Grazie Kathy Gage, BS (dipartimento di anestesiologia, centro medico della Duke University, Durham, NC) per assistenza editoriale. NT riconosce sostegno da una sovvenzione di innovazione di sogno da Duke anestesiologia e NIH/NIA R01 AG057525-01.

Tutti gli esperimenti sugli animali erano condotte in conformità con l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dal istituzionale Animal Care & uso Committee (IACUC) presso la Duke University.
1. sperimentali animali
<ol><li>Mantenere i topi in un ambiente climatizzato con cicli di luce/buio di 12 h e adeguato accesso all'acqua e cibo standard. Casa non più di 5 littermates per gabbia ed evitare condizioni che potrebbero incoraggiare la lotta.</li>
	<li>Utilizzare topi C57BL6/J femmine a 3 mesi di età (giovane) o 18 mesi di età (vecchio).</li>
	<li>Per Parabiosi, acclimatare 2 topi insieme per almeno due settimane prima dell'intervento. I topi sono selvaggio-tipo C57BL6/J o eGFP +.</li>
	<li>Controllare la condizione fisica e l'aspetto generale dei topi al giorno.</li>
</ol>2. installazione preoperatoria per Parabiosi e chirurgia ortopedica
<ol><li>Pesare i 2 topi.</li>
	<li>Amministrare l'anestesia generale tramite un sistema di anestesia a una velocità di flusso costante di O2 di 0,2 L/min uso 5% isoflurane per induzione in un'aula di induzione. Nota: La profondità dell'anestesia può essere confermata con un pizzico di punta.</li>
	<li>Posizionare i mouse su un pad riscaldato in posizione supina. Utilizzare una sonda rettale per controllare la temperatura corporea durante tutta la procedura chirurgica.</li>
	<li>Per mantenere l'anestesia, abbassare la concentrazione inalata di isoflurane al 2,0% a 0,2 L/min attraverso una maschera facciale. Monitor per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia.</li>
	<li>Monitorare i parametri fisiologici (frequenza respiratoria, saturazione dell'ossigeno e il cuore battere) non invadente usando un impulso ossimetro (opzionale).</li>
</ol>3. Parabiosi chirurgia (protocollo 1A)
<ol><li>Amministrare l'analgesia (buprenorfina, SR/lento rilascio, 0,1 mg/kg per via sottocutanea) dopo induzione e prima manipolazione chirurgica. Iniettare bupivacaina (0,25%) ai fianchi appena prima dell'apertura. Applicare il lubrificante di occhio. Nota: Il protocollo di Parabiosi può essere eseguito indipendentemente dalla frattura tibia.</li>
	<li>Per tutto il corpo interno suturazione, utilizzare materiale di sutura polidioxanone 4-0. Per tutti i suturare esterni, utilizzare materiale di sutura in polipropilene 4-0.</li>
	<li>Ciascuno dei 2 topi lungo una linea contiguo tra il gomito, il fianco e il ginocchio sul lato da giuntare la barba. Disinfettare con iodio + 70% pelle di alcol macchia oltre 3 cicli in preparazione per incisione alternati. Usato strumenti sterilizzati in autoclave e mantenere un campo sterile. Nota: Posizionare il selvaggio-tipo mouse a destra del mouse eGFP e preparare il fianco sinistro del selvaggio-tipo mouse e il fianco destro del mouse eGFP per chirurgia (Figura 1).</li>
	<li>Su ogni mouse, è possibile utilizzare una forbice per fare un'incisione della pelle lungo il fianco, che vanno prossimale al ginocchio appena prossimale al gomito e senza disturbare i muscoli sotto la pelle.</li>
	<li>Iscriviti i tricipiti degli animali con i suturare interrotti 2.</li>
	<li>Unire le pareti del corpo lungo i fianchi con una sutura continua, in esecuzione di passaggi 7-9.</li>
	<li>Iscriviti il quadricipite dell'animale con i suturare interrotti 2.</li>
	<li>Chiudere la pelle del 2 parabionts con i suturare interrotti.</li>
	<li>Consentire i topi svegliarsi in aria ambiente.</li>
	<li>Per garantire il successo di questo protocollo, deve essere mantenuta la salute delle coppie: monitorare le coppie al giorno; eseguire la condizione di corpo segnando due volte a settimana; e pesare le coppie due volte a settimana. Nota: Ogni coppia è alloggiato singolarmente. Nota: Se si utilizza regolarmente buprenorfina (cioè non SR/lento rilascio) quindi amministrare 0,1 mg/kg per via sottocutanea in 1 mL di soluzione fisiologica per topo due volte al giorno per 3 giorni.</li>
	<li>Consentire 4 settimane di tempo di recupero per garantire una circolazione condivisa tra parabionts se si esegue la chirurgia per frattura tibiale.</li>
</ol>4. chirurgia per frattura tibiale (protocollo 1B)
<ol><li>Amministrare l'analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg per via sottocutanea) dopo induzione e prima manipolazione chirurgica. Iniettare bupivacaina (0,25%) al luogo chirurgico prossimale al ginocchio poco prima dell'inaugurazione. Applicare il lubrificante di occhio.</li>
	<li>Radere la funzione mediale della dell'arto destro del mouse per esporre l'area chirurgica e disinfettare con iodio + 70% alcool pelle scrub più di 3 cicli alternati. Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura. Per limitare la contaminazione; utilizzare strumenti sterilizzati in autoclave e guanti; completare la chirurgia sotto un microscopio per dissezione (opzionale); e utilizzare un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Nota: Se il protocollo viene eseguito su parabionts, solo 1 mouse è fratturato nella coppia (la tibia di destra del mouse destro). Vedere Figura 1B per un diagramma schematico della frattura su parabionts.</li>
	<li>Utilizzare una forbice per fare un'incisione della pelle lungo la faccia mediale dell'arto posteriore destro ginocchio in giù midshaft della tibia prossimale sul destro del mouse.</li>
	<li>Esporre midshaft della tibia e localizzare visivamente la diafisi. Flettere il ginocchio e visualizzare il tibiale utilizzando il legamento della patella-femorale come punto di riferimento.</li>
	<li>Visualizzare il tendine rotuleo; trapano manuale facendo rotolare il pollice e l'indice un buco di 0,5 mm nel canale intramidollare usando un ago di calibro 25. Nota: Il foro verrà eseguito parallelo lungo la tibia, in attraverso il plateau tibiale.</li>
	<li>Inserire un pin di 0,38 mm in acciaio inossidabile attraverso il foro di circa 15 mm nella cavità midollare fino a resistenza è feltro, tagliato a filo con il plateau tibiale utilizzando una fresa a filo (Vedi supplementare Video 1 per una ricostruzione in 3D).</li>
	<li>Utilizzando Forbici rette di Bonn, frattura midshaft tibia (diafisi). Vedere Figura 1 per un diagramma schematico della frattura.</li>
	<li>Osservare visivamente il sito di frattura e tessuti adiacenti di ispezionare per la stabilizzazione della vista frattura.</li>
	<li>Chiudere con le graffette cutanee.</li>
