Gli autori desiderano ringraziare Ina Wolter per la sua eccellente assistenza tecnica. VGAT-Venus ratti transgenici sono stati generati da Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi in Istituto Nazionale per le Scienze Fisiologiche, Okazaki, Giappone, utilizzando pCS2-Venere fornito dal Dr. A. Miyawaki.

Dichiarazione Etica: tutte le procedure e animale manutenzione sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali, la legge tedesca Animal Welfare, il Consiglio direttiva 86/609 / CEE per quanto riguarda la protezione degli animali europea, e le linee guida delle autorità locali (Berlino, T-0215/11 ) 1 Preparazione di fette acuta-ippocampali <ol><li> Prendete un topo transgenico (da 17 a 24 giorni di età), che esprime la proteina fluorescente Venere / YFP sotto il promotore vGAT, che etichetta la maggior parte di interneuroni inibitori corticali 13. Decapitare il ratto. Rapidamente sezionare il cervello (&lt;40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% di CO 2) fluido a base di saccarosio-artificiale cerebrospinale (saccarosio-ACSF, Figura 1A). </li><li> Valutare il cervello di ratto sezionato per Venus / YFP fluorescenza con 505 nm lampada e 515 filtro per le emissioni LED, montata su un paio di occhiali. </li><li> Rimuovere il terzo anteriore della corteccia e cerebEllum; quindi separare gli emisferi, il tutto con un bisturi. Rimuovere la superficie dorsale della corteccia per fornire una superficie piana per incollare il cervello giù, come descritto in precedenza 14. </li><li> Tagliare a fette trasversali (300 micron) della formazione dell&#39;ippocampo su un vibratome, gli emisferi devono essere circondati da semifrozen, carbogenated saccarosio-ACSF (Figura 1B) 14. Rimuovere ulteriori regioni di rostrale della corteccia, mesencefalo e tronco encefalico. Trasferire ogni fetta di una camera di contenimento sommerso contenenti saccarosio-ACSF, che è carbogenated e riscaldato a 35 ° C. </li><li> Lasciate le fette di recuperare a 35 ° C per 30 minuti dal momento dell&#39;ultima fetta di entrare nel ACSF riscaldato. Fate questo in modo da riattivare i processi metabolici e facilitare la richiusura dei processi neuronali tagliati. Poi il trasferimento a temperatura ambiente per lo stoccaggio (Figura 1C). </li></ol> 2 Fabbricazione e riempimento di registrazione Pipettes <ol><li> Pupipette di patch ll da capillari di vetro, in modo che una resistenza pipetta di 2-4 MW si raggiunge quando riempita di filtrato (filtro a siringa, dimensione dei pori: 0,2 micron) soluzione intracellulare contenente 0,1% biocitina (per l&#39;etichettatura intracellulare). Mantenere la soluzione intracellulare raffreddato in ghiaccio per impedire il degrado dei suoi componenti. </li><li> Riempire pipette di patch per l&#39;identificazione delle correnti post-sinaptiche con una soluzione contenente un basso Cl fisiologicamente rilevanti - concentrazione (E R (Cl) = -61 mV; vedi elenco soluzione). </li><li> Per le registrazioni coppie di identificare le risposte recettore mediata presinaptiche, riempire pipette di patch con la soluzione intracellulare con bassa capacità di Ca 2 + buffer per evitare interferenze con il rilascio del trasmettitore presinapticamente, così come 4 volte superiore Cl - concentrazione (E R (Cl) = -20 mV) per migliorare il rapporto segnale-rumore di IPSCs osservati 5 consentano una valutazione accurata di resp farmacologicaonsiveness. Si noti che la modifica Cl - concentrazione può alterare IPSC cinetica 15. </li></ol> 3. cellule intere patch-clamp Registrazione da FS-INS <ol><li> Carbogenate ACSF e alimentare attraverso il sistema di perfusione alla camera di registrazione, per mezzo di una pompa peristaltica (che rimuove anche ACSF dalla camera di registrazione attraverso una linea di aspirazione, la Figura 2A). Accendere tutte le apparecchiature del setup in preparazione per la