenta il numero di batteri internalizzati quantificato nel corso del tempo all&#39;interno di tessuti è illustrato nella figura 2. Entrambi i risultati sono abbastanza riproducibili, rendendo i tessuti EpiAirway un coerente e biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana in cui studiare NTHi ospite-patogeno interazioni. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Microscopia elettronica a scansione dei tessuti EpiAirway. A. tessuto di controllo non infetti. Tessuto B. dopo cinque giorni di co-coltura con NTHi. Nessun danno significativo alla superficie apicale si osserva nei tessuti infetti. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Numero di NTHi interiorizzato nel tempo durante EpiAirway co-coltura. R2866 ceppo è stato inoculato a circa 1,0 x 10 7 CFU / inserimento (giorno 0), poi raccolte per i batteri interiorizzata in ogni punto all&#39;ora indicata. Barre rappresentano n = 3 repliche in almeno doppio. Barre di errore sono SD.

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo permette l&#39;indagine di lungo termine, interazioni ospite-patogeno in un ambiente biologicamente rilevanti di primaria tessuti umani respiratorio all&#39;interfaccia aria-liquido interfaccia. Qui abbiamo usato NTHi come l&#39;organismo infettante, ma l&#39;interazione di qualsiasi batterio che non introduce citotossicità inaccettabile nel corso del tempo può essere quantificata con questo metodo. Il modello EpiAirway può essere utilizzato anche per lo studio dei virus, le droghe, o sostanze chimiche ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Catalogo # </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Saponina </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25GM </td><td> 1% in D-PBS senza calcio e magnesio, filtro sterilizzare </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco PBS con calcio e magnesio </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco PBS senza calcio e magnesio </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiotico senza tessuti </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiotico senza manutenzione mezzi di comunicazione </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Fornito con il kit </td></tr><tr><td> Tampone fosfato 10X soluzione salina </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Diluire a 1X prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Aggiungere a una concentrazione finale del 0,1% nel 1 X PBS e autoclave </td></tr><tr><td> Difco GC Base Media (agar cioccolato) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclave 36 g in 500 ml di DDH 2 O e raffreddare a 60 ° C </td></tr><tr><td> BBL emoglobina (agar cioccolato) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclave 10 g in 500 ml di DDH 2 O, raffreddare a 60 ° C e miscelare con la base medio GC sopra </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX arricchimento (agar cioccolato) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Raffreddare la miscela di base medio GC e emoglobina a 55 ° C e aggiungere 10 ml di IsoVitaleX reidratato, versare piastre di agar cioccolato </td></tr><tr><td> Dissettore, punta fine, curva </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Autosigillante sterilizzazione buste </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina solfato, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Aggiungere 10 microlitri / ml a MM EpiAirway per uccidere gentamicina </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sono umani adattati batteri Gram-negativi che possono causare infezioni ricorrenti e croniche della mucosa respiratoria 1, 2. Per studiare i meccanismi con cui questi organismi sopravvivono e nei tessuti delle vie respiratorie, un modello in cui il successo a lungo termine co-coltura di batteri e cellule umane possono essere eseguite è necessario. Noi uso primario tessuti umani epiteliali delle vie respiratorie sollevato in aria-liquido, il modello EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Questi non sono immortalati, ben differenziato, 3-dimensionale dei tessuti che contengono le giunzioni strette, le cellule ciliate e nonciliated, cellule caliciformi che producono mucina, e conservare la capacità di produrre citochine in risposta alle infezioni. Questo biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana può essere utilizzato in diversi modi; l&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di eseguire a lungo termine co-coltura di tessuti EpiAirway con NTHi e quantificare associato alle cellule dei batteri e interiorizzato nel tempo . Inoltre, la produzione mucina e il profilo delle citochine degli infetti co-culture può essere determinato. Questo approccio migliora metodi esistenti in molti protocolli attuali che utilizzano sommersi colture monostrato o Transwell di cellule umane, che non sono in grado di supportare le infezioni batteriche per lunghi periodi 3. Per esempio, se un organismo in grado di replicare sui media sovrastante, questo può portare a livelli inaccettabili di citotossicità e la perdita di cellule ospiti, arrestando l&#39;esperimento. Il modello EpiAirway permette la caratterizzazione di lungo termine, interazioni ospite-patogeno. Inoltre, dato che l&#39;origine per il EpiAirway è normale umano tracheo-bronchiali cellule piuttosto che una linea immortalato, ognuno è un&#39;eccellente rappresentazione del reale tessuto umano del tratto respiratorio superiore, sia nella struttura e nella funzione 4. Per questo metodo, i tessuti EpiAirway sono svezzati fuori di composti anti-microbico e anti-fungini per 2 giorni prima della consegna, e tutte le procedure vengono eseguite sotto antibiotico senza condizioni. Ciò richiede considerazioni particolari, in quanto sia i batteri e primario dei tessuti umani sono usati nello stesso armadio biosicurezza, e sono co-coltura per lunghi periodi.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all&#39;interfaccia aria-liquido, un biologicamente rilevanti<em&gt; In vitro</em&gt; Modello. L&#39;approccio può essere utilizzato con qualsiasi microbo che è suscettibile di lungo termine co-coltura.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Views.  Mercer University School of Medicine. Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all'interfaccia aria-liquido, un biologicamente rilevanti In vitro Modello. L'approccio può essere utilizzato con qualsiasi microbo che è suscettibile di lungo termine co-coltura.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...