Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d'Ungheria (grant 116912 a MÀY), l'ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati il diritto ungherese del benessere animale.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Soluzioni di riserva<ol>
<li>Preparare 1 M trealosio aggiungendo 0,378 g di trealosio diidrato in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare 1 M saccarosio aggiungendo 0,342 g di saccarosio in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare 1 M HEPES aggiungendo 0,238 g di HEPES a 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare della collagenosi 20 mg/mL (290 U/mg) con l'aggiunta di 100 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare la tripsina 15mg/mL (~ 10000 U/mg) con l'aggiunta di 75 mg per 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare 1 mg/mL dnasi I (~ 3000 U/mg) con l'aggiunta di 5 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare 0,4% trypan blu aggiungendo 40 mg di trypan blu a 10 mL di PBS. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 1 mL in provette da 1,5 mL.</li>
		<li>Preparare 200 mg/L MS-222 (tricaina solfonato di metano) con l'aggiunta di 200 mg di MS-222 in 1 L di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente. Inoltre, soluzione tampone il MS-222 con bicarbonato di sodio per un pH neutro di 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni per la vitrificazione<ol>
<li>Preparare la soluzione di equilibrazione (ES): preparare 2 mL di ES mescolando 121,5 µ l di metanolo (MeOH; 1,5 M), 220 µ l di glicole propilenico (PG; 1,5 M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di soluzione madre HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l di L-15 in un 2 tubo da mL.</li>
		<li>Preparare la soluzione di vitrificazione (VS): preparare 2 mL di VS mescolando 439 µ l di PG (3 M), 426 µ l di solfossido dimetilico (Me2così; 3M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di HEPES stock soluzione (25 mM) e 685 µ l di L-15 in un provetta da 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni per il riscaldamento<ol>
<li>Preparare la soluzione di riscaldamento 1 (WS1): preparare 1,5 mL di WS1 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 450 µ l di soluzione madre di saccarosio (3 M) e 900 µ l di L-15.</li>
		<li>Preparare soluzione scaldavivande 2 (WS2): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 150 µ l di soluzione madre di saccarosio (1 M) e 1200 µ l di L-15.</li>
		<li>Preparare la soluzione di riscaldamento 3 (WS3): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL di miscelazione 150 µ l di FBS (10%) e 1350 µ l di L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di digestione: per ogni campione preparare 500 µ l della soluzione digestione mescolando 50 µ l di soluzione madre di collagenasi (2 mg/mL), 50 µ l di soluzione madre di tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l di dnasi I (20 µ g/mL) e 390 µ l di L-15 in un mL 2 tubo.</li>
	<li>Ottenere strumenti di dissezione: forbici, microforbici, pinzette, Pinzette curve e aghi per agopuntura.</li>
</ol>2. testicoli collezione
<ol><li>Eutanasia il pesce mettendolo in un piatto contenente 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Prima di continuare con la dissezione, assicurarsi che le branchie hanno smesso di muoversi e che almeno 10 minuti sono passati da quel momento per garantire la morte da ipossia.</li>
	<li>Asciugate il pesce da pacche su un tovagliolo di carta e posizionarlo sul lato dorsale su una stuoia di dissezione.<ol>
<li>In primo luogo tagliare le pinne pettorali e pelviche per dissezione più facile.</li>
		<li>Orizzontalmente snip la pelle sul ventre del pesce tra le pinne pettorali e tagliare la pelle e il muscolo di fondo lungo il ventre fino alla pinna anale.</li>
		<li>Aprire la cavità del corpo del pesce e il pin la parete del corpo sinistra e destra al tappeto di dissezione con aghi. Nota: I testicoli si trovano sopra gli organi gastrointestinali su entrambi i lati della vescica natatoria (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per evitare la contaminazione, non estrarre gli organi gastrointestinali, ma delicatamente spingerle verso un lato e rimuovere il testicolo dal lato avversario. Testicoli sono collegati alla parete del corpo quindi rimuoverli con attenzione e tagliare il collegamento peritoneo di microforbici.</li>
	<li>Inoltre, al fine di prevenire la contaminazione, in primo luogo sterilizzare i testicoli da metterli in etanolo al 70% per 2 s e quindi posto loro in L-15 su una piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio. Nota: Se è necessario, testicoli puliti dal tessuto adiposo e grandi vasi precisamente sotto lo stereomicroscopio sanguigni</li>
</ol>3. ultra-rapido raffreddamento del tessuto testicolare
<ol><li>Aghi di Mark con etichette appropriate a seconda del campione digitare e preparano l'equilibrazione (ES) e soluzioni di vitrificazione (VS).</li>
	<li>Trasferire i testicoli in una piastra ben più grande o piatto e perno a due testicoli (o più a seconda delle dimensioni dell'ago) su un ago di agopuntura sterili.<ol>
<li>In primo luogo posizione del testicolo in cima curve pinzette. Mettere la punta dell'ago nel mezzo del testicolo e tirare verso l'alto il testicolo con le pinzette.</li>
		<li>Dopo perforazione del testicolo, tirarlo delicatamente verso l'alto verso la parte superiore dell'ago. Assicurarsi che i testicoli sono separati gli uni dagli altri e che non vengano a cadere o scivolare giù.</li>
		<li>Luogo pieno di aghi con i testicoli appuntati in una provetta da 2 mL con L-15 fino a vetrificazione (a 25 ˚ c; tempo di conservazione non deve superare 1 h). Nota: Pinning i testicoli dell'ago dovrebbe essere fatto velocemente per evitare i testicoli dall'asciugarsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire l'ago con i testicoli in soluzione di equilibrazione e incubare per 5 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Trasferire l'ago nella soluzione di vitrificazione e incubare per 30 s a 25 ˚ c.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dalla soluzione di vitrificazione, rapidamente e delicatamente assorbire la soluzione rimanente dal tessuto di un tovagliolo di carta sterile. Usare cautela per evitare i testicoli che attacca per il tovagliolo di carta o cadere.</li>
	<li>Inserire rapidamente l'ago nell'azoto liquido, posizionato in una scatola di polistirolo. Nota: Fare questo passo rapidamente per evitare l'esposizione del tessuto per il vapore di azoto liquido. Utilizzare volumi bassi di azoto liquido per evitare la contaminazione incrociata dei campioni.</li>
	<li>Tenere l'ago in azoto liquido in una scatola di polistirolo chiusa per 5-10 min.</li>
	<li>Preraffreddare un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA aperto 4,5 mL e il tappo nella stessa casella.</li>
	<li>Dopo 5-10 min, trasferire ogni ago in un separato stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sotto la superficie dell'azoto liquido e chiudere lo stoccaggio provette criogenia. Attenzione: Utilizzare sempre abbigliamento protettivo (quali guanti isolanti) quando lavorare con azoto liquido come esposizione può portare a gravi congelamenti.</li>
	<li>Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA su una canna di metallo e posizionarlo nel sebatoio criobanca velocemente come possibile. Conservare i campioni in un deposito di contenitore dewar fino all'ulteriore utilizzo.</li>
</ol>4. procedura di riscaldamento
<ol><li>Riscaldare ogni ago separatamente. Tutte le soluzioni di riscaldamento dovrebbero essere a 25 ° C.</li>
	<li>Staccare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA dalla canna in metallo e immergerlo nell'azoto liquido memorizzato in una scatola di polistirolo.</li>
	<li>Aprire lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nel vapore di azoto liquido (utilizzando forcipe) e rilasciare l'ago nell'azoto liquido.</li>
	<li>Trasferire l'ago molto veloce nella prima soluzione di riscaldamento e incubare per 1 min (a 25 ° C). Assicurarsi di trasferire l'ago rapidamente per evitare il suo riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.</li>
	<li>Trasferire l'ago nella seconda soluzione scaldavivande e incubare per 3 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Trasferire l'ago nella terza soluzione scaldavivande e incubare per 5 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Rilasciare i testicoli dall'ago di facendole scorrere verso il basso con una pinzetta curva. Luogo ogni testicolo riscaldato individualmente in un pozzo separato (piastra a 96 pozzetti) riempito con 250 µ l di L-15 supplementato con 10% FBS. Assicurarsi che i pozzi sono etichettati secondo il campione. Tenere la piastra ben su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono riscaldati e fino ad ulteriore lavoro.</li>
</ol>5. tessuto digestione
<ol><li>Preparare 500 µ l di soluzione di dissociazione per ciascun campione in provette separate da 2 mL. Etichettare le provette secondo il codice del campione. Incubare la soluzione preparata dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere il tessuto riscaldato nella soluzione di digestione e tagliarlo in piccoli pezzi da almeno 30 movimenti di piccole forbici.</li>
	<li>Incubare il tessuto tagliato su una piastra di agitazione per 90 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Interrompere il processo di digestione aggiungendo 400 µ l di L-15 e 100 µ l di FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitare bene la soluzione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtrare la soluzione ottenuta attraverso 50 µm filtri in una provetta da 1,5 mL. Etichettare le provette di conseguenza.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione filtrata a 200 × g per 10 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 20 µ l di L15 supplementato con 10% FBS. Agitare manualmente il tubo fino a che il pellet sia completamente disciolta. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° c fino al successivo utilizzo.</li>
</ol>6. valutazione vitalità e conta cellulare
<ol><li>Mix 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4% in una provetta PCR adeguatamente etichettata 0,2 mL. Se vengono utilizzati diversi volumi, assicurarsi che il rapporto di diluizione di 1:1 rimane.</li>
	<li>Incubare la sospensione per 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Verifica la fattibilità di ogni campione in un emocitometro sotto il microscopio.</li>
	<li>Contare il numero di cellule vive (senza macchia di tripan blu) in 15 campi. Calcolare il numero totale di cellule in 20 µm della sospensione delle cellule. La sospensione è ora pronta per qualsiasi applicazione a valle. Nota: Quando si ottimizza la procedura per le altre specie con corpo più grande, utilizzare frammenti di testicolo di uguale peso. Utilizzare testicoli da un individuo per tutti i gruppi sperimentali al fine di evitare la variabilità individuale nei risultati. Nel caso di zebrafish, abbiamo approfittato del fatto che sinistra e testicolo di destra deve contenere un numero pari (o molto simile) di cellule germinali13 (vedere i risultati di rappresentante). Il testicolo di sinistra è stato mantenuto come controllo mentre il testicolo di destra era vetrificato/riscaldati. Percentuale di redditività è stato calcolato il numero di cellule isolate dal testicolo vetrificato/riscaldato rispetto al numero di cellule isolate dal testicolo fresco.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish...

Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l'archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazione offre molti vantaggi come estensione della stagione riproduttiva, aggira la necessità per la manutenzione continua dei riproduttori, ed è più costo - e Labor-efficiente2.
Protocolli per la crioconservazione di spermatozoi sviluppato durante il passato parecchi anni2,3,4 offrono la possibilità di successo deposito di materiale genetico maschile di zebrafish. Tuttavia, la crioconservazione degli ovuli o embrioni di pesce non è ancora possibile grazie alla loro struttura complessa e di grandi quantità di materiale di tuorlo. Recentemente, la pratica del trapianto di cellule primordiali germinali (PGC) o cellule staminali spermatogoniali (SSCs) offre un bypass per questa barriera di svilupparsi dopo trapianto5in funzionali degli spermatozoi e uova. Crioconservazione delle CSS offre quindi una nuova frontiera nella conservazione delle risorse genetiche rare e preziose.
Anche se crioconservazione offre molti vantaggi, il processo di congelamento lento-tasso genera diverse condizioni che possono portare a cella danno2. Questi includono la formazione di ghiaccio intracellulare ed extracellulare, disidratazione, tossicità crioprotettore e altri. Ghiaccio intracellulare danneggia le cellule, ghiaccio extracellulare può portare a frantumazione meccanica delle cellule, mentre la diffusione dell'acqua dalle cellule durante il congelamento lento-tasso può condurre a disidratazione6. Recentemente, vetrificazione come una tecnica che impedisce gli effetti negativi della formazione di ghiaccio è stata applicata nella crioconservazione di gameti di pesce7,8,9. Esso presenta una tecnica di raffreddamento ultra-rapida attraverso il quale i mezzi di comunicazione interne ed esterne trasformare in uno stato amorfo/vetroso senza cristallizzazione in ghiaccio7,10. Vetrificazione successo del tessuto testicolare e ovarico è stata provata in specie di uccelli e mammiferi10,11,12, aprendo così la possibilità per la sua applicazione in pesce, pure.
In questo studio, presentiamo la procedura di vitrificazione (NIV) ago immerso per la crioconservazione di zebrafish tutta i testicoli. Dimostriamo un metodo affidabile per l'isolamento di cellule germinali di zebrafish fase iniziale senza contaminazione e un processo di crioconservazione che produce quantità elevate relativamente precoce delle cellule di germe con una bassa presenza di altre cellule, soprattutto gli spermatozoi. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio a dimostrare un protocollo dettagliato visualizzato in quel momento per ultra-rapido raffreddamento del tessuto gonadico pesce e cellule germinali zebrafish. Inoltre, è evidenziato la ripetibilità del metodo in cinque differenti zebrafish ceppi: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ' immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l'esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.