registrazione. </li><li> Trasferire una fetta di camera di registrazione e tenere in posizione con un anello in platino infilate con singole fibre di seta. Posizionare la fetta in modo che lo strato (str.) Pyramidale di CA1 scorre verticalmente attraverso il campo di vista, consentendo l&#39;accesso con 2 pipette sia alla str. radiatum e str. Oriens contemporaneamente (Figure 2C e 4A). </li><li> Posizionare la camera nel setup e avviare la perfusione di carbogenated e riscaldata (32-34 ° C) la registrazione di unCSF a una portata di 5-10 ml / min. </li><li> Valutare la qualità fetta sotto l&#39;ottica IR-DIC a 40X di ingrandimento obiettivo, e visualizzare con una camera CCD visualizzata su un display. Assumere buona qualità fetta se un gran numero di rotonde, moderatamente contrasto cellule CA1 piramidali CA1 (PC) può essere visto in str. pyramidale a profondità di 20-30 micron di sotto di una superficie liscia e leggermente crateri (Figura 2C). Fette di scarsa qualità contengono un gran numero di cellule altamente contrastati, rimpicciolite o gonfie, con una superficie fetta irregolare. </li><li> Identificare putativi interneuroni FS sotto illuminazione epifluorescenza come quelli che esprimono Venere / YFP (Figura 2B), con ampio somata multipolare dentro o vicino alla str. pyramidale. Selezionare le celle ragionevolmente profondo all&#39;interno della slice (50-100 micron, Figura 2C), al fine di preservare meglio l&#39;integrità morfologica. </li><li> Montare l&#39;elettrodo di registrazione nel supporto pipetta sulla headstage; poi apply bassa, pressione positiva (20-30 mBar) attraverso la linea tubo. Abbassare la pipetta alla superficie della fetta, leggermente spostata verso il centro del neurone selezionato. </li><li> Ottenere configurazione di registrazione whole-cell come descritto in precedenza 14,16 e vedi anche figure 2D e 2E: <ol><li> Obiettivo di una cella: Aumentare la pressione di 70-80 mBar e rapidamente abbassare la pipetta con la fetta appena sopra la soma della cella selezionata (Figura 2D, in alto). </li><li> Avvicinarsi alla cella: Premere la pipetta contro la membrana cellulare per produrre una &quot;fossetta&quot; su di esso (Figura 2D, in alto). Eseguire questo passaggio rapido, al fine di evitare l&#39;etichettatura biocitina delle cellule vicine. </li><li> Creare un sigillo giga-ohm: Rilasciare la pressione e contemporaneamente applicare un comando di tensione 20 mV alla pipetta. Una guarnizione giga-ohm (1-50 GΩ; la figura 2D, fondo e figura 2E centro) typicalleato si sviluppa rapidamente. Una volta sigillato, applicare la membrana a riposo previsto potenziale (tipicamente tra -70 e -60 mV) come comando di tensione. </li><li> Sfondare la patch: Una volta sigillato, rottura la patch di membrana con un breve impulso di pressione negativa; ottenendo così la configurazione whole-cell (Figura 2E, in basso). </li></ol></li><li> Compensare capacità whole-cell e la resistenza serie (S R). R s è normalmente 5-20 MW e stabile per un massimo di 120 min. Abbandonare le cellule se potenziale di membrana (V M) sul break-through è più depolarizzata a -50 mV; R S è inizialmente superiore a 30 MW; R o S cambia di più del 20% nel corso della registrazione. </li><li> Identificare FS-in da loro risposta (in modalità current-clamp) per una famiglia di iper per depolarizzanti impulsi di corrente (-250 a +250 pA, Figura 2F, in alto). FS-in sono relativamente depolarizzata V M (tipicamente -50 to -60 mV), a breve membrana costante di tempo (&lt;20 msec) e rispondere ad un 500 pA depolarizzante iniezione di corrente con un treno di potenziali d&#39;azione (AP) a frequenze&gt; 100 Hz 11 (Figura 2F, in basso), che sono marcatamente diversi da quelli in CA1 PC (Figura 2F, al centro). </li></ol> 4. extracellulare stimolazione elettrica per evocare risposte GABA B R-mediata <ol><li> Per osservare le risposte sinapticamente