Quindi il mio laboratorio è interessato a capire come l'occhio e il cervello crescono insieme. Questa tecnica ci permette di studiare come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del cervello. La rimozione chirurgica di un occhio dal pesce zebra larvale vivente, seguita dall'osservazione del tectum ottico, ci consente di confrontare i lobi tettoli innervati e denervati all'interno dello stesso animale e tra gli animali.
La combinazione di questa tecnica con i moderni approcci molecolari può fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base dello sviluppo neurale, della rigenerazione e della degenerazione. Per iniziare, collegare i fili del catodo e dell'anodo all'alimentatore. Attaccare la clip di alligatore all'estremità del filo catodico a una graffetta parzialmente raddrizzata e inserire la graffetta nella soluzione di idrossido di potassio, attaccandola al lato del barattolo.
Attaccare la clip a coccodrillo del filo anodico al collo del supporto dell'ago. Girare l'alimentazione a circa 20 volt e immergere il filo di tungsteno nella soluzione di idrossido di potassio, estraendo il filo dalla soluzione ad angolo per affilare elettroliticamente il filo in una punta fine. Controllare la punta dell'ago sotto il microscopio di dissezione per assicurarsi che sia abbastanza affilata.
La punta dell'ago curva si verifica quando l'ago affilato viene piegato toccandolo delicatamente alla capsula di Petri. Il giorno dell'intervento chirurgico, utilizzare una pipetta di pascolo in vetro a foro largo per trasferire da 10 a 15 larve in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con E3 fresco. Aggiungi da tre a cinque gocce di anestetico alla larva. Per determinare se le larve sono adeguatamente anestetizzate, cerca la mancanza di risposta al tocco.
Aggiungere altre due o tre gocce dell'anestetico se le larve sono ancora reattive al tatto dopo tre minuti e rivalutare. Per immobilizzare la larva per un intervento chirurgico, prendi una larva in una pipetta di pascolo di vetro a canna stretta con solo una piccola quantità di E3. Successivamente, assumere circa 200 microlitri di fuso 1% a basso punto di fusione o agarosio LMP nella pipetta contenente la larva e mescolare per garantire che la larva sia sospesa nell'agarosio LMP. Posizionare il coperchio di una capsula di Petri da 35 millimetri rivolta verso l'alto sotto il microscopio di dissezione, quindi spruzzare la larva e l'agarosio sul coperchio capovolto della capsula di Petri.
Diffondi l'agarosio in modo che la larva sia al centro della goccia. Usando un ago di tungsteno opaco, manovrare rapidamente ma delicatamente la larva in modo che sia laterale con un occhio rivolto verso l'alto. Attendere diversi minuti affinché l'agarosio si fissi.
Seguendo il bordo dell'orbita oculare, utilizzare la punta di un ago di tungsteno affilato elettroliticamente per perforare la pelle intorno all'occhio. Quindi far scorrere il bordo dell'ago sotto l'occhio dal lato temporale-ventrale dell'occhio. Utilizzare una pressione controllata per rilasciare l'occhio dalla presa.
Continuare a premere l'occhio dorsalmente e anteriormente con il lato dell'ago, alla fine tagliando attraverso il nervo ottico e rilasciando l'occhio. In alternativa, è possibile utilizzare pinze chirurgiche molto fini per rimuovere l'occhio pizzicando il nervo ottico e spingendo l'occhio dal mediale al laterale. Dopo aver rimosso con successo gli occhi, coprire l'agarosio con la soluzione MMR, liberare ogni larva dall'agarosio spazzolando delicatamente un ago di tungsteno intorno alla testa e poi intorno al corpo, mentre si stabilizza la palpebra della capsula di Petri con una pinza.
