Gli autori desiderano ringraziare Michelle Deochand per perfezionare questa tecnica di ablazione dell&#39;occhio, Taylor Birkholz per l&#39;assistenza con il saggio funzionale, Michael Levin per l&#39;anticorpo anti-arrestina, e Junji Morokuma per informazioni sulle piastre Peltier. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione SFSA da Western Michigan University per WSB.

1. Cultura e trattamento degli animali NOTA: Questo protocollo utilizza mediterranea Schmidtea, una specie planaria diploide con un genoma sequenziato 16, 17 che viene comunemente utilizzato per la ricerca di rigenerazione. Tuttavia, l&#39;analisi è altrettanto successo con altre specie, quali Girardia tigrina e Girardia dorotocephala (che sono disponibili in commercio). <ol><li> Mantenere vermi &quot;acqua verme&quot; fatta da 0,5 g sali / L di mare in ultrapura (o filtrata deionizzata) acqua. Utilizzare sterili contenitori in polipropilene o vetro per tenere l&#39;acqua verme. Vedere <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">file supplementare 1</a> per i dettagli sulla produzione di acqua verme. NOTA: Non usare mai sapone per pulire i contenitori (o di altri fornitori) come il sapone è tossico per i vermi; invece strofinata con 70% etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. &lt;ol&gt; <li> Indossare guanti durante il lavoro con planaria per proteggerli dalla contaminazione. NOTA: I vermi sono molto sensibili alle tossine e sostanze chimiche ambientali, tra cui il sapone, candeggina, shampoo, balsamo e crema per le mani. </li></ol></li><li> colonie case in contenitori per alimenti polipropilene, con il coperchio parzialmente aperto lasciati per lo scambio aria a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Negozio vermi sperimentali in entrambe le capsule di Petri (20 vermi per piastra 100 mm) o lastre non trattate tessuto-coltura (1 verme per pozzetto, per piastre da 12 pozzetti). Per ridurre lo stress, tenere entrambe le colonie e gli esperimenti nel buio. NOTA: Le colonie devono avere non più di 500-1000 vermi per litro d&#39;acqua a vite senza fine. Per gli esperimenti, lasciare coperchi pienamente in atto, dal momento che il flusso d&#39;aria è stato progettato in questi piatti. </li><li> Nutrire i vermi non sperimentali volta alla settimana con purea carne biologica o fegato di pollo facendo cadere purea da una pipetta di trasferimento, mettendo gocce di cibo in tutto il contenitore. Lasciare Worms 2 h di consumare cibo inbuio prima di pulire il contenitore (vedi passo 1.4). Prima dell&#39;uso, purea di conservare a -20 ° C per brevi periodi (settimane) o -80 ° C per il lungo termine (mesi); non ricongelare purea per il riutilizzo (come batteri possono fiorire e danneggiare i vermi). NOTA: fegato non deve contenere ormoni o antibiotici e preferibilmente non essere congelati in precedenza. Centrifugare purea prima del congelamento (o prima dell&#39;alimentazione) per rimuovere l&#39;aria e impediscono cibo da galleggiante. Il cibo dovrebbe depositarsi sul fondo del contenitore. 1 ml di purea è sufficiente per 500-1.000 vermi. </li><li> acqua di cambio una volta alla settimana con acqua fresca senza fine per entrambe le colonie e gli esperimenti. contenitori colonia dovrebbero essere puliti con un tovagliolo di carta greggi (per rimuovere i residui di muco che i rifiuti trappola) una volta alla settimana per fame vermi, o due volte alla settimana per vermi alimentazione (2 h dopo l&#39;alimentazione e ancora 2 giorni più tardi). Al fine di mantenere il biofilm, non pulire più dell&#39;80% del contenitore. </li><li> Spostare vermi tra i contenitori (o setu chirurgiap) utilizzando una pipetta di trasferimento. Per vermi liberi aderito superfici del contenitore, spruzzare acqua sopra / dietro il verme per sganciarlo dalla superficie. Poi aspirare il verme nella pipetta, cercando di mantenere il worm all&#39;interno della porzione di fondo pollici (più sottile) della pipetta. <ol><li> pipette rinviare la con una piccola quantità di acqua verme prima di succhiare. </li><li> Provare a spostare l&#39;acqua intorno alla vite senza fine, piuttosto che il worm stesso, per aiutare a prevenire strappi vermi dal corpo molle toccandoli con la pipetta. </li><li> Mantenere piatti sperimentali coperte salvo trasferimento vermi o sostituzione dell&#39;acqua. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione <ol><li> Smettere di alimentare i vermi almeno una settimana prima di esperimenti. <ol><li> Selezionare worm che non sono stati ricevuto per almeno ≥1 settimana e sono almeno 5-7 mm di lunghezza. Trasferire i vermi ad una piastra di Petri 2/3 con acqua verme, e confermare la lunghezza verme facendo scorrere un righello sotto il piatto. Misura wORM mentre completamente estese e in movimento. NOTA: Anche se più piccolo (5-7 mm) vermi funzionano meglio durante l&#39;esecuzione successiva immunofluorescenza e analisi situ, vermi più grandi (8-10 mm) sono più facili da lavorare - soprattutto quando si impara per l&#39;ablazione. </li><li> Assicurarsi che i vermi sono tutto, non danneggiato, e non recentemente rigenerante. NOTA: Rigenerazione vermi avranno molto più leggero (o no) pigmento nella testa e / o della regione di coda rispetto ai vermi normali. </li><li> Se l&#39;esecuzione di RNAi o trattamenti farmacologici di vermi, farlo a questo punto. Se i vermi sono stati alimentati come parte del trattamento (come per RNAi), attendere almeno 7 giorni dopo l&#39;ultima alimentazione prima di passare al punto 2.2. </li></ol></li><li> Pulire il microscopio base spaziale lavoro e dissezione con il 70% di etanolo e lasciare asciugare completamente. Posizionare il piatto di vermi selezionati a sinistra del campo di applicazione. A destra del campo di applicazione, inserire un paio di # 5 forcipe, un 31 G 5/16-inch ago da insulina con un 1mL siringa, e un trasferimento pipetta pulita. <ol><li> Assicurarsi che gli strumenti sono mantenuti tocchi il banco (che potrebbe introdurre contaminanti). Utilizzare un elemento rigido (ad esempio un resto della bacchette) per mantenere la pinza, l&#39;ago, e pipetta pulita. In alternativa, posizionare gli strumenti sulla parte superiore di un marrone (greggio) tovagliolo di carta fresca. NOTA: Queste e le successive istruzioni sono scritte in cui riguardano gli individui destri. individui mancini dovrebbero invertire la destra / sinistra le direzioni. </li></ol></li><li> Accanto alla spazio di lavoro, mettere una casella di salviette panno liscio, una fonte di acqua fresca a vite senza fine, e alcune pipette di trasferimento extra (protetti dal banco). Posto acqua verme in una bottiglia di lavaggio in plastica per facilità di erogazione. Anche inserire un piatto marcato 12 pozzetti (o 100 a Petri) a destra del campo di applicazione raccoglie gli animali ablazione. </li><li> Se si utilizza una piastra Peltier su misura per immobilizzare i vermi, posizionare la piastra Peltier nella depressione in tha basamento del microscopio da dissezione e regolare l&#39;uscita del generatore di tensione CC finché la superficie di lavoro della piastra Peltier è sufficientemente fredda (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fare una piastra fredda riempiendo una capsula Petri mm 100 metà con acqua e congelare per almeno 24 h. Scartare il coperchio e posizionare il fondo del piatto 100 mm base della portata dissezione, quindi posizionare il coperchio di un piatto 60 mm Petri capovolta direttamente sulla superficie del ghiaccio (Figura 1A). <ol><li> Dopo che l&#39;acqua è congelato nel piatto 100 mm, un &quot;vulcano&quot; di ghiaccio può apparire nel centro della piastra. Se questo accade, usare una lama di rasoio per raschiare il piatto ghiaccio, per eliminare irregolarità dalla superficie. NOTA: durante interventi chirurgici il ghiaccio si scioglierà, rendendo ablazioni molto più difficile. Preparare diversi piatti di ghiaccio in anticipo, e sostituire quelli congelati per la fusione quelli durante il dosaggio non appena il coperchio del piatto 60 millimetri inizia flottante. </li></ol></li><li> preparare lasuperficie chirurgia. Tagliare un pezzo 5 cm x 10 cm di parafilm plastica (4 cm 2 se si utilizza la scatola di Petri piastra fredda) e posizionarlo sul centro del dispositivo di immobilizzazione. Piegare un panno liscio pulire in un quadrato circa 2 cm 2 e posizionarlo sopra del film. Tagliare un pezzo di filtro di carta bianca 1,5-2 cm 2 e posizionarlo sulla parte superiore del wipe. Vedere Figura 1B-1E. <ol><li> Tenere il piegata pulire in posizione con un dito guantato, e utilizzare l&#39;acqua senza fine per inumidire leggermente la salvietta per garantire che rimanga piegato. Usare il lato di una pipetta di trasferimento a rotolare la salvietta piatta. NOTA: la temperatura fredda aiuta a mantenere i vermi di muoversi. Lavorare &quot;a secco&quot; aiuta anche nella immobilizzazione. Il tessuto wipe agisce per favorire l&#39;acqua attraverso la carta da filtro, mantenendo il verme umido durante l&#39;intervento chirurgico senza consentire vermi asciugare completamente (che è letale). </li></ol></li></ol> 3. ablazione chirurgica <ol><li> Utilizzare una pipetta di trasferimento di immettere sullato e verme dorsale fino sulla carta da filtro. Accendere la sorgente luminosa e dirigere le goosenecks in modo che la luce si concentra sul verme. Regolare la messa a fuoco dissezione portata e ingrandimento in modo che gli occhi sono chiaramente visibili (l&#39;intero verme non ha bisogno di essere in vista); Ingrandimento 5X è un buon punto di partenza. Orientare il verme ruotando il parafilm modo che la testa sia puntato verso il ricercatore (verso la parte anteriore del microscopio), angolati 30-40 gradi verso destra. <ol><li> Evitare l&#39;uso di luce intensa per impedire il movimento verme in eccesso. Planarians mostrano fototassi negative e tenterà di eludere luce. </li><li> Se la vite è posizionato lato ventrale rivolto verso l&#39;alto (con apertura visibile faringeo), usare il lato opaco della pinza per riposizionare delicatamente il lato dorsale verme alto (con gli occhi visibili). Evitare di avvicinarsi l&#39;animale con la punta affilata della pinza per ridurre al minimo la possibilità di strappare attraverso i tessuti molli quando riposizionamento l&#39;animale. </li><li&gt; Regolare il fuoco microscopio