evocate, posizionare un elettrodo di stimolazione extracellulare (una pipetta di patch piena di 2 M NaCl; Resistenza: 0,1-0,3 MW) nella fetta al confine di str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posizionare l&#39;elettrodo 200-300 micron laterale alla soma per evitare la stimolazione elettrica diretta della cellula e ridurre al minimo gli artefatti di stimolazione (Figura 3a). </li><li> Una volta che l&#39;elettrodo di stimolazione viene posizionato, di ottenere la registrazione whole-cell dila cella scelto e valutare il fenotipo fisiologico in modalità current-clamp, come nella sezione 3.9 (Figura 3B). </li><li> Con il neurone registrato in voltage-clamp (V M -65 mV), consegnare la stimolazione elettrica degli assoni presinaptici a 50 V (~ 500 μA stimolo efficace) ogni 20 secondi, con un isolato a tensione costante stimolatore. Utilizzare solo stimoli (100 msec durata, Figura 3C, in alto) per osservare GABA B R IPSCs mediate, e interleave con treni di stimoli multipli (a 200 Hz) per produrre maggiore rilascio del trasmettitore. </li><li> Bagno applicare ionotropici antagonisti dei recettori del glutammato (AMPA dei recettori: DNQX [10 mM]; recettore NMDA: D-AP5 [50 mM]) per rivelare isolato monosinaptico IPSC (Figura 3C, medio-alta). Inoltre isolare il IPSC GABA B R-mediata con l&#39;applicazione di un bloccante GABA A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C mezzo lower). </li><li> Confermare la conseguente lenta verso l&#39;esterno di corrente (Figura 3C inferiore, espanso) ad essere GABA B R-mediata dalla successiva applicazione di CGP-55845 [5 mM] (Figura 3C inferiore, giacente in grigio) </li></ol> 5. accoppiati registrazioni di sinapticamente accoppiate FS-IN e CA1 PC <ol><li> Valutare GABA B R-mediata controllo presinaptica della trasmissione sinaptica inibitoria con le registrazioni simultanee, eseguiti tra sinapticamente-accoppiati IN e PC coppie come descritto di seguito. </li><li> In primo luogo, stabilire una registrazione a cellula intera di un interneuroni presinaptico (come al punto 3) e confermare il fenotipo FS (Figura 4A). </li><li> Poi patchare un CA1 PC vicina (distanza 20-100 micron, Figura 4A) e applicare breve suprathreshold impulsi di corrente depolarizzante (durata 1 msec, 1-5 nA ampiezza) al presinaptica IN (tenutasi in modalità current-clamp) per suscitare AP. Se un co sinapticannection è presente, AP nel risultato IN nel IPSCs nel CA1 PC, tenutasi in voltage-clamp (compensare R S a circa il 80%). </li><li> Se necessario, riempire un nuovo elettrodo di registrazione e registrare da altri PC CA1 finché non si trova una connessione. </li><li> Una volta che la connessione è stabilita, suscitare coppie di AP nel presinaptico FS-IN per valutare sia la risposta sinaptica unitario e comportamento dinamico. Utilizzare un tipico protocollo accoppiato impulsi di 2 stimoli depolarizzanti con un intervallo di 50 msec (Figura 4B). </li><li> Raccogliere le tracce di controllo in condizioni basali. Quindi, applicare i GABA B baclofen R agonisti selettivi (10 micron) per la ACSF perfusione, attivando così GABA B Rs, seguita da antagonista CGP-55845 (5 mM), per bloccare completamente gli effetti del recettore mediata. Raccogliere ~ 50 tracce durante lo stato stazionario di ciascuna condizione di farmaco (Figura 4B e C). </li><li> Una volta che la registrazione è completata, sigillare la membrana somatica formando un Outside-out patch: Lentamente ritirare la pipetta dal corpo cellulare in V-clamp e come R S aumenta, ridurre la V M a -40 mV. Fate questo per facilitare la formazione del cerotto esterno-out; quindi rimuovere la pipetta dal bagno. </li></ol> 6 Analisi delle proprietà elettrofisiologiche <ol><li> NOTA: Una moltitudine di diversi pacchetti software sono disponibili per l&#39;acquisizione dei dati elettrofisiologici. Qui, WinWCP, viene utilizzato un programma di