	<li>Posizionare i topi su riscaldata pastiglie per recuperare prima di restituirli a una gabbia casa pulita. Iniettare 1 mL preriscaldata (37 ° C) soluzione salina normale per via sottocutanea in ogni mouse per sostituzione del fluido.</li>
	<li>Controllare topi al giorno per segni di zoppia, infezione o sanguinamento. Nota: Se utilizzando buprenorfina regolare (cioè non SR/lento rilascio) quindi amministrare 0,1 mg/kg per via sottocutanea in 1 mL di salino al giorno per 3 giorni.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+cognitive+decline+in+the+aging+population.">Perioperative cognitive decline in the aging population.</a> Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).</li><li>Lord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+immune+response+to+trauma:+an+overview+of+pathophysiology+and+treatment.">The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment.</a> Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).</li><li>Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+healing+of+open+tibial+fractures+covered+with+either+muscle+or+fasciocutaneous+tissue+in+a+murine+model.">Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model.</a> J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).</li><li>Hirsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+cerebrospinal+fluid+and+plasma+inflammatory+markers+after+orthopedic+surgery.">Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).</li><li>Neerland, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+Between+Delirium+and+Preoperative+Cerebrospinal+Fluid+C-Reactive+Protein,+Interleukin-6,+and+Interleukin-6+Receptor+in+Individuals+with+Acute+Hip+Fracture.">Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture.</a> J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).</li><li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspirin-triggered+resolvin+D1+prevents+surgery-induced+cognitive+decline.">Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline.</a> FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).</li><li>Baht, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+youthful+circulaton+rejuvenates+bone+repair+through+modulation+of+beta-catenin.">Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin.</a> Nat Commun. 6, 7131 (2015).</li><li>Brack, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Wnt+signaling+during+aging+alters+muscle+stem+cell+fate+and+increases+fibrosis.">Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis.</a> Science. 317 (5839), 807-810 (2007).</li><li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ageing+systemic+milieu+negatively+regulates+neurogenesis+and+cognitive+function.">The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function.</a> Nature. 477 (7362), 90 (2011).</li><li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+postoperative+neuroinflammation+and+cognitive+decline.">Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline.</a> Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).</li><li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+the+alpha7+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Protects+against+Neuroinflammation+after+Tibia+Fracture+and+Endotoxemia+in+Mice.">Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice.</a> Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).</li><li>Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mobility+group+box+1+protein+initiates+postoperative+cognitive+decline+by+engaging+bone+marrow-derived+macrophages.">High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages.</a> Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mitochondrial+DAMPs+cause+inflammatory+responses+to+injury.">Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury.</a> Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).</li><li>Degos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+bone+marrow-derived+macrophages+perturbs+the+innate+immune+response+to+surgery+and+reduces+postoperative+memory+dysfunction.">Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction.</a> Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).</li><li>Zhang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthopedic+surgery+modulates+neuropeptides+and+BDNF+expression+at+the+spinal+and+hippocampal+levels.">Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+contributes+to+postoperative+cognitive+dysfunction+in+mice+undergoing+tibial+fracture+surgery+by+activating+the+TLR4/MyD88+pathway.">S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway.</a> Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+postoperative+hippocampal+inflammation+and+cognitive+decline+in+mice.">Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice.</a> JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).</li><li>Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+fear+conditioning+in+mice.">Trace fear conditioning in mice.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Ning, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgicallyinduced+mouse+models+in+the+study+of+bone+regeneration:+Current+models+and+future+directions+(Review).">Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review).</a> Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).</li><li>Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+the+diamond+concept.">Fracture healing: the diamond concept.</a> Injury. 38, S3-S6 (2007).</li><li>Zwingenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+femoral+critical-size+bone+defect+model+in+immunodeficient+mice.">Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice.</a> J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).</li><li>Yang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+prosthesis+failure+for+the+long-term+study+of+aseptic+loosening.">Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening.</a> J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+osteoprotegerin+gene+modification+on+wear+debris-induced+osteolysis+in+a+murine+model+of+knee+prosthesis+failure.">The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure.</a> Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).</li><li>AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+American+Geriatrics+Society/National+Institute+on+Aging+Bedside-to-Bench+Conference:+Research+Agenda+on+Delirium+in+Older+Adults.">The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults.</a> J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deferoxamine+regulates+neuroinflammation+and+iron+homeostasis+in+a+mouse+model+of+postoperative+cognitive+dysfunction.">Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).</li><li>Tang, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+plasma+proteins+revitalize+hippocampal+function+in+aged+mice.">Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice.</a> Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le fratture sono un problema clinico comune e rimangono delle cause principali di morbilità, specialmente nella popolazione senior in rapida crescita. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per un modello murino di frattura tibia per studiare i meccanismi responsabili di neuroinflammation postoperatoria e danno conoscitivo. Questo modello può essere combinato con chirurgia di Parabiosi per studiare interazioni neuro-immunitario, rigenerazione dei tessuti e altri processi di segnalazione. Capire questi meccanismi fornirà gli obiettivi strategici per ridurre al minimo i rischi di complicanze postoperatorie e ottimizzare i risultati.
Diversi modelli ortopedici sono stati sviluppati per studiare la riparazione ossea in roditori25. Abbiamo adottato e modificato questa procedura di frattura tibiale, originariamente descritta da Harry et al. 8, per studiare gli effetti della chirurgia ortopedica sulla funzione del cervello. Abbiamo anche usato questo modello di frattura in combinazione con il nostro modello di Parabiosi per studiare i fattori che sono responsabili di guarigione ossea e la rigenerazione tissutale di età-dipendente. Quando eseguito in anestesia generale volatile, questa procedura di frattura tibiale richiede solo circa 15 min per animale, risultati in zero alla minima mortalità (a seconda dell'età del mouse e della suscettibilità genetica sottostante) e ricapitola comune insulti associati con la frattura di ossa lunghe e trauma chirurgico ortopedico. Così, questo modello è ideale per interrogare le vie biologiche ed eseguendo valutazioni longitudinali. Tuttavia, è fondamentale che l'osteotomia e pinning sono riproducibili, e che il danno al tessuto molle è coerenza. Danni ai tessuti molli possono essere modulato, ad esempio da stripping il periostio e pizzicando i muscoli circostanti per rendere l'operazione più traumatica. Modelli di frattura traumatica indotta da trauma smussato non fissa o flessione su tre punti non fornirebbe tale coerenza o la precisione. Queste procedure sono spesso sfociano in re-ferita, che conduce alla risposta infiammatoria prolungata. Al contrario, i modelli di frattura che coinvolgono la fissazione rigida hanno un'infiammazione più moderata, che non completamente ricapitolare il danno connesso con ambulatorio ortopedico26,27.
Altri modelli che utilizzano il blocco di lega di titanio sono stati sviluppati per arthroplasty umana strettamente mimica e potrebbero essere più pertinenti per interrogare l'instabilità della protesi, osteolisi e complicazioni protesi-collegate in topi28,29 . Modelli di foro come quello presentato qui, fornire adeguata stabilizzazione, e topi possono essere testati in paradigmi comportamentali senza deficit significativi che potrebbero confondere tali attività come paura condizionata o aperto campo locomozione/ansia test6 ,7,11,15,19,20. Tuttavia, le deformità di rotazione possono verificarsi se la fissazione non è bloccata correttamente. Alcuni modelli utilizzano un fixator esterno, che fornisce la stabilizzazione superiore ma è difficile da implementare in una tibia di mouse, anche se può essere implementato con successo in un mouse femore27.
Disturbi cognitivi, tra cui delirio e disfunzione cognitiva postoperatoria, sono complicazioni comuni dopo chirurgia ortopedica per la riparazione di frattura, specialmente in pazienti anziani e fragili30. Questo modello di mouse clinicamente rilevanti della chirurgia per frattura tibiale dimostra che postoperatorio sistemica citochina rilascio6,7,17, alterata funzione barriera emato - encefalica15,19 e alterata morfologia microglial16,22, contribuiscono al danno di memoria e può rappresentare caratteristiche critiche delle complicazioni neurologiche postoperatorie vista in molti pazienti dopo chirurgia ortopedica. È importante notare che altre procedure chirurgiche sono state utilizzate per modellare la disfunzione cognitiva postoperatoria in topi. Questi includono addominale31,32,33 e chirurgia vascolare34 , come pure il trauma superficiale35,36. La tecnica di Parabiosi è applicabile a tutti questi modelli, che condividono i punti finali simili, tra cui l'infiammazione, l'attivazione gliale e deficit comportamentali, che può essere mediato da meccanismi comuni.
Gli studi che includono Parabiosi hanno rivelato nuovi ruoli per fattori circolanti che possono influire sulla funzione conoscitiva, neuroinflammation e ringiovanimento del tessuto in animali invecchiati37,38,39,40 ,41,42. Abbiamo dimostrato che Parabiosi possono essere combinati con successo con il modello di frattura tibiale descritto qui per interrogare percorsi rigenerativi e lo studio dei meccanismi che coinvolgono fattori ematica che influenza la guarigione e la frattura di riparazione12. Qui, abbiamo dimostrato che la capacità di riparazione di frattura di un animale invecchiato può essere ringiovanita quando l'animale invecchiato è anastomizzato ad un animale giovane. Questa inversione di età era radicata nell'attecchimento delle cellule ematopoietiche al luogo di frattura. È interessante notare che, tali ringiovanimento potrebbe essere ottenuta anche attraverso il trapianto di midollo osseo giovane in topi invecchiati. A questo proposito, trapianto di midollo osseo può essere considerato un approccio più diretto e semplice alternativo di Parabiosi. Tuttavia, Parabiosi sono un modello più robusto per indagare la funzione di linfociti circolanti e fattori. Ci aspettiamo che una combinazione di modelli di chirurgia ortopedica e Parabiosi giocherà un ruolo importante nel rispondere a domande critiche nel perioperatorio e biologia di invecchiamento.
In sintesi, vi presentiamo un protocollo dettagliato per un modello murino di frattura tibia per studiare i meccanismi responsabili di neuroinflammation postoperatorio ed il danno conoscitivo dopo le procedure chirurgiche ortopediche. Questo modello può essere combinato con una procedura di Parabiosi per studiare interazioni neuro-immunitario, rigenerazione tissutale e altre vie. Definizione di questi meccanismi fornirà gli obiettivi strategici per ridurre al minimo i rischi di complicanze postoperatorie e ottimizzare i risultati.