in modo che gli occhi sono chiaramente a fuoco. Assicurarsi inoltre che entrambi gli occhi e tessuti testa circostanti sono in vista. </li></ol></li><li> Tenere un fresco ago / siringa nella mano destra come se fosse una penna (tra il pollice e l&#39;indice). Brace il pollice sinistra contro la piastra Peltier (o scatole Petri piastra fredda), e utilizzare il pollice sinistro come fulcro su cui poggerà la porzione di fondo della siringa (Figura 2A). Guardare attraverso il microscopio, e assicurarsi che la smussatura dell&#39;ago è visibile. NOTA: Gli aghi sono molto taglienti. Siate cauti quando loro manipolazione. Indossare guanti di lattice o di nitrile in grado di offrire una certa protezione. <ol><li> Utilizzare il pollice sinistro per contribuire a tenere l&#39;ago / siringa costante durante tutta la procedura ed evitare di stringere la mano. </li><li> Formare un angolo di circa 40 ° con il pollice sinistro e l&#39;indice di sinistra (con il dito indice sulla superficie chirurgia) per contribuire a tenere la superficie stabile chirurgia. </li></ol></li><li> Conla smussatura dell&#39;ago rivolta verso l&#39;alto (come un cucchiaio), posizionare l&#39;ago perpendicolarmente alla dell&#39;occhio (Figura 2B). Utilizzare la punta dell&#39;ago per penetrare delicatamente lo strato sottile di tessuto sovrastante la tazza ottico (bianco, regione non pigmentato) dell&#39;occhio, raccogliendo da destra a sinistra. Molto rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto pigmentato situato all&#39;interno della coppa ottica, facendo attenzione a non forare il fondo o distruggere i confini della coppa ottica. <ol><li> Se il verme è stato sulla carta da filtro per&gt; 1-2 min in qualsiasi momento durante la procedura, aggiungere una goccia di acqua verme per reidratare il verme. NOTA: La disidratazione aumenta la suscettibilità del verme a lesioni ripping. </li></ol></li><li> Ripetere passaggio 3.3 finché tutti i tessuti pigmentati neri (cellule pigmento), così come tutti i tessuti bianchi della coppa ottica (dendriti dei fotorecettori), vengono rimossi. Rimuovere tessuti asportati bloccato fino alla fine dell&#39;ago con attenzione strofinando con un tessuto wipe. Se doppio Abla occhiozione è desiderato, ablazione del secondo occhio a questo punto. NOTA: Per evitare lesioni, aghi può essere pulito afferrando l&#39;ago con un panno pulito wipe tenuto con il pollice e l&#39;indice, poi con l&#39;altra mano per tirare l&#39;ago attraverso la spazzare via dal pollice e l&#39;indice. In alternativa, l&#39;ago può essere pulito sulla superficie di un tessuto wipe ed esaminato per la pulizia. </li><li> Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il verme ad un piatto etichetta contenente acqua verme fresca. Se l&#39;analisi dei dati gruppo mettere fino a 20 vermi in un singolo 100 millimetri piastra Petri. Se il monitoraggio rigenerazione negli stessi individui nel corso del tempo, mettere 1 verme in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti. Una volta che tutti i vermi sono trasferiti, risciacquare vermi rimuovendo tutta l&#39;acqua verme dalle stoviglie / pozzetti e sostituendo con più acqua verme fresca. <ol><li> Per rimuovere i vermi dal filtro, ritardare l&#39;pipetta con una piccola quantità di acqua vite senza fine e rilasciare l&#39;acqua sulla vite senza fine. Questo dovrebbe alzare tegli verme fuori la carta da filtro, da subito risucchiato nella pipetta per il trasferimento. </li></ol></li><li> Incubare esperimenti a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) al riparo dalla luce e seguire il processo rigenerativo. NOTA: Worms possono essere memorizzati in un incubatore a temperatura controllata per mantenere una temperatura costante, ma ciò non è strettamente necessario. La maggior parte delle temperatura ambiente variano solo da + 5 ° C, che non alteri la capacità del verme di rigenerare. </li><li> Se lo si desidera, fissare vermi per immunoistochimica (vedi figure 3-4) e / o ibridizzazione in situ analisi dell&#39;espressione genica. Esistono diversi metodi di fissazione per immunoistochimica planarian 18, 19, 20 e ibridazione in situ 21, 22, 23 protocolli. </li><li> Quando gli esperimenti sono concluse, sacrifice vivere vermi mediante eliminazione di acqua verme dal piatto e sostituzione con etanolo al 70%. Incubare vermi per 3-5 minuti, controllando per i vermi per lisare e girare grigiastra. </li><li> Posizionare i vermi non trattati nel flusso dei rifiuti normali una volta sacrificato. Evitare di introdurre vermi vivi nell&#39;ambiente, in particolare le specie non indigene. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica di ablazione dell&#39;occhio migliora la metodologia correnti (come fori) escludendo tessuti cerebrali e limitando escissione principalmente ai tessuti oculari. Con la pratica, questa tecnica può essere eseguita dalla maggior parte degli individui, da tecnici esperti in microchirurgia per studenti universitari inesperti ma di coscienza. Si raccomanda che questa tecnica essere praticato molte volte prima di utilizzare ablazioni in esperimenti, inclusi (quando possibile) conferma della rimozione completa d...