Dopo gli interventi chirurgici, posizionare la larva in soluzione MMR integrata con antibiotici fino al giorno seguente, quindi riportare la larva in E3 e allevarla fino al punto finale dell'esperimento. Dopo che le larve sono state anestetizzate terminalmente, fissarle con il 4% di paraformaldeide. Sospendere le larve fisse in goccioline PBS su una piastra di protezione del sigillo al microscopio di dissezione.
Fissarli lateralmente posizionando due perni di tungsteno attraverso la notocorda con un perno posteriore all'area pigmentata che copre la regione AGM e un altro in linea con la fine dell'estensione del tuorlo. Rimuovere l'occhio con un ago di tungsteno affilato e una pinza fine. A volte è possibile colpire l'ago attraverso la mascella sul lato opposto e rimuovere l'altro occhio.
Utilizzare l'ago di tungsteno per graffiare dal lato temporale a quello ventrale dell'orecchio. Nella stessa azione in movimento, portare l'ago posteriore alla mascella e tirare delicatamente anteriormente fino a quando l'orecchio e la mascella non vengono rimossi. Rimuovere l'altro occhio e orecchio colpendo l'ago attraverso la mascella.
Usa la pinza per estrarre gli organi ventrali e il tuorlo rimanente. Infine, fare un'incisione superficiale nella pelle cranica dorsale vicino alla giunzione tra il cervello posteriore e il midollo spinale. Sollevare la pelle con la pinza e tirarla anteriormente e intorno al telencefalo.
Rimuovere qualsiasi tessuto rimanente con una pinza. Staccare la larva e trasferirla in PBS in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Fissare una diapositiva camerata nel coperchio di una capsula di Petri da 100 millimetri con grasso sottovuoto.
Trasferire la larva immunocolorata e lavorata su una piastra di pozzo o un vetrino di depressione per visualizzarli con un microscopio di dissezione. Montare la larva sulla diapositiva camerata in colonne di agarosio LMP all'1%. Usando un bicchiere oltre la pipetta, metti una larva sul vetrino camerato, depositando il minor PBS possibile.
Coprire la larva con agarosio fuso e caldo 1% LMP usando la stessa pipetta. Pipettare l'Agarosio LMP in una colonna e quindi posizionare la larva nel modo più simmetrico possibile con la superficie dorsale visibile. Dopo la rimozione dell'occhio, è stata osservata una progressiva degenerazione degli assoni retinici nel neuropil ottico del tectum.
Due giorni dopo l'intervento chirurgico, gli assoni etichettati RFP mostravano segni distintivi di rapida degenerazione walleriana, come la sfalsatura e la frammentazione. I puncta positivi alla RFP sono stati notati sia all'interno che all'esterno del neuropil sul lato destro del tectum come indicato dalle frecce. Entro quattro giorni dopo l'intervento chirurgico, gli assoni frammentati e i detriti assonali marcati RFP sono stati notevolmente ridotti nel lobo tectale destro, indicando una clearance relativamente rapida degli assoni morenti e degenerativi.
Il cervello è stato esposto sezionando gli occhi, la mascella, le orecchie e la calotta cranica della pelle e dei tessuti connettivi. Idealmente, il cervello rimane intatto durante questa procedura. Tuttavia, parti del cervello anteriore, in particolare il bulbo olfattivo, sono state probabilmente danneggiate o completamente rimosse quando è stata rimossa la calotta cranica della pelle o della mascella.
Inoltre, a volte la sporgenza laterale del tectum viene tagliata quando si perfora o si pizzica la pelle per estrarla dal cervello. Non esistono due campioni identici. Quindi devi essere in grado di apportare sottili adattamenti attraverso la rimozione degli occhi e la dissezione del cervello, se necessario.
I pazienti e gli strumenti affilati sono essenziali per il successo. Questa tecnica può essere seguita da approcci cellulari e molecolari, come l'imaging di cellule vive in vivo o il sequenziamento dell'RNA per ottenere nuove conoscenze sui meccanismi molecolari e cellulari della crescita e dello sviluppo del tectum ottico.