Windows nel pacchetto Strathclyde Elettrofisiologia software libero, che permette di registrare fino a 16 canali di ingresso analogici e l&#39;uscita di 10 segnali digitali. </li><li> Filtro passa-basso tutti i dati a 5-10 kHz e campione a 20 kHz. </li><li> Analizzare i dati fisiologici con una suite di analisi off-line. NOTA: Stimfit, un pacchetto software open source che include una shell Python, è usato in questo caso; comunque altre alternative possono essere facilmente utilizzati al posto. <ol><li> Analizzare membrana passiva proprietà di neuroni registrati, acquisite nel morsetto corrente, dal potenziale di membrana. </li><li> Misurare la media potenziale di membrana dalla linea di base delle risposte registrate dall&#39;inizio della registrazione. </li><li> Calcolare la resistenza di ingresso, utilizzando la legge di Ohm, dalla risposta di tensione ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti (≤ -50 pA). Per migliorare rapporto segnale-rumore, la media più tracce. Nota: i nostri esempi sono tipicamente medie di 10-50 singoli spazza. </li></ol></li><li> Stimare il tempo membrana apparente costante montando una curva monoesponenziale al decadimento delle risposte ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti. </li><li> Analisi del potenziale d&#39;azione della forma d&#39;onda per determinare la soglia, ampiezza (soglia di picco) e la durata (larghezza misurata a metà altezza) suscitata da soglia impulsi di corrente depolarizzante. </li><li> Analizzare GABA B R IPSCs mediate dalle registrazioni clamp di tensione. Filtro traccia off-line all&#39;indirizzo500 Hz (filtro gaussiano) e valutare l&#39;ampiezza di picco e la latenza del GABA B R risposta mediata (in medie di almeno 10 tracce). </li><li> Rileva l&#39;effetto del GABA B Rs sull&#39;uscita inibitorio di Ins come un cambiamento di ampiezza di picco delle IPSCs GABA A R-mediati misurati tra picco e precedente linea di base. Calcolare l&#39;ampiezza media da ≥50 tracce per il periodo di controllo e lo stato stazionario di tutte le epoche farmacologici. </li></ol> 7 Visualizzazione e immunocitochimica di FS-Ins <ol><li> Dopo le registrazioni, fissare le fette per immersione in paraformaldeide al 4% con 0.1 M tampone fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C. </li><li> Se fette necessari possono essere trasferiti PB e conservati fino a ~ 1 settimana prima trasformazione. </li><li> Lavare le fette liberamente in PB fresco e successivamente a 0,025 M PB con il 0,9% di NaCl (PBS, pH = 7.35). </li><li> Per ridurre l&#39;anticorpo non specifico vincolante, bloccare le fette for 1 ora a temperatura ambiente in una soluzione contenente 10% di siero di capra normale (NGS), 0,3% Triton-X100 (un detergente per permeabilize membrane) e lo 0,05% NaN 3, costituito in PBS. </li><li> Per etichettare per l&#39;espressione PV, utilizzare un anti-PV topo monoclonale diluito in una soluzione contenente 5% NGS, 0.3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, in PBS. Incubare anticorpi primari per 2-3 giorni a 4 ° C 12. Sciacquare accuratamente le fette in PBS. </li><li> Applicare anticorpi secondari anti-topo fluorescenti (ad es AlexaFluor-546.) Insieme alla biotina streptavidina-binding protein, coniugato a un fluorocromo (ad esempio, AlexaFluor-647); e incubare in una soluzione contenente 3% NGS, 0.1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluito in PBS e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Liberamente sciacquare fette 2-3x con PBS seguiti da 2-3 risciacqui in PB. Montare le fette su vetrini. Utilizzare un agar distanziale 300 micron per evitare che la fetta di collassare. Fette di Cover-scivolo con una fluoresmezzo di montaggio cento e tenuta con unghie vernice. </li></ol> 8 Imaging e ricostruzione di Visualized FS-Ins <ol><li> Visualizza le fette con un microscopio confocale a scansione, con il giornalista