Planarie sono un potente organismo modello per studiare la rigenerazione cellulare mediata staminali adulte. Questi platelminti acqua dolce non parassitarie possiedono la capacità di rigenerare qualsiasi e tutti i tessuti mancanti, tra loro sistema nervoso centrale e del cervello 1. Studiata fin 1700 2, progressi tecnologici nel campo planarian corso degli ultimi 10-15 anni (quali un genoma sequenziato, ibridazione in situ, immunoistochimica, interferenza RNA (RNAi), e trascrittomica) hanno aggiornato questo organismo modello storico . In particolare, planarie hanno recentemente guadagnato la popolarità come un modello emergente per la ricerca degli occhi 3. Planarians hanno occhi prototipici con solo due tipi di tessuto, i neuroni fotorecettori e cellule pigmentate; ciò ha permesso la caratterizzazione della sua popolazione dell&#39;occhio cellule staminali e dimostrato che molti degli stessi geni che regolano vertebrato occhio deluppo sono conservati in planarians 4, 5. Le coppe ottiche si trovano dorsalmente e comprende il bianco, dendriti dei neuroni non pigmentate fotorecettori e le cellule del pigmento nero semi-lunari, e gli occhi innervano il cervello attraverso un chiasma ottico. Oltre ad essere un modello per chiarire processi rigenerativi 6, l&#39;occhio planarian è adatto per studiare l&#39;evoluzione dei meccanismi visivi 7, risposte comportamentali alla luce (planarians visualizzare fototassi negativo) 8, e la base neurologiche del comportamento 9. Rigenerazione oculare planarians è stato ampiamente studiato in due contesti principali: come parte della rigenerazione testa dopo decapitazione 4, 10, e dopo l&#39;asportazione di soli tessuti oculari 11, 12 </sup&gt;. La maggior parte degli studi sulla rigenerazione planaria occhi hanno usato il metodo di decapitazione, in quanto è semplice e lineare. Il metodo escissione occhio planarian più comune è stato finora tramite perforazione con un tubo capillare vetro sottile 13, 14, anche se alcuni studi hanno anche eseguito amputazioni appena dietro gli occhi (decapitazione parziale) 15. Tuttavia, tutti questi metodi comportano la perdita di molti tessuti diversi solo l&#39;occhio (come il cervello, intestino, e nefridi), potenzialmente complicando l&#39;interpretazione dei risultati. Il protocollo ablazione occhio qui presentata limita escissione ai tessuti dell&#39;occhio (escludendo in particolare del cervello), con conseguente dati che sono più specifici per l&#39;occhio. Inoltre, a differenza di vermi decapitati che prendono 7-14 giorni per iniziare l&#39;alimentazione, occhio ablato vermi alimentare entro 24 h di ablazione 12, consentendo esperimenti RNAi (dove RNAi viene fornita mediante il cibo) da esibiràd contemporaneamente. Anche se l&#39;ablazione occhio è tecnicamente più difficile da eseguire con successo di decapitazione, gli studi in corso sulla escissione occhio non hanno incluso le istruzioni dettagliate sulle loro procedure. L&#39;obiettivo di questo articolo il video è quello di consentire ai ricercatori di rimuovere costantemente la coppa ottica planaria senza disturbare i tessuti cerebrali sottostanti e la rimozione come pochi altri tessuti come possibile. Questo metodo può essere utilizzato sia per singolo e doppio ablazione dell&#39;occhio ed è applicabile ad una vasta gamma di indagini. Come la maggior parte dosaggi di rigenerazione, l&#39;ablazione occhio è adatto per la combinazione con entrambi (RNAi) schermi farmacologiche e genetiche, così come studi comportamentali. Qui si descrivono i metodi per la gestione di vermi, il mantenimento di una colonia planaria, e la tecnica di ablazione occhio stesso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean sea salts</td>
			<td>Spectrum Brands&#160;</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>&#34;10 Gallon&#34; box&#160; (net weight 3 lbs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>4.5 x 8.5 in&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #2 filter paper</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1002125</td>
			<td>Circles, 125 mm diameter, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td>
			<td>Pet Health Market</td>
			<td>17175-04</td>
			<td>&#160;U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>60 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5&#160; forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Inox, straight tip , 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Samco Scientific&#160;</td>
			<td>225</td>
			<td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M paraffin film</td>
			<td>Brand&#160;</td>
			<td>701606</td>
			<td>&#160;4 in x 125 ft roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated tissue culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15705-059</td>
			<td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic food containers (for colony)&#160;</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>Large rectangle</td>
			<td>2.25 qt (2.12 L), 10&#34; x 6 -3/4 &#34; x 3 -3/16&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planaria (Girardia tigrina)</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>132954</td>
			<td>Sold as &#34;Brown&#34; Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown paper towels&#160;</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>9-3/16 x 9-3/8&#34; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (for worm water), optional</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-275</td>
			<td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-synapsin antibody, optional</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3C11</td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-arrestin antibody, optional</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td>
			<td>Nalge Nunc International Corporation</td>
			<td>2324-0015</td>
			<td>15 L,&#160; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Peltier plate, optional</td>
			<td>Williams Machine, Foxboro, MA&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&#160; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&#160; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&#160; &#34;anchored&#34; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &#34;foot&#34; that fits into the opening of your microscope&#39;s base plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power source (for Peltier plate), optional</td>
			<td>B &#38; K Precision</td>
			<td>1665</td>
			<td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other common supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick rests, optional</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