Chirurgia ha trasformato il sistema medico sanitario e continuamente sta contribuendo alla tecnologia d'avanguardia, sicurezza migliorata e mantenuto la qualità della vita. Purtroppo, chirurgia inoltre induce risposte patofisiologiche che possono portare a complicazioni postoperatorie compreso le infezioni della ferita, i danni neurologici e perfino la mortalità, specialmente in pazienti anziani1,2. Chirurgia ortopedica viene eseguita regolarmente, soprattutto in adulti più anziani, per migliorare la qualità della vita e riparare lesioni ossee comuni. Tuttavia, fino al 50% dei pazienti di chirurgia ortopedica che sono 65 anni e più vecchi esperienza menomazioni neurologiche quali delirio postoperatorio. Questo costantemente correla con la prognosi difficile, cioè, 5 volte aumento del rischio per la mortalità a 6 mesi, persistente declino funzionale, aumentato volta al paziente, una maggiore durata della degenza e tassi più alti di disposizione della casa di professione d'infermiera di professione d'infermiera 3 , 4 , 5. alcuni fattori di rischio, compreso l'età avanzata, sono state identificate, ma piccolo è conosciuto circa i meccanismi responsabili per i danni neurologici dopo la chirurgia.
Poiché le fratture sono molto comuni negli anziani, abbiamo stabilito un modello murino di frattura tibia per determinare l'impatto del trauma periferico il recupero postoperatorio, compreso neuroinflammation e cervello salute (funzione cognitiva)6, 7. questo modello, originariamente descritto da Harry et al. 8, composto da appuntare intramidollare e frattura tibia sotto anestesia e analgesia e quindi imita la pelle ferita, trauma muscolare, e osso riparazione associata a fratture di ossa lunghe comuni e riparare in esseri umani. Dopo questa procedura, topi dimostrano cambiamenti in indicatori infiammatori simili a cambiamenti osservati in esseri umani9,10, come pure l'attivazione microglial nell'ippocampo, che è associato con i deficit nella memoria dichiarativa e neuroplasticità hippocampal6,7,11. In precedenza abbiamo combinato questo modello di frattura con Parabiosi. Parabiosi sono un modello chirurgico in cui 2 topi sono anastomosed e quindi condividono un sistema circolatorio. Questo modello ha fornito un importante passo avanti nella comprensione di effetti regolatori di linfociti circolanti e fattori umorali sulla funzione dell'organo nel contesto dell'età e la malattia12,13,14. Utilizzando questo approccio abbiamo recentemente scoperto fattori sistemici associati con età-dipendente frattura guarigione12.
Qui, presentiamo un protocollo che unisce il modello di frattura tibiale con Parabiosi per lo studio dei meccanismi di età-dipendente dell'osso--cervello, che sono rilevanti per Neuroimmunologia e medicina rigenerativa. 1A di protocollo descrive la procedura di Parabiosi e dettagli del protocollo 1B la procedura di frattura tibiale (Figura 1A). Questi possono essere eseguiti in modo indipendente o in combinazione, a seconda della natura dell'interrogatorio.

