La bassa efficienza di trasfezione è un grosso ostacolo per determinare come le proteine riattivono la crescita della neurite nei neuroni primari. Il nostro protocollo supera questo problema co-trasfezione di EGFP per identificare con successo le cellule trasfette. L'alto tasso di co-trasfezione di EGFP e le proteine di interesse garantiscono l'accuratezza del saggio.
E di conseguenza, ora è necessaria la colorazione dell'immunofluorescenza. Poiché la crescita della neurite si verifica durante la rigenerazione neurale, questo metodo può essere applicato all'identificazione di nuovi obiettivi per ripristinare la rete neuronale danneggiata in traumi cerebrali o malattie neurodegenerative. Prima di iniziare la procedura, posizionare una coverlip circolare sterile di 18 millimetri in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 12 polietilene e rivestire ogni coverlip con cinque microgrammi per millimetro di soluzione di Poli-D-Lysine in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius per almeno un'ora.
Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di poli-D-lisina e sciacquare i copriparsi con acqua sterile. Il giorno 18 embrionale, posizionare l'utero raccolto da un ratto Sprague Dawley incinta a tempo in una piastra di Petri di 10 centimetri e utilizzare piccole forbici sezionanti per aprire l'utero e il sacco amniotico. Utilizzare le forbici per rimuovere la placenta e utilizzare le forcep per trasferire un intero embrione in una nuova piastra di Petri di 10 centimetri contenente glucosio PBS refrigerato.
Usa le forbici per tagliare lungo la sutura sagittale del cranio e usa una piccola spatola piatta per trasferire il cervello embrionale in una nuova piastra di Petri di 10 centimetri contenente glucosio PBS fresco ghiacciato. Usando due pinzette numero cinque e un microscopio a dissezione, separare i due emisferi cerebrali dal cervelletto e dal tronco encefalico e rimuovere le meningi. Quindi isolare la corteccia dagli emisferi cerebrali e posizionare la corteccia in un tubo da 15 millilitri contenente glucosio PBS freddo come ghiaccio fresco.
Per la coltura primaria dei neuroni corticali, in un armadio di biosicurezza di classe II, lasciare che la corteccia si stabilisca per gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius prima di sostituire il glucosio PBS con l'EDTA allo 0,05% di tripside. Mescolare con maschiatura delicata e incubare il tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 10 minuti con ulteriori maschiature delicate ogni due minuti. Alla fine dell'incubazione, interrompere la digestione con quattro millilitri di mezzo di manutenzione e utilizzare una pipetta da un millilitro per dissociare il tessuto con una delicata triturazione.
Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in un millilitro di mezzo di manutenzione per una seconda centrifugazione. Rimostrare il pellet formato dopo la seconda centrifugazione in un millilitro di mezzo di manutenzione fresco per il conteggio e placcare i neuroni isolati a una piastra di 6,5 per 10 alla quarta forzatura vitale per centimetro di concentrazione quadrata in un millilitro di mezzo di manutenzione per pozzo in una piastra di 12 pozzetti. Dopo due giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, diluire L'EGFP e le DNA plasmidiche proteiche bersaglio e reagente di trasfezione in due tubi separati da 1,5 millilitri e quindi mescolarli insieme.
Trasfezionare le celle con il costrutto EGFP aggiungendo la miscela di trasfezione ai pozzi. Dopo 24 ore, lavare le celle con 37 gradi Celsius PBS e fissarle con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le celle fisse tre volte con PBS fresco per lavaggio e aggiungere un volume minimo di mezzo di montaggio a fluorescenza su un vetrino al microscopio per campione.
Quindi trasferire con cura i copripasci rivestiti sul supporto di montaggio con i campioni rivolti verso le diapositive di vetro. Per immaginere la crescita della neurite, selezionare l'obiettivo 40X su un microscopio epifluorescente e fare clic per iniziare a catturare immagini da almeno 40 neuroni positivi EGFP intatti per trasfezione. Quando tutte le neurite sono state immagini, apri le immagini catturate in ImageJ con il plugin NeuronJ e misura la lunghezza della neurite più lunga di ogni neurone dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita.
Quindi analizzare i dati ottenuti con il software per determinare l'effetto delle proteine mirate sulla crescita della neurite. La citocalcasina D sopprime l'estensione della neurite in modo dose-dipendente mentre la crescita della neurite è migliorata nei neuroni trattati con fattore di crescita nervosa. Inoltre, la proteina dell'adattatore per la crescita neuronale FE65 stimola significativamente la crescita della neurite di due volte rispetto ai neuroni non trasfettati.
Nonostante una bassa efficienza di trasfezione, l'analisi dell'immunofluorescenza rivela che oltre l'80% di una coltura cellulare di due giorni può essere co-trasfettata con successo con EGFP e FE65. L'espressione EGFP viene rilevata a sei ore dopo la trasfezione, mentre FE65 viene rilevato per la prima volta all'ora 12 ed entrambi i segnali vengono rilevati per un massimo di sette giorni dopo la trasfezione. La trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con diverse quantità di DNA plasmide FE65 rivela un aumento dose-dipendente dell'estensione della neurite con da 0 a 0,5 microgrammi di FE65 plasmide.
Tuttavia, non si osserva alcuna differenza significativa nella crescita nei neuroni trasfettato con 0,5 o un microgrammi del plasmide. Quando si tenta il protocollo, è importante isolare la regione appropriata dal cervello embrionale. Questa tecnica può anche essere applicata allo studio della crescita neurale nei neuroni derivati dall'iPSC umano che hanno strumenti preziosi per la medicina rigenerativa.