Nello studio di cellule staminali adulte e meccanismi rigenerativi, platelminti planarian sono una graffetta nel sistema modello in vivo. Ciò è dovuto in gran parte alla loro abbondante popolazione di cellule staminali pluripotenti e la capacità di rigenerare tutti i tipi di cellule e tessuti dopo lesioni che sarebbe catastrofico per la maggior parte degli animali. Recentemente, planarie hanno guadagnato popolarità come modello per la rigenerazione degli occhi. La loro capacità di rigenerare l&#39;intero occhio (composto da due tipi di tessuto: cellule pigmento e fotorecettori) consente la dissezione dei meccanismi che regolano la rigenerazione del sistema visivo. ablazione occhio ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche (come decapitazione o fori) per l&#39;esame percorsi e meccanismi specifici occhio, il più importante dei quali è che la rigenerazione è in gran parte limitato ai soli tessuti dell&#39;occhio. Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planarian senza disturbare il cervello o tessuti circostanti.Movimentazione di vermi e manutenzione di una colonia stabilita viene anche descritto. Questa tecnica utilizza un 31 G, ago da insulina da 5/16 pollici per raccogliere chirurgicamente la coppa ottica di planarians immobilizzati su un piatto freddo. Questo metodo comprende sia singola e doppia ablazione dell&#39;occhio, con gli occhi rigeneranti entro 1-2 settimane, consentendo una vasta gamma di applicazioni. In particolare, questa tecnica di ablazione può essere facilmente combinato con (RNA interference) schermi farmacologici e genetici per una migliore comprensione dei meccanismi rigenerativi e loro evoluzione, cellule staminali occhio e la loro manutenzione e risposte comportamentali phototaxic e la loro base neurologica.