<table width="1234">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:272px;">Piramal Healthcare</td>
			<td style="width:175px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td style="width:577px;">Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 12496- 6757-1</td>
			<td>Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">10% povidone Iodine</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>For antiseptic treatment of skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">SomnoSuite</td>
			<td style="width:272px;">Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Low Flow&#160; Anesthesia system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MouseSTAT</td>
			<td style="width:272px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:175px;">PS1161</td>
			<td>Pulse Oximeter &#38; Heart Rate Monitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Shaver</td>
			<td style="width:272px;">Wahl</td>
			<td style="width:175px;">9854L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:272px;">Leica</td>
			<td style="width:175px;">MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Blades - #11</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adson Forceps</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Needed for stripping the periosteum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Forceps</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:175px;">11066-07</td>
			<td>Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Bonn Scissors (Straight)</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:175px;">14084-08</td>
			<td>Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:175px;">14058-09</td>
			<td>Sharp scissors for cutting sutures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22G x 3.5 In Quincke&#160; Spinal Needle</td>
			<td style="width:272px;">BD</td>
			<td style="width:175px;">405181</td>
			<td>Use inner rod for pinning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle Holders</td>
			<td style="width:272px;">Fine science tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">Suture</td>
			<td style="width:272px;">Look</td>
			<td style="width:175px;">1079B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:211px;height:21px;">C57BL6/J</td>
			<td style="width:272px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:175px;">&#160;stock no. 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:211px;height:63px;">eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously)</td>
			<td style="width:272px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:175px;">&#160;stock no. 003291</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of orthopedic surgery to study postoperative cognitive dysfunction and tissue regeneration

Chirurgia è usato comunemente per migliorare e mantenere la qualità della vita. Purtroppo, in pazienti vulnerabili come gli anziani, le complicazioni possono verificarsi e diminuire significativamente l'esito. Infatti, dopo intervento chirurgico ortopedico di routine per riparare una frattura, oltre il 50% dei pazienti anziani soffrono le complicazioni neurologiche come delirio. Inoltre, la capacità di guarire e rigenerare il tessuto dopo chirurgia diminuisce con l'età e possa influire sulla qualità della riparazione di frattura e anche osseous integrazione degli impianti. Così, una migliore comprensione dei meccanismi che guidano questi cambiamenti età-dipendenti potrebbe fornire obiettivi strategici per ridurre al minimo il rischio di tali complicanze e ottimizzare i risultati. Qui, presentiamo un modello murino clinicamente rilevanti di frattura tibia. I cambiamenti postoperatori in questi topi imitano alcuni dei danni conoscitivi osservati comunemente dopo intervento chirurgico ortopedico di routine in esseri umani. Brevemente, viene eseguita un'incisione nella destra dell'arto in condizioni strettamente asettiche. I muscoli sono dissociati, e un perno di 0,38 mm in acciaio inossidabile è inserito nella cresta superiore della tibia, all'interno del canale intramidollare. Osteotomia viene quindi eseguita, e la ferita viene cucita con punti metallici. Abbiamo utilizzato questo modello per studiare gli effetti del trauma chirurgico postoperatorio neuroinflammation e cambiamenti comportamentali. Applicando questo modello di frattura in combinazione con Parabiosi, un modello chirurgico in cui sono anastomosed 2 topi, abbiamo studiato le cellule e fattori secreti sistemica ringiovanire la rigenerazione di tessuto e la funzione dell'organo dopo la lesione. Seguendo il nostro protocollo di passo-passo, questi modelli possono essere riprodotti con la massima fedeltà e possono essere adattati per interrogare molte vie biologiche che sono alterate tramite il trauma chirurgico.