In media, il numero delle cellule di germe iniziale isolato da un testicolo singolo zebrafish fresco variava tra 40.000 e 200.000 cellule a seconda delle dimensioni del pesce. Quando nei testicoli di zebrafish fresco in tutti i 5 ceppi di digestione, cellule germinali primi non erano sola cellule presenti nelle sospensioni delle cellule (Figura 2). Al lato delle cellule di germe iniziale, numerosi gli spermatozoi sono stati trovati pure. D'altra parte, c'eran...

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Views.  Szent István University. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetica

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biologia

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura migliorata per ottenere ovociti di zebrafish di stadio I privi di cellule della granulosa

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model organism to investigate early developmental processes from oocyte to embryo. In zebrafish, oocytes are surrounded by a single layer of somatic granulosa cells. However, separating granulosa cells from oocytes poses a challenge, as achieving pure oocytes is crucial for precise analysis. Although various methods have been proposed to isolate zebrafish oocytes at different developmental stages, current techniques fall short in removing granulosa cells completely, limiting the accuracy of genome analysis focused solely on oocytes. In this study, we successfully developed a rapid and efficient process for isolating pure stage I oocytes in zebrafish while eliminating granulosa cell contamination. This technique facilitates biochemical and molecular analysis, particularly in exploring epigenetic and genome structure aspects specific to oocytes. Notably, the method is user-friendly, minimizes oocyte damage, and provides a practical solution for subsequent research and analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Metodo avanzato per isolare gli ovociti puri di Zebrafish Stage I

This protocol describes a modified procedure for rapidly isolating clean stage I oocytes in zebrafish devoid of granulosa cells, thereby providing a convenient method for oocyte-specific research.

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Riepilogo

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Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da