Per la prima post chirurgia 1-2 h, animali possono esibire movimento è diminuito rispetto ai vermi intatti (tuttavia essi sposteranno comunque). Se lo si desidera, vermi mangiare entro 24 ore di chirurgia (per esempio, per l&#39;alimentazione RNAi). Quando si segue la rigenerazione degli occhi negli stessi individui nel corso del tempo, assicuratevi di prendere una fotografia di ciascuna vite senza fine sia prima dell&#39;intervento chirurgico (intatto) e al 1 ore dopo l&#39;ablazione (...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L&#39;utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l&#39;evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Views.  Western Michigan University.  Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L'utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l'evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce. 

Video: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

Epatectomia parziale lobulare: Un modello chirurgico per rigenerazione epatica morfologica

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic dysfunction occur in various neurodegenerative diseases and age-related degeneration. Investigation of the mechanisms that regulate neurite outgrowth would not only shed valuable light on brain developmental processes but also on such neurological disorders. Due to the low transfection efficiency, it is currently challenging to study the effect of a specific protein on neurite outgrowth in primary mammalian neurons. Here, we describe a simple method for the investigation of neurite outgrowth by the co-transfection of primary rat cortical neurons with EGFP and a protein of interest (POI). This method allows the identification of POI transfected neurons through the EGFP signal, and thus the effect of the POI on neurite outgrowth can be determined precisely. This EGFP-based assay provides a convenient approach for the investigation of pathways regulating neurite outgrowth.

In this report, we describe a simple protocol for studying neurite outgrowth in embryonic rat cortical neurons by co-transfecting with EGFP and the protein of interest.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, and stress response. More than a decade ago, stem cells were identified in the pituitary gland. However, despite the application of transgenic in vivo approaches, their phenotype, biology, and role remain unclear. To tackle this enigma, a new and innovative organoid in vitro model is developed to deeply unravel pituitary stem cell biology. Organoids represent 3D cell structures that, under defined culture conditions, self-develop from a tissue's (epithelial) stem cells and recapitulate multiple hallmarks of those stem cells and their tissue. It is shown here that mouse pituitary-derived organoids develop from the gland's stem cells and faithfully recapitulate their in vivo phenotypic and functional characteristics. Among others, they reproduce the activation state of the stem cells as in vivo occurring in response to transgenically inflicted local damage. The organoids are long-term expandable while robustly retaining their stemness phenotype. The new research model is highly valuable to decipher the stem cells' phenotype and behavior during key conditions of pituitary remodeling, ranging from neonatal maturation to aging-associated fading, and from healthy to diseased glands. Here, a detailed protocol is presented to establish mouse pituitary-derived organoids, which provide a powerful tool to dive into the yet enigmatic world of pituitary stem cells.

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary gland is the key regulator of the body's endocrine system. This article describes the development of organoids from the mouse pituitary as a novel 3D in vitro model to study the gland's stem cell population of which the biology and function remain poorly understood.

Sviluppo di organoidi dall'ipofisi di topo come modello in vitro per esplorare la biologia delle cellule staminali ipofisarie

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...