Dopo osteotomie trasversale con attenzione sono state effettuate in condizioni di sterilità con costante inserimento del PIN e sutura corretta, topi non ha mostrato segni di zoppia, infezione o sanguinamento nel piedino di sinistra dopo la chirurgia. Guarigione ortopedico è stata valutata usando l'analisi radiografica e istomorfometria dopo Safranina O macchiatura (Figura 2). Le radiografie della tibia fratturata del midshaft indicato più deposito tissutale nei calli di frattura di giovani topi rispetto ai calli di frattura dei topi invecchiati. Calli di frattura erano decalcificati e inclusi in paraffina in preparazione per l'analisi istologica. Le sezioni sono state macchiate con safranina-O e deposizione di tessuto è stato quantificato utilizzando istomorfometria analisi. Calli di frattura di giovani topi contenevano più osso e meno fibrotica tessuto rispetto i calli di frattura da topi invecchiati.
Frattura tibia induce l'infiammazione sistemica ed centrale6,7,11,15,16. Infatti, i livelli periferici di citochine pro-infiammatorie e pattern molecolari associati pericolo (Damp) sono rapidamente elevati dopo chirurgia ortopedica, sia nei topi e nell'uomo7,17,18. Questo contribuisce all'attivazione della microglia nel cervello tramite diversi meccanismi di segnalazione che coinvolge le vie neuronali, cellulari ed umorali7,15,19,20, 21. A seguito di chirurgia, disfunzione endoteliale, apertura della barriera emato - encefalica e periferico del macrofago infiltrazione contribuiscono a hippocampal acuta neuroinflammation in tipi selvatici e Ccr2RFP / + Cx3cr1GFP / + topi adulti15 , 19e sono stati associati con i deficit di memoria successiva che assomigliano a delirio umano e disfunzione cognitiva postoperatoria15,19,22. Questa risposta neuroinfiammatorie è aggravata in animali invecchiati, con significativi cambiamenti nella morfologia microglial, come rilevato da IBA-1 immunostaining (Figura 3).
Utilizzando il modello di frattura tibiale descritto qui, abbiamo trovato anche transitoriamente neurogenesi ippocampale, come evidenziato da una riduzione nel doublecortin (DCX) immunostaining nella circonvoluzione dentata20. Misure Electrophysiologic di potenziamento a lungo termine (LTP), un surrogato per la funzione di memoria, ha rivelato una rottura di tempo-dipendente nella neuroplasticità postoperatorio11. Topi dopo l'intervento chirurgico anche visualizzare i danni nella funzione di memoria hippocampal-dipendente, ad esempio usando la paura condizionata test psicometrico (Figura 4). Nel condizionamento alla paura, i topi sono messo in una camera ed esposti a un segnale uditivo seguito da uno stimolo avversivo (cioè, footshock). Tre giorni dopo l'intervento chirurgico tibial, topi sono testati nella camera condizionata, questa volta senza alcuna stimolazione uditiva o avversione, e comportamento di congelamento viene registrata come un indice di memoria (per un protocollo dettagliato Vedi23).
Età avanzata è un fattore di rischio per il declino di memoria. Eppure, mentre invecchiamo, la capacità di rigenerazione e riparazione dei tessuti diminuisce anche anche se questi meccanismi rimangono poco compresi. Così, abbiamo usato i protocolli descritti nel presente documento per eseguire eterocronico parabiosi (accoppiamento animali giovane/vecchio) e valutate la frattura che guarisce entro il mouse invecchiato (per un protocollo dettagliato Parabiosi Vedi24). Sangue-condivisione tra coppie di parabiotiche è stata confermata e trovata per essere uguale12. L'esposizione a una riparazione ossea giovanile circolazione migliorata con precedente Unione, deposizione ossea è aumentato e diminuito fibrosi (Figura 5)12. Questo ringiovanimento della rigenerazione ossea si è verificato indipendente dell'osteoblasto osteocalcin-positivi endogena (Figura 5, marrone cellule), ma piuttosto invocata cellule CD45-positive che migrati dal giovane parabiont (Figura 5, blu cellule) . Questi risultati indicano che le cellule emopoietiche CD45-positive secernono una nicchia giovane e sana, che è in grado di segnalare alle cellule osteoblastiche invecchiate inducendoli a diventare più attivi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del Parabiosi e chirurgia per frattura tibiale. Timeline (A) per l'esecuzione di Parabiosi e frattura tibia (protocollo 1A) o frattura tibia da sola (protocollo 1B). (B) le tibie dei topi di 20 mesi in coppia parabiotiche isocroniche o eterocronico sono state fratturate (è fratturata la gamba destra di destro del mouse, come indicato con una X). Topi grigi raffigurano topi selvatici mentre green mouse raffigurano eGFP topi. (C) diagramma schematico del modello di frattura tibiale con appuntare intramidollare e metà di-pozzo fratturazione. Veda inoltre complementari Video 1 per una ricostruzione 3D dell'arto posteriore e pinning della tibia. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2.jpg"> Figura 2: frattura tibia guarigione all'interno di modelli murini di giovani e meno giovani. Tibie di topi giovani o vecchi sono state fratturate e calli di frattura sono state indagate 21 giorni post infortunio. (A) formazione immagine radiografica e colorazione istologica (Safranina-O) sono stati usati per valutare la frattura calli 21 giorni post frattura. La macchiatura Mostra tessuti collageni in proteoglicani (contenuti all'interno della cartilagine) in rosso e blu. Le linee tratteggiate indicano la posizione approssimativa del callo di frattura. (B) istomorfometria è stato usato per valutare la quantità di osso, cartilagine e tessuto fibrotico depositato entro la frattura callo 21 giorni post frattura. I dati sono espressi come media ± gli intervalli di confidenza di 95%, * P < 0,05, statisticamente significativa (One-way ANOVA, test di Dunnett), barre della scala rappresentano 2 mm, e immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio, un obiettivo x 1,25. n = 9 per ogni campione. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig3.jpg"> Figura 3: chirurgia ha indotto l'attivazione microglial età-dipendenti nell'ippocampo. Chirurgia per frattura tibiale induce maggiore hippocampal neuroinflammation in topi invecchiati (20 mesi) rispetto ai topi C57BL6/J 4-mese-vecchio. Sezione del cervello-macchiatura con indicatore microglial IBA-1 Mostra più positivo cellule e cambiamenti morfologici in chirurgica gruppi 24 h dopo la chirurgia. Immagini sono state ottenute con un microscopio epifluorescente con un ingrandimento di 100 x.; barra della scala rappresenta 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig4.jpg"> Figura 4: ridotta neurogenesi, potenziamento a lungo termine e funzione di memoria dopo chirurgia per frattura tibiale. (A) DCX, un indicatore quantitativo per la neurogenesi, è ridotto significativamente nella circonvoluzione dentata ippocampo a 24 h dopo la chirurgia. Immagini sono state ottenute con un obiettivo del microscopio confocale laser-scanner con un ingrandimento di 10x; scala bar rappresenta 10 µm. (B) elettrofisiologia nelle fette hippocampal da controlli o topi 24 h dopo la chirurgia. Long-term potentiation (LTP) è stata indotta dalla stimolazione ad alta frequenza (HFS) e registrato oltre 1 h. potenziali postsinaptici eccitatori di campo (EPSPS) sono stati registrati dal CA1 strato radiato per mezzo di una pipetta di registrazione extracellulare riempita con regolare liquido cerebrospinale artificiale. A 24 h dopo la chirurgia, induzione di LTP è notevolmente ridotto rispetto ai topi di controllo. I dati sono espressi come media ± s.e.m. n = 3, * p < 0,05 1-way ANOVA. (C) Dell'Ippocampo-dipendente dalla funzione di memoria (definito come % di congelamento utilizzando traccia paura condizionata) è alterata in topi dopo chirurgia rispetto ai controlli e animali esposti all'anestesia solo. I dati sono espressi come media ± s.e.m. n = 9-10, * p < 0,05 1-way ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig5.jpg"> Figura 5: chirurgia di Parabiosi conduce al ringiovanimento del engraftment di guarigione, la condivisione di sangue e la cellula donatrice di frattura. Abbinamenti di Parabiosi isocrono ed eterocronico sono stati stabiliti e il mouse invecchiato in ciascuna coppia è stato fratturato e valutato per la guarigione dell'osso. (A) frattura calli sono stati studiati usando la formazione immagine radiografica. Le linee tratteggiate indicano la posizione approssimativa del callo di frattura. (B) Engraftment delle cellule di eGFP + è stato confermato all'interno del midollo osseo. (C) Immunohistochemistry del callo di frattura è stato usato per identificare le cellule erogarici eGFP+ (blue) e cellule osteoblastiche osteocalcin+ (marrone) dalla parabiont. Barre della scala rappresentano 50 µm e immagini sono state ottenute utilizzando un obiettivo 40x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video supplementari 1: ricostruzione 3D dell'arto e pinning della tibia. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/parte_slow.wmv">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Questo protocollo descrive un modello murino di chirurgia ortopedica che è stato usato per lo studio dei meccanismi di neuroinflammation postoperatoria e cambiamenti comportamentali e quando combinato con Parabiosi, per studiare la rigenerazione dei tessuti durante l'invecchiamento.