fluorochome eccitato con la linea laser appropriata (diodo laser 635 nm per AlexaFluor-647; Elio-Neon 543 nm per AlexaFluor-546 etichettatura per il fotovoltaico e Argon 488 o 515 nm per Venus / YFP). </li><li> Prendere le immagini a un Z-risoluzione appropriata (tipicamente 0,5-1 micron passi, usando un obiettivo 20X) per produrre una Z-stack di tutta la cellula. Più pile sono normalmente necessari per l&#39;immagine tutta la cella, che può essere digitalmente cucita off-line utilizzando FIJI / software ImageJ (Figura 5A). </li><li> Ricostruire la cella dalla pila immagine cucita utilizzando un metodo di analisi semi-automatica (semplice plugin neuriti Tracer in FIJI / ImageJ pacchetto software 17, Figura C). </li><li> Infine, valutare il PV-immunoreattività della interneuron con una lente obiettivo ad alta apertura numerica (60X silicio-immersion, NA = 1.3). Rendere le immagini del soma, dendriti prossimali e assoni prossimale, o in alternativa di terminali assoni se washout somatica del fotovoltaico è troppo forte. Le cellule sono considerati immunoreattive per PV se immuno-etichettatura è visto ad allineare con le strutture biocitina marcati (Figura 5B). </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li><li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates.">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li><li>Neu, A., F&#246;ldy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus.">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li><li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit,+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic,+basket,+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus.">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Descriviamo un metodo che combina tecniche elettrofisiologiche e neuroanatomiche caratterizzare funzionalmente i neuroni morphologically- e neurochimico-identificati in vitro; in particolare i diversi tipi di INs inibitorie corticali. Gli aspetti principali della procedura sono: (1) pre-selezione dei potenziali INs; (2) la registrazione intracellulare e la visualizzazione dei neuroni; e infine (3) analisi morfologica e immunocitochimica di INs registrati. Sebbene questo studio ha affrontato PV-in in particolare, il prot...

Circuiti neuronali ippocampali sono da tempo oggetto di intenso esame, per quanto riguarda sia l&#39;anatomia e la fisiologia, a causa del loro ruolo essenziale nell&#39;apprendimento e nella memoria, così come la navigazione spaziale in entrambi gli esseri umani e roditori. Analogamente, l&#39;organizzazione laminare prominente, ma semplice dell&#39;ippocampo rende questa regione un soggetto privilegiato di studi che riguardano proprietà strutturali e funzionali di reti corticali. Circuiti dell&#39;ippocampo sono costituiti da cellule eccitatorie principali (&gt; 80%) e una più piccola (10-20%), ma altamente diversificata coorte di interneuroni inibitori 1-3. Interneuroni liberano acido γ-aminobutirrico (GABA) dai loro terminali assoni che agisce a ionotropici veloce recettori GABA A (GABA A Rs) e lenti metabotropici GABA B recettori GABA B (Rs) 4. Questi meccanismi inibitori controbilanciano di eccitazione e regolano l&#39;eccitabilità delle cellule principali, e quindi latempi ir e modello di scarico. Tuttavia, GABA rilasciato da interneuroni agisce non solo sulle cellule principali, ma anche sugli stessi interneuroni 5,6. Recettori pre e post-sinaptici mediano di regolazione di ritorno e inibitori delle interazioni reciproche tra i vari tipi di interneuroni. Questi meccanismi inibitori nelle reti interneuroni sono ritenuti essere centrale per la generazione e la sagomatura di modelli di attività della popolazione, in particolare le oscillazioni a frequenze diverse 7. Whole-cell patch-clamp registrazione è un metodo consolidato per l&#39;esame delle proprietà intrinseche e delle interazioni