Il nostro modello organoide è molto prezioso per esplorare la biologia delle cellule staminali pituitarie in condizioni omeostatiche e di rimodellamento ipofisario, come nella maturazione neonatale della ghiandola, nel declino funzionale associato all'invecchiamento e nella crescita tumorale nella ghiandola. Ad oggi, la nostra tecnica organoide ipofisaria è l'unico strumento disponibile per far crescere ed espandere in modo affidabile e robusto le cellule staminali ipofisarie primarie del topo. A dimostrare la procedura saranno Emma Laporte e Charlotte Nys, dottorandi del mio gruppo di ricerca.
Per iniziare, lavare la testa del topo con acqua deionizzata per rimuovere il sangue. Spruzzare il 70% di etanolo sulla testa per generare un ambiente sterile. Quindi, rimuovere la pelle tra le orecchie utilizzando strumenti chirurgici sterili.
Per aprire il cranio, rompere il ponte nasale con forbici sterili. Aprire ulteriormente il cranio partendo dal ponte nasale verso le orecchie su entrambi i lati. Rimuovere il cranio e il cervello con una pinzetta sterile senza toccare la ghiandola pituitaria.
Rimuovere il diaframma sellae con pinzette smussate. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, separare il lobo anteriore dai lobi posteriori e intermedi. Isolare accuratamente il lobo anteriore con una pinzetta smussata e raccoglierlo in un matraccio Erlenmeyer da 10 millilitri contenente tre millilitri di A medio.Aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina al 2,5% preriscaldata.
Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere due millilitri di soluzione di DNAse preriscaldata e ruotare il matraccio Erlenmeyer 10 volte. Lasciare che l'ipofisi affondi sul fondo e rimuovere il surnatante.
Aggiungere due millilitri di soluzione di inibitore della tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il surnatante quando l'ipofisi affonda sul fondo. Aggiungere due millilitri di mezzo B preriscaldato e incubare per cinque minuti.
Aggiungere due millilitri di mezzo C preriscaldato a questo e incubare per 15 minuti. Lasciare che l'ipofisi affondi sul fondo e rimuovere il surnatante. Quindi, risciacquare tre volte con un mezzo preriscaldato C.Aggiungere due millilitri di mezzo preriscaldato C.Aspirare ed espellere la ghiandola pituitaria con una pipetta Pasteur sterile e lucidata a fiamma più volte fino a quando i frammenti non sono più visibili.
Trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri contenente 4,5 millilitri di soluzione di DNAse preriscaldata. Risciacquare il matraccio tre volte con due millilitri di mezzo C preriscaldato e trasferire la sospensione sul tubo. Mescolare la sospensione cellulare raccolta e filtrarla attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un tubo da 30 millilitri.
Risciacquare il tubo e il filtro cellulare tre volte con due millilitri di mezzo C e trasferire la sospensione al tubo. Riempire una pipetta Pasteur di vetro con due millilitri di BSA. Posizionare la punta della pipetta nella parte inferiore del tubo e pipettare delicatamente per formare uno strato di densità visibile.
Centrifugare a 190 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in un millilitro di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Quindi, quantificare le celle con un contatore di celle.
Centrifugare la sospensione cellulare a 190 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Risospesere il pellet cellulare in DMEM/F-12 avanzato per raggiungere una densità cellulare di 1,1 volte 10 alla 6a cella per millilitro. Aggiungere ECM al volume desiderato di sospensione cellulare con un rapporto di 30:70 e mescolare bene.
Depositare una goccia di 30 microlitri di questa miscela in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata da 48 pozzetti. Capovolgere la piastra e lasciare che l'ECM si solidifichi a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere con attenzione 250 microlitri di mezzo organoide ipofisario preriscaldato integrato con inibitore ROCK 10-micromolare.
Ogni due o tre giorni, cambiare il mezzo senza inibitore ROCK per 10-14 giorni fino a quando gli organoidi sono completamente cresciuti. Per passare gli organoidi, aspirare prima delicatamente il mezzo e aggiungere 400 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato per disintegrare l'ECM. Quindi, raccogliere gli organoidi in un tubo di microcentrifuga.
Lavare il pozzetto con 400 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Centrifugare il tubo a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e aggiungere 400 microlitri dell'enzima TrypLE Express preriscaldato.
Mescolare invertendo il tubo più volte e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungi 400 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Centrifugare a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Risospesciare il pellet con 100 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Restringere una punta P-200 e utilizzare la punta per dissociare gli organoidi mediante pipettaggio vigoroso fino ad ottenere frammenti organoidi. Aggiungi 800 microlitri di DMEM/F-12 avanzato.
Centrifugare a 190 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Per passare gli organoidi, risospesciare il pellet in un volume adeguato di DMEM/F-12 avanzato e aggiungere ECM con un rapporto di 30:70. Mescolare bene.
Continuare a seminare e coltivare gli organoidi come descritto nel manoscritto di testo. Le singole cellule dissociate dal lobo anteriore sono state seminate in ECM e coltivate in mezzo organoide ipofisario. 14 giorni dopo la semina, gli organoidi sono stati completamente sviluppati e hanno raggiunto un diametro fino a 500 micrometri.
In questa fase, gli organoidi mostravano morfologia cistica con uno strato epiteliale che racchiudeva un lume. Non è consigliabile utilizzare i pozzetti in cui appaiono strutture dense dopo la crescita. Per il passaging, i frammenti organoidi sono stati utilizzati per la semina.
Sette giorni dopo il passaggio, è stata osservata una ricrescita organoide favorevole con strutture cistiche. Gli organoidi densi devono essere scartati, poiché gli organoidi sfavorevoli possono assumere il controllo della coltura. L'analisi di colorazione immunofluorescenza per i marcatori epiteliali E-caderina e citocheratine 8 e 18 ha confermato il carattere epiteliale degli organoidi.
L'espressione dei marcatori delle cellule staminali ipofisarie Sox2 e Trop2 ha dimostrato la staminalità e il marcatore ipofisario specifico LHX3 ha mostrato il fenotipo ipofisario degli organoidi. L'espressione del marcatore Ki67 ha mostrato che le cellule organoidiche sono in uno stato proliferativo. L'analisi RTQ PCR ha mostrato una maggiore espressione di marcatori di staminalità negli organoidi rispetto al lobo anteriore anche dopo passaggi multipli, convalidando l'arricchimento delle cellule staminali.
È importante placcare il numero appropriato di singole cellule nella cupola ECM alla semina iniziale, e quando si passano gli organoidi, bisogna ricordarsi di riseminare frammenti e non singole cellule.