Un modello murino di chirurgia ortopedica per studiare la disfunzione cognitiva postoperatoria e rigenerazione tissutale

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

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JoVE Journal

Medicine

16.2K Views.  Duke University Medical Center. Questo protocollo descrive un modello murino di chirurgia ortopedica che è stato usato per lo studio dei meccanismi di neuroinflammation postoperatoria e cambiamenti comportamentali e quando combinato con Parabiosi, per studiare la rigenerazione dei tessuti durante l'invecchiamento.

Video: A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Pseudofracture: An Acute Peripheral Tissue Trauma Model

Following trauma there is an early hyper-reactive inflammatory response that can lead to multiple organ dysfunction and high mortality in trauma patients; this response is often accompanied by a delayed immunosuppression that adds the clinical complications of infection and can also increase mortality.1-9 Many studies have begun to assess these changes in the reactivity of the immune system following trauma.10-15 
Immunologic studies are greatly supported through the wide variety of transgenic and knockout mice available for in vivo modeling; these strains aid in detailed investigations to assess the molecular pathways involved in the immunologic responses.16-21
The challenge in experimental murine trauma modeling is long term investigation, as fracture fixation techniques in mice, can be complex and not easily reproducible.22-30
This pseudofracture model, an easily reproduced trauma model, overcomes these difficulties by immunologically mimicking an extremity fracture environment, while allowing freedom of movement in the animals and long term survival without the continual, prolonged use of anaesthesia. The intent is to recreate the features of long bone fracture; injured muscle and soft tissue are exposed to damaged bone and bone marrow without breaking the native bone.
The pseudofracture model consists of two parts: a bilateral muscle crush injury to the hindlimbs, followed by injection of a bone solution into these injured muscles. The bone solution is prepared by harvesting the long bones from both hindlimbs of an age- and weight-matched syngeneic donor. These bones are then crushed and resuspended in phosphate buffered saline to create the bone solution.
Bilateral femur fracture is a commonly used and well-established model of extremity trauma, and was the comparative model during the development of the pseudofracture model. Among the variety of available fracture models, we chose to use a closed method of fracture with soft tissue injury as our comparison to the pseudofracture, as we wanted a sterile yet proportionally severe peripheral tissue trauma model. 31
Hemorrhagic shock is a common finding in the setting of severe trauma, and the global hypoperfusion adds a very relevant element to a trauma model. 32-36 The pseudofracture model can be easily combined with a hemorrhagic shock model for a multiple trauma model of high severity. 37

Pseudofracture, a reproducible murine model of sterile musculoskeletal trauma, allows for evaluation of late term post-traumatic immune responses. This article describes the procedural execution of the model step by step, including the potential for experimental model combinations to permit study of multiple trauma.

Pseudofracture: Una periferica acuta Modello Trauma Tissue

Following trauma there is an early hyper-reactive inflammatory response that can lead to multiple organ dysfunction and high mortality in trauma patients; ...

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Medicina

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Un tumore modello murino di stress chirurgico per esplorare i meccanismi di immunosoppressione post-operatorio e valutare Novel perioperatoria Immunoterapie

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

Il trapianto di valvola polmonare Utilizzando un modello murino di trapianto cardiaco eterotopico

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are still occurring, particularly in reconstructive flap surgery. Multiple experimental flap models have been developed to analyze underlying causes and mechanisms and to investigate treatment strategies to prevent ischemic complications. The limiting factor of most models is the lacking possibility to directly and repetitively visualize microvascular architecture and hemodynamics. The goal of the protocol was to present a well-established mouse model affiliating these before mentioned lacking elements. Harder et al. have developed a model of a musculocutaneous flap with a random perfusion pattern that undergoes acute persistent ischemia and results in ~50% necrosis after 10 days if kept untreated. With the aid of intravital epi-fluorescence microscopy, this chamber model allows repetitive visualization of morphology and hemodynamics in different regions of interest over time. Associated processes such as apoptosis, inflammation, microvascular leakage and angiogenesis can be investigated and correlated to immunohistochemical and molecular protein assays. To date, the model has proven feasibility and reproducibility in several published experimental studies investigating the effect of pre-, peri- and postconditioning of ischemically challenged tissue.

The window of the murine dorsal skinfold chamber presented visualizes a zone of acute persistent ischemia of a musculocutaneous flap. Intravital epi-fluorescence microscopy permits for direct and repetitive assessment of the microvasculature and quantification of hemodynamics. Morphologic and hemodynamic results can further be correlated with histological and molecular analyses.

Ischemica lesioni dei tessuti nel Skinfold Camera del mouse Dorsale: un modello lembo cutaneo per Indagare Ischemia acuta persistente

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Modello apicale resezione mouse per primo studio Mammalian rigenerazione cardiaca

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

An Anatomical Study of Nerves at Risk During Minimally Invasive Hallux Valgus Surgery

The growing popularity of minimally invasive surgical (MIS) procedures makes it necessary that new anatomical references arise, to aid in tridimensional orientation and localization of structures that are not directly visible to the surgeon. This is especially critical for structures at risk like nerves or blood vessels. Optimization of the handling of cadaveric material and the combination of multiple techniques compensate for the limited availability of adequate specimens. The described protocol combines anatomical plane-by-plane dissection and sectional anatomy of fresh-frozen specimens to help localize relevant structures, such as nerves, arteries, veins and to correctly position the portals during MIS procedures. Depiction of these structures in anatomy textbooks can differ from what is encountered in the surgical field; and for this reason, new anatomical studies with a surgical orientation are needed. However, this is a complex, time-consuming technique requiring specific training. The anatomical references described with the so-called 'clock method' provide the surgeon with an easy and reproducible system to locate the path of the nerves at risk in Hallux Valgus MIS procedures. This model can be extrapolated to many other minimally invasive surgical procedures.

Minimally invasive surgical (MIS) procedures rely on anatomical references to localize structures not directly visible to the surgeon. This manuscript describes a combined method of plane-by-plane dissection and sectional anatomy of fresh-frozen specimens to locate the structures at risk during MIS procedures.

Uno studio anatomico dei nervi a rischio durante mininvasiva alluce valgo chirurgia

The growing popularity of minimally invasive surgical (MIS) procedures makes it necessary that new anatomical references arise, to aid in tridimensional ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...