sinaptiche dei neuroni. Tuttavia, a causa della elevata diversità di tipi di interneuroni, ricerca di interneuroni inibitori richiede rigorosa identificazione delle cellule registrate. Come tipi di interneuroni dell&#39;ippocampo sono caratterizzati da elementi particolari morfologici e l&#39;espressione marcatore neurochimico, anatomico combinata e immunocitochimica eSAME può fornire un mezzo per determinare l&#39;identità precisa 6,8,9 interneuroni. Nel presente lavoro si descrive un approccio sperimentale in cui whole-cell patch-clamp da neuroni singoli o coppie sinapticamente-accoppiati sono combinati con etichettatura intracellulare, seguito dal post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica, permettendo la caratterizzazione di lenta GABA B recettore mediata effetti inibitori di interneuroni identificati. Come esempio, ci concentriamo su uno dei principali tipi di interneuroni, un sottoinsieme dei cosiddetti &quot;cellule canestro&quot; (BC), che innerva il soma e dendriti prossimali dei suoi obiettivi post-sinaptici ed è caratterizzata da un &quot;spike veloce&quot; (FS) scarico modello, un assone densamente che copre lo strato corpo cellulare, e l&#39;espressione della proteina legante il calcio parvalbumina (PV) 10,11. Questi interneuroni mostrano grandi correnti inibitorie post-sinaptiche, così come pre prominentemodulazione sinaptica della loro produzione sinaptica, in risposta al GABA B R di attivazione 12. La combinazione delle tecniche descritte qui può essere applicato altrettanto bene di indagare i meccanismi intrinseci o sinaptici in una varietà di altri tipi di neuroni identificati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

Interneuroni inibitori GABAergici svolgono un ruolo centrale nei circuiti neuronali del cervello. Interneuroni comprendono un piccolo sottoinsieme della popolazione neuronale (10-20%), ma mostrano un elevato livello di eterogeneità fisiologica, morfologica, e neurochimici, che riflettono le loro diverse funzioni. Pertanto, l&#39;indagine di interneuroni fornisce importanti informazioni ai principi di organizzazione e funzionamento dei circuiti neuronali. Ciò, tuttavia, richiede un approccio fisiologico e neuroanatomica integrato per la selezione e l&#39;identificazione dei tipi di interneuroni individuali. Whole-cell patch-clamp registrazione da acuta fettine di cervello di animali transgenici, che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto i promotori di marcatori specifici di interneuroni, fornisce un metodo efficace per individuare e caratterizzare elettrofisiologicamente proprietà intrinseche e sinaptiche di tipi di interneuroni specifici. Combinato con etichettatura colorante intracellulare, questo approccio può essere esteso con il post-hoc moanalisi rphological e immunocitochimica, consentendo l&#39;identificazione sistematica dei neuroni registrati. Questi metodi possono essere personalizzati per soddisfare una vasta gamma di questioni scientifiche riguardanti le proprietà funzionali dei diversi tipi di neuroni corticali.

A condizione che la qualità fetta è sensibilmente buona, la registrazione da entrambi CA1 PC e FS-in possono essere raggiunti con difficoltà minima. La linea di topo transgenico che esprime Venere / YFP sotto il promotore vGAT 13 non identifica inequivocabilmente FS-in, o anzi jacket. Tuttavia registrazioni da INs in ed intorno a str. piramidale, dove la densità di FS-in è in genere alta 1, si traduce in una elevata probabilità di selezionare FS-in (Figura 2B). FS-in...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l&#39;identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K Views.  Charité Universitätmedizin.  Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica. 

Video: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Ricerca

Neuroscienze

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...