Zebrafish sta emergendo come un eccellente modello di vertebrato per lo studio degli eventi cromosomici della meiosi tra cui l'accoppiamento cromosomico omologo, la sinapsi e la ricombinazione. Questo protocollo di diffusione della superficie nucleare ci ha permesso di visualizzare le caratteristiche chiave dell'architettura del cromosoma meiotico usando la microscopia a super risoluzione. I ricercatori possono aspettarsi centinaia di nuclei ben diffusi per scivolo con meno detriti rispetto ad altri protocolli di diffusione del pesce zebra.
La parte tecnicamente più impegnativa di questa procedura è la dissezione dei teste di zebrafish in quanto è in prossimità della pelle ed è anche attaccata ad altri organi. La visualizzazione della procedura di dissezione consentirà ai ricercatori di sapere cosa aspettarsi quando vedono il gonad incorporato nel tessuto dell'animale. Dopo aver eutanasiato il pesce zebra maschio, decapitare un pesce alla volta con piccole forbici e quindi utilizzare micro forbici per tagliare lungo la linea mediana ventrale per esporre la cavità corporea.
Mettere il pesce in una piastra di Petri rivestita in silicone e coprire da una piscina poco profonda di 1X PBS. Al microscopio con ingrandimento 1,65X, sezionare i tester utilizzando le forcep. Rimuovere il più possibile il grasso e il tessuto circostante dai tester.
Il gonade apparirà traslucido sotto la luce del mirino della dissezione mentre il grasso circostante potrebbe avere un aspetto leggermente più scuro. Una certa quantità di grasso può essere lasciata sul gonad senza ostacolare la procedura. Aggiungere ogni teste sezionato direttamente in un tubo da cinque millilitri con due millilitri di DMEM e tenere sul ghiaccio.
Per dissociare le cellule testes, aggiungere 200 microlitri di soluzione di collagenasi al tubo dei cinque millilitri con i teste. Mescolare la soluzione inverterla più volte. Agitare delicatamente i tester in uno shaker dell'incubatore orizzontalmente a 100 giri/min a 32 gradi Celsius.
Invertire rapidamente il tubo ogni 10 minuti per facilitare la dissociazione. Dopo un'ora, il DMEM è nuvoloso e i teste sono in piccoli blocchi. Mentre i teste vengono incubati in collagenasi, prewarm 100 microlitri di soluzione di saccarosio molare a 37 gradi Celsius.
Per lavare la collagenasi, aggiungere DMEM a un volume finale di cinque millilitri e invertire il tubo alcune volte. Pellet i tester a 200 g per tre minuti a temperatura ambiente. Rimuovere tre millilitri del supernatante in modo che rimangano solo due millilitri.
Ripetere il lavaggio DMEM due volte in più. Dopo l'ultimo lavaggio DMEM, rimuovere quattro millilitri del supernatante e aggiungere un millilitro di DMEM, 200 microlitri di soluzione di tripina e 20 microlitri della soluzione di DNasi I. Invertire il tubo alcune volte per mescolare la soluzione.
Scuotere orizzontalmente il tubo a 32 gradi Celsius a 100 giri/min. Invertire rapidamente il tubo ogni cinque minuti per facilitare la dissociazione. Dopo cinque o 15 minuti, la soluzione DMEM contiene solo pochi grumi.
Aggiungere 500 microlitri della soluzione inibitore della tripside e 50 microlitri della soluzione di DNasi I. Invertire il tubo alcune volte per mescolare, quindi girare brevemente verso il basso a 200 g per tre minuti a temperatura ambiente per rimuovere il liquido o i grumi che possono aderire al tappo del tubo o al lato del tubo. Posizionare il tubo sul ghiaccio e rimpiorsi la sospensione cellulare tubazionando ripetutamente su e giù con una pipetta di trasferimento in plastica per due minuti per facilitare la dissociazione di eventuali grumi rimanenti.
Assicurarsi che la sospensione cellulare non vada nel bulbo della pipetta di trasferimento. Quindi pre-bagnare un colino a celle da 100 micron con DMEM e posizionarlo sopra un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio. Trasferire la sospensione cellulare attraverso il filtro una goccia alla volta utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica.
Trasferire il filtrato utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica su un nuovo tubo da cinque millilitri. Assicurarsi di raccogliere le celle raggruppate collegate alla parte inferiore del filtro. Aggiungere DMEM nel tubo a un volume finale di cinque millilitri.
Pellet le cellule a 200 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il più possibile il supernatante senza disturbare il pellet e aggiungere cinque microlitri della soluzione di DNasi I direttamente nel pellet. Quindi mescolare il pellet con la soluzione DNase I raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo da quattro a cinque volte lungo un rack vuoto per tubi a microcentrifugo.
Aggiungere DMEM a un volume finale di cinque millilitri e mescolare la soluzione invertendo più volte il tubo. Pellet la sospensione cellulare a 200 g per due minuti a temperatura ambiente. Ripetere il trattamento della DNasi da uno a tre volte in più fino a quando il pellet rimescolato non si intasa all'aggiunta di DMEM.
Dopo l'ultimo giro, rimuovere il più possibile il supernatante senza disturbare il pellet. Quindi, aggiungere un millilitro di 1X PBS e rimospendare il pellet raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo lungo un rack a tubo vuoto. Pellettare la sospensione cellulare a 200 g per cinque minuti e quindi rimuovere il più supernatante possibile senza disturbare il pellet.
Tagliare tre millimetri dalla fine di una punta della pipetta da 200 microlitri per allargare l'apertura. Con la punta della pipetta tagliata, resuspend il pellet in 80 microlitri di soluzione di saccarosio molare 0.1 pipettando su e giù. Lasciare riposare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per tre minuti.
Successivamente, con una punta di pipetta, rivestire una diapositiva con 100 microlitri di formaldeide all'1% con 0,15%Triton X-100. Quindi aggiungere 18 microlitri della sospensione cellulare del saccarosio al centro dello scivolo in linea retta perpendicolare al bordo lungo. Inclinare lo scivolo avanti e indietro per facilitare la diffusione della sospensione cellulare in tutti gli angoli.
Posizionare i vetrini piatti in una camera di umidità aperta leggermente incrinato per evitare che la soluzione di formaldeide si asciughi. Posizionare la camera di umidità in un cassetto scuro durante la notte. Al mattino, rimuovere il coperchio dalla camera di umidità e lasciare asciugare completamente gli scivoli.
Posizionare gli scivoli in un barattolo di coplin e quindi riempire il barattolo di coplin con acqua distillata. Incubare per cinque minuti con tremori delicati a temperatura ambiente. Versare l'acqua e riempire il barattolo con uno o 250 agenti bagnanti.
Lavare due volte per cinque minuti ciascuno con tremori delicati a temperatura ambiente. Lasciare asciugare completamente le diapositive e conservarsi a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono macchiate. Questo protocollo delineava un metodo per preparare e visualizzare la diffusione degli spermatociti di zebrafish che produce nuclei non sovrapposti ben diffusi.
I pannelli a sinistra mostrano tre fasi di prophase meiotico, leptotene, zigotene precoce e pachytene. I telomeri erano macchiati di magenta per ogni tappa. Un esempio di diffusione di scarsa qualità a causa di trattamenti DNasi I insufficienti sono mostrati qui.
I cromosomi meiotici macchiati per SYCP3 indicano nuclei sovrapposti a causa di una sospensione viscosa delle cellule di saccarosio che impedisce alle cellule di diffondersi correttamente sullo scivolo. È molto importante iniziare con la giusta quantità di materiale di partenza, trattare i tester zebrafish per la quantità appropriata di tempo nella tripparina ed eseguire il numero necessario di trattamenti di DNasi I in quanto in caso di incapacità può portare a pochissimi nuclei o nuclei raggruppati. I DPI appropriati devono sempre essere indossati quando si lavora con la formaldeide.
Seguendo la procedura di diffusione, i cromosomi possono essere macchiati per visualizzare varie strutture cromosomiche e interruzioni a doppio filamento per analizzare la dipendenza da temporizzazione e localizzazione degli eventi meiotici. La nostra tecnica ha spianato la strada a dimostrare che il pesce zebra può essere un modello migliore di spermatogenesi umana rispetto al topo in base alle caratteristiche cromosomici e al bouquet di